不同強度啟動子ACC脫氨酶工程菌株的構(gòu)建及功能研究

仲 惟，李 濤 ，劉文亮，趙 君，陳 瑋

（1. 河南科技大學(xué)應(yīng)用工程學(xué)院，河南 三門峽 472000；2. 哈密市疾病預(yù)防控制中心，新疆 哈密 839000）

0 引言

【研究意義】植物根際促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指能夠自主定殖于植物根際，通過產(chǎn)生某些特殊代謝物質(zhì)可促進植物種子萌發(fā)、植株生長并提高其對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，同時可抑制有害病原菌繁殖的有益微生物群落[1]。大量研究表明，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用PGPR菌肥，可有效減少化肥及農(nóng)藥的施用量各30%以上，對農(nóng)作物增產(chǎn)效果亦十分顯著，甚至高達80%，因此在當前發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)、減肥增效上應(yīng)用前景十分廣闊[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】然而PGPR菌劑在大田應(yīng)用場景中的施用效果并不穩(wěn)定，會受到地塊位置、土壤營養(yǎng)狀況、種植年份、種植氣候及植株品系等因素的影響，如何使得在實驗室有良好促生效果的PGPR菌劑能夠在大田表現(xiàn)優(yōu)良，需要探討影響PGPR菌劑在植物根際定殖并良好穩(wěn)定傳代存活的機理[4]。有研究表明，PGPR在植物根際的定殖數(shù)量與其對植株的促生效果呈顯著正相關(guān)[5]，且PGPR在植物根際定殖行為與其對植物根系分泌物的趨化作用有關(guān)[6]，將其與趨化相關(guān)的基因敲除后，PGPR在植物根際的定殖能力顯著下降[7]?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PGPR菌的典型代表Pseudomonas putidaUW4能夠趨化1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC），而敲除了其ACC脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase，AcdS）基因的UW4△AcdS和趨化蛋白（CheR）基因的UW4△cheR均喪失了對 ACC的趨化作用[8]，表明ACC是UW4的一種新的代謝依賴型趨化物。另外，AcdS活力高的菌株在根系定殖量也明顯較多[9]，基于此我們推測ACC脫氨酶的催化反應(yīng)速度可能影響PGPR菌株對ACC的趨化響應(yīng)強度，進而影響其定殖及促生效果。【擬解決的關(guān)鍵問題】選用典型的產(chǎn)AcdS的UW4及其AcdS基因敲除突變株UW4△AcdS，采用同源重組技術(shù)將其ACC脫氨酶啟動子進行替換，從而構(gòu)建一系列不同ACC脫氨酶活性菌株，以此探究ACC脫氨酶活性對PGPR趨化作用的影響，分析ACC趨化反應(yīng)強度與代謝速率之間的關(guān)系，從而為選育高效PGPR菌株、穩(wěn)定和提高PGPR的應(yīng)用效果提供理論支撐，切實為我國農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 菌劑、質(zhì)粒及其他

惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaUW4、UW4△AcdS為本實驗室保藏菌株，由加拿大滑鐵盧大學(xué)Glick教授饋贈；大腸桿菌E.coliDH5α購自TaKaRa公司；克隆用ZT4-Blunt質(zhì)粒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；pBBR1MCS-2表達質(zhì)粒購自上海澤葉生物科技有限公司；三菌雜交輔助質(zhì)粒pRK2013由廣西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈；硝酸纖維素薄膜購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 不同ACC脫氨酶活性菌株的構(gòu)建

1.2.1 分別構(gòu)建含4種啟動子的表達質(zhì)粒 參照文獻[10]中Braatsch20強啟動子、Braatsch10中等強度啟動子、Braatsch1弱啟動子及UW4菌Acds基因自身啟動子與目的Acds基因和終止子融合片段的序列分別進行引物設(shè)計、片段擴增及測序（表1）。將測序成功的4個片段Bra20A/ Bra10A/ Bra1A/PAA分別連接至pBBR1MCS-2質(zhì)粒的MCS區(qū)，構(gòu)建出含4種不同啟動子序列的表達質(zhì)粒。

表 1 含不同強度啟動子片段的引物設(shè)計Table 1 Primers with promoters of different strength

1.2.2 三菌雜交構(gòu)建目標菌株 采用三菌雜交接合轉(zhuǎn)移，先將4類含不同強度啟動子的pBBR1MCS-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a（供體菌），分別活化UW4△AcdS（受體菌）及含質(zhì)粒pRK2013的幫助菌（大腸桿菌HB101，Kana），以pBBR1MCS-2空載質(zhì)粒為陰性對照。分別挑取供體菌、UW4△AcdS及幫助菌單菌落添加對應(yīng)抗性，供體菌和幫助菌置于37 ℃，UW4△AcdS置于30 ℃過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至各菌液OD600nm≈1.0，按1∶100（V/V）分別接至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 h。培養(yǎng)結(jié)束后將供體菌、受體菌和幫助菌按2∶2∶1體積比進行混合，將混合菌液滴加在置于LB固體平板的硝酸纖維素膜上，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。吸取750 μL 0.85%的NaCl溶液將菌體從硝酸纖維素膜沖洗下來，超純水重懸菌液（可梯度稀釋）涂布于含抗性LB固體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)過夜，待菌落長出后進行轉(zhuǎn)化子鑒定。

