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    甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Z21發(fā)酵條件優(yōu)化及抑菌活性分析

    2022-03-22 10:02:26江丹霞武少蘭楊國輝詹藝舒羅小芳周天峰劉培培楊成龍江玉姬
    福建農(nóng)業(yè)學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:粗提物發(fā)酵液抑制率

    江丹霞,武少蘭,楊國輝,詹藝舒,羅小芳,周天峰,劉培培,楊成龍 ,江玉姬,3

    (1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建 福州350001;3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心,福建 福州 350002)

    0 引言

    【研究意義】真菌污染是導(dǎo)致食品質(zhì)量安全問題和農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一,每年由真菌污染導(dǎo)致的食品腐敗占30%以上[1-2]。食品中常見污染真菌有木霉屬、青霉屬、鐮刀屬、曲霉屬等[3-4],它們具有數(shù)量多、分布廣、生長速度快、生長環(huán)境不苛刻等特點,產(chǎn)毒能力極強(qiáng)且難以降解[5-6],因此食品霉變不僅會造成營養(yǎng)損失、經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重威脅著人們的身體健康?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】食品防腐劑主要有化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑,由于合成的食品防腐劑安全性較低[7],所以天然食品防腐劑的開發(fā)成為研究的熱點。天然食品防腐劑近年來逐漸從植物源、動物源轉(zhuǎn)向微生物源,其中芽孢桿菌屬細(xì)菌具有安全性高、易于規(guī)?;l(fā)酵、生產(chǎn)成本低等突出優(yōu)勢,且產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有高效、無毒和安全等特點[8-10],已廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、植物保護(hù)、食品防腐等各個行業(yè),有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場[11-13]。許多研究表明芽孢桿菌在食品中的防霉防腐作用效果顯著,可以明顯延長食品的保藏期[14-16]。芽孢桿菌抗菌的作用機(jī)制主要是產(chǎn)生3類拮抗物質(zhì):蛋白類物質(zhì)、脂肽類物質(zhì)和其他類代謝物質(zhì)[17-19]。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)是2010年Munusamy等[20]首次從韓國傳統(tǒng)種植的水稻根際土壤中分離得到一株新的芽孢桿菌,對人、畜及環(huán)境安全無害,可產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)[21-22]。張可可等[23]研究表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌SX09產(chǎn)生的胞外抑菌物質(zhì)對5株食源性致病菌和3株食品腐敗霉菌都有抑菌作用。吳燕燕等[24]發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌抗菌肽對羅非魚片有良好的防腐保鮮效果,可將冷藏保質(zhì)期延長4 d以上。尹向田等[25]發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌GSBM 05的次級代謝物可拮抗葡萄白腐病病菌。魏新燕等[26]研究表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用?!颈狙芯壳腥朦c】前期研究發(fā)現(xiàn)Z21菌發(fā)酵液對黑曲霉、康氏木霉等真菌有抑制作用[27],且甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌具有安全性高、易發(fā)酵、生產(chǎn)成本低等突出優(yōu)勢,其代謝產(chǎn)物可開發(fā)為食品的天然防腐劑或天然保鮮劑,然而其發(fā)酵條件及抑菌活性有待深入探討?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于從空氣中分離出的一株拮抗真菌的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Z21,在前期完成其培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究其產(chǎn)活性物質(zhì)的發(fā)酵條件,抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性,為開發(fā)食品的天然防腐劑或天然保鮮劑奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗菌種

    指示菌為康氏木霉(Trichoderma koningii),由福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)實驗室保藏。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Z21(Bacillus methylotrophicusZ21)由本課題組分離得到。

    1.2 主要試劑及儀器

    瓊脂(生化試劑):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、NH4NO3、MgSO4、BaCl2、KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2、(NH4)2SO4(均 為 分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;透析袋:分子截留量為8~14 kD,Sigma公司。

    SHP-250恒溫?fù)u床、SPX-250恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;ME204E電子天平、FE28 pH計:梅特勒-托利多國際股份有限公司產(chǎn)品;H-1850R高速冷凍離心機(jī):湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品;UV-1700紫外分光光度計:島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品;LX-B35L滅菌鍋:合肥華泰醫(yī)療有限公司產(chǎn)品;VS-1300L-U潔凈工作臺:蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

    1.3 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、改良馬鈴薯液體培養(yǎng)基(KPDL),配方及具體配制參考詹藝舒等[27]的方法。

    1.4 種子液的制備

    300 mL錐形瓶裝入100 mL KPDL液體培養(yǎng)基,滅菌后,用無菌接種環(huán)挑取一環(huán)Z21菌接入液體培養(yǎng)基,30 ℃,140 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)18 h,制備含量在105~106CFU· mL-1的種子液。

    1.5 無菌發(fā)酵液的制備

    將種子液接種于液體KPDL培養(yǎng)基,恒溫震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)液4 ℃,4 500 r·min-1離心20 min,收集上清液過0.22 μm的無菌濾膜,收集濾液即無菌發(fā)酵液。

    1.6 Z21無菌發(fā)酵液抑菌效果

    參考李恩琛等[28]的牛津杯法并略做修改:制備PDA培養(yǎng)基平板,在距離平板中央25 mm處放置牛津杯,并加入150 μL的無菌發(fā)酵液,以加入等體積的液體培養(yǎng)基為空白對照,然后在平板中央接種直徑為8 mm的康氏木霉菌塊,于28 ℃培養(yǎng)4 d后,用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量指示木霉菌的菌絲生長直徑,檢測抑菌效果。試驗設(shè)3個重復(fù),計算平均值。

    抑制率/%=[(對照組霉菌菌落直徑-處理組霉菌菌落直徑)/(對照組霉菌菌落直徑-菌塊直徑)]×100。

    1.7 單因素發(fā)酵試驗

    于500 mL錐形瓶中分別添加50、100、150、200、250 mL KPDL培養(yǎng)基;接種量試驗設(shè)2%、3%、4%、6%、8%、10%種子液;溫度試驗設(shè)28、30、32、35、37 ℃;搖床震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100、120、140、160、180、200 r·min-1;恒溫震蕩培養(yǎng)時間為36、48、60、72、84 h;培養(yǎng)液按1.5步驟制備無菌發(fā)酵液,以牛津杯法檢測抑菌活性,抑制率為評價指標(biāo),設(shè)3次重復(fù),計