1.2.3 菌株生長曲線及ACC脫氨酶活性測定 將惡臭假單胞菌UW4、UW4△AcdS及鑒定過的4種含不同啟動子序列的轉(zhuǎn)化株進行LB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，待長出單菌落后各自挑取一環(huán)接至液體LB培養(yǎng)基，30 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜后調(diào)節(jié)菌液OD600nm≈ 1.0，1∶100（V/V）轉(zhuǎn)接至新鮮液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r·min-1開始培養(yǎng)，每隔1 h測定菌液OD600nm直至平臺期，每個菌株平行測定3次。以菌液培養(yǎng)時間為橫坐標，所測OD值為縱坐標，繪制各菌株生長曲線。ACC脫氨酶活力測定采用Penrose等[11]的方法，于540 nm下測定AcdS催化ACC裂解生成的α-酮丁酸的含量。

1.2.4 菌株AcdS基因表達量測定 吸取1.2.3中過夜培養(yǎng)的各菌液接至新鮮液體LB中，30 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)至菌體OD600nm約0.5，各取6 mL，4 ℃，12 000 r·min-1，離心5 min后棄去上清，將菌體重懸轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中4 ℃離心1 min，液氮速凍后作為處理前樣品。將剩余菌液中添加3.0 mmol·L-1ACC 誘導(dǎo)培養(yǎng)45 min后按上述操作進行處理后樣品采集。提取各樣品RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，分別設(shè)計假單胞菌屬管家基因gyrB熒光定量PCR擴增F引 物：5′-CCTGTCGGAAGAGCTGGT-3′，R引物：5′-ACCGTGGACGTAAGTCTGTT-3′，AcdS片段熒光定量PCR擴增F引物：5′-ACTACATCGTGGT CTGCTCGGT-3′，R引物：5′-CA CATCCTCTTCAGT GATTTCG-3′。進行各菌株gyrB及AcdS基因的熒光定量PCR擴增，采用 2-ΔΔCt法進行各菌株AcdS基因表達量分析。

1.2.5 定性趨化試驗 采用改良的點滴趨化方法[12]，將構(gòu)建好的4種目標菌株與UW4、UW4△Acds分別進行活化培養(yǎng)，各吸取菌液10 mL，4 ℃，8 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用甘油鹽液體培養(yǎng)基洗菌2次后重懸至10 mL，吸取2.5 mL接至250 mL 甘油鹽液體 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)24 h（需 添 加ACC 3 mmol·L-1，UW4△AcdS培養(yǎng)瓶中以硫酸銨代替ACC）。吸取15 mL菌液4 ℃，8 000 r·min-1離心5 min后棄上清，吸取10 mL 經(jīng)4 ℃ 預(yù)冷的趨化緩沖液（CMB）洗菌3次后，將菌體重懸至OD600nm≈1.0。取2 μL 菌液滴加于10% 稀釋LB游動平板中央，每個平皿中倒入10% 稀釋LB培養(yǎng)基15 mL，在其中添加ACC 3 mmol·L-1。將此游動平板置于30 ℃培養(yǎng)24 h觀察各菌株的定性趨化。

1.2.6 盆栽小麥生物量及根際定殖菌數(shù)測定 將小麥種子消毒后浸泡于OD600nm=1的UW4、UW4△AcdS及4種目標菌株菌懸液中吸脹處理，無菌水做空白對照，之后培養(yǎng)箱中催芽，將一端露白的籽粒種植于育苗穴盤，初始培養(yǎng)前2 d分別以不同菌液澆灌小麥植株，待植株生長約15 d后，拔出植株抖落培養(yǎng)土剪取根莖進行生物量測定。另剪取根部組織研磨后將勻漿上清梯度稀釋后涂布于含Amp 抗性100μg·mL-1的LB固體平皿，以長出的菌落數(shù)計各菌株在小麥根際的定殖數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS Statistics 24.0中的Duncan檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標菌株的菌液PCR鑒定

挑取三菌雜交所得轉(zhuǎn)化子接至液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，分別進行菌液PCR鑒定（圖1），所得Bra20A、Bra10A、Bra1A目標片段約1 400 bp，PAA片段約1 800 bp，均符合預(yù)期大小，說明4種含不同啟動子序列的目標菌株UW4△AcdS+Bra20A、UW4△AcdS+Bra10A、UW4△AcdS+Bra1A、UW4△AcdS+PAA構(gòu)建成功。

圖 1 4種目標菌株菌液RCR凝膠電泳圖Fig. 1 Gel electrophoresis of 4 target strains

2.2 菌株生長曲線測定

由圖2可見，UW4、UW4△AcdS及4種含不同啟動子序列的目標菌株培養(yǎng)過程中生長速率基本一致，無顯著性差異。

圖 2 各菌株生長曲線對比Fig. 2 Growth of individual strains

2.3 菌株ACC脫氨酶活性對比

將UW4、UW4△AcdS、UW4△AcdS+Bra20A、UW4△AcdS+Bra10A、UW4△AcdS+Bra1A、UW4△AcdS+PAA菌株在含3 mmol·L-1ACC的液體LB培養(yǎng)基中過夜誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體破碎細胞進行酶活測定，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，除 UW4 和 UW4△AcdS+PAA以外，各菌株ACC脫氨酶活性差異均較大（P＜0.05），且酶活數(shù)值基本與啟動子序列強弱呈正比關(guān)系，因此推測各菌株對ACC的趨化為代謝依賴型。

圖 3 各菌株ACC脫氨酶活性對比Fig. 3 ACC deaminase activity of strains

2.4 菌株Acds基因表達量

通過實時熒光定量PCR測定各菌株在ACC誘導(dǎo)下的AcdS基因表達量，以未經(jīng)ACC誘導(dǎo)的野生株UW4的表達量作為對照，測得UW4、UW4△AcdS+Bra20A、UW4△AcdS+Bra10A、UW4△AcdS+Bra1A及UW4△AcdS+PAA菌株Acds基因表達量。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，UW4△AcdS+Bra20A的AcdS基因表達量最高，其次是UW4，UW4△AcdS+Bra10A、UW4△AcdS+PAA表達量較低且兩者無顯著性差異，UW4△AcdS+Bra1A表達量最低（P＜0.05），此結(jié)果與ACC脫氨酶活測定結(jié)果規(guī)律基本一致，說明AcdS基因表達量、ACC脫氨酶活與啟動子強弱之間呈現(xiàn)正相關(guān)，菌株的ACC脫氨酶活性越高，其對ACC代謝速率也越高。

圖 4 各菌株Acds基因表達量對比Fig. 4 Acds expressions of strains

2.5 菌株對ACC的定性趨化

采用稀釋LB半固體平板進行各菌株對ACC的定性趨化能力驗證，結(jié)果見圖5。敲除了ACC脫氨酶基因的UW4△AcdS喪失對ACC的趨化能力，含強啟動子序列的UW4△AcdS+Bra20A菌株形成的趨化圈直徑最大，UW4△AcdS+PAA和野生UW4形成趨化圈直徑較大且數(shù)值基本一致，UW4△AcdS+Bra10A形成趨化圈略小于上述兩個菌株，含弱啟動子序列的UW4△AcdS+Bra1A菌所形成趨化圈直徑最小，說明菌株對ACC代謝速率直接影響其ACC趨化能力的大小。

圖 5 各菌株對ACC的定性趨化Fig. 5 Qualitative chemotaxis on ACC of various strains

2.6 各菌株在小麥根際定殖數(shù)量

剪取各菌株處理過的盆栽小麥的根部組織研磨后將勻漿上清涂布LB固體平板，測得各菌株在小麥根際定殖數(shù)量，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，UW4△AcdS+Bra20A菌株定殖數(shù)量最多，UW4和UW4△AcdS+Bra10A定殖數(shù)量次之，此二者間無顯著性差異，UW4△AcdS+PAA菌株定殖數(shù)量一般，UW4△AcdS和UW4△AcdS +Bra1A菌株定殖數(shù)量較少，此二者亦無顯著性差異（P＜0.05）。

圖 6 各菌株在小麥根際定殖數(shù)量Fig. 6 Colonization number of strains in wheat rhizosphere

2.7 菌株對盆栽小麥生物量影響

各菌懸液進行小麥種子處理后進行盆栽試驗，待植株生長15 d后剪取其根部和莖部烘干后準確稱重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UW4△AcdS+Bra20A菌株處理后小麥莖干最重，其次是UW4、UW4△AcdS+Bra10A和UW4△AcdS+PAA菌株處理后的莖干重，三者間無顯著性差異；UW4△AcdS+Bra1A和UW4△AcdS菌株處理后的小麥莖干較輕，尤其UW4△AcdS菌株處理后莖干重量與對照差距不顯著（P＜0.05）（圖7-A）。UW4△AcdS+Bra20A、UW4△AcdS+Bra10A和UW4△AcdS+Bra1A菌株處理后的小麥根部重量均較重，三者差異不顯著；其次UW4和UW4△AcdS+PAA菌株處理后的小麥根部較重，二者無顯著性差異；UW4△AcdS菌株處理后的小麥根部重量最輕，與對照間無顯著性差異（P＜0.05）（圖7-B）。

圖 7 各菌株對小麥植株促生效果Fig. 7 Growth promoting effect of strains on wheat plant

綜上所述，菌株的AcdS基因表達量及ACC脫氨酶活性均與啟動子強弱呈現(xiàn)正相關(guān)；菌株對ACC代謝速率越高其趨化作用越強，對植株的促生效果也越好。

3 討論與結(jié)論

假單胞菌屬的趨化路徑與大腸桿菌有所不同，類似另一種類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）為代表的趨化信號通路，鞭毛除了細胞端部受體復(fù)合體的調(diào)控外，還要受到位于細胞質(zhì)的受體復(fù)合體的調(diào)控作用。目前對細胞質(zhì)受體復(fù)合體所結(jié)合配體分子了解甚少，但已有研究發(fā)現(xiàn)，細菌對某些氨基酸、糖類及三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物等許多代謝依賴性趨化物的趨化作用需要細胞質(zhì)受體的參與[13-14]。如惡臭假單胞菌F1的McpS蛋白可作為6種三羧酸（TCA）循環(huán)中間體和丁酸鹽的特異性趨化受體，且對蘋果酸、琥珀酸、延胡索酸、草酰乙酸有高的親和力，據(jù)此推測MCP對趨化物的親和力大小與趨化反應(yīng)強度有關(guān)[15]。另外三羧酸循環(huán)或β-酮己二酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物濃度的大小直接影響參與代謝依賴性趨化反應(yīng)的MCP蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白的表達[16]。這也表明某些物質(zhì)的趨化、轉(zhuǎn)運和代謝密切相關(guān)，因此代謝速度可能是影響趨化反應(yīng)強度的另一個因素。

本研究設(shè)計將4種不同強弱啟動子序列Bra20A/Bra10A/ Bra1A/PAA分別連至pBBR1MCS-2質(zhì)粒，構(gòu)建出含4種不同啟動子序列的表達質(zhì)粒。采用三親本接合轉(zhuǎn)移將表達質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌株UW4△AcdS，成功構(gòu)建出4種含不同強弱AcdS啟動子序列的目標菌株。研究中所采用的pBBR1MCS-2表達質(zhì)粒在單個菌株細胞中拷貝數(shù)約為5個，較高的拷貝數(shù)和表達強度可提高目標AcdS基因表達量及ACC脫氨酶活，但同時也為宿主菌引入較高代謝負荷[17]，如各轉(zhuǎn)化株在以ACC為氮源的甘油鹽培養(yǎng)基中生長緩慢。另外可能受mRNA壽命或蛋白折疊構(gòu)建系統(tǒng)影響，酶活力并未隨AcdS基因表達量增高呈現(xiàn)同等比例增加。

對各菌株生長曲線測定發(fā)現(xiàn)各菌株生長速率基本一致無顯著性差異。ACC脫氨酶活數(shù)值基本與啟動子序列強弱呈正相關(guān)。UW4△AcdS+Bra20A菌株Acds基因表達量最高，此結(jié)果與ACC脫氨酶活測定結(jié)果規(guī)律基本一致，說明AcdS基因表達量、ACC脫氨酶活與啟動子強弱之間呈現(xiàn)正相關(guān)，菌株的ACC脫氨酶活性越高，其對ACC代謝速率也越高。定性趨化結(jié)果顯示：UW4△AcdS喪失對ACC的趨化能力，含強啟動子序列的UW4△AcdS+Bra20A菌株形成的趨化圈直徑最大，說明菌株對ACC代謝速率直接影響其ACC趨化能力的大小。各菌株在小麥根際定殖數(shù)量及對小麥生物量影響結(jié)果顯示：UW4△AcdS+Bra20A菌株定殖數(shù)量最多，且處理后小麥莖干及根部重量均最重，UW4△AcdS+Bra1A和UW4△AcdS菌株處理后的小麥莖干較輕，UW4△AcdS菌株處理后的小麥根部重量最輕（P＜0.05），說明ACC確實為UW4向植物根際定殖的較強趨化物質(zhì)，是菌株生長的物質(zhì)來源，與植物間形成互利共贏的共生關(guān)系[8]，因此菌株對ACC的代謝速率越高其趨化作用亦越強，UW4的趨化作用越強其在根系定殖后對植株的促生效果越顯著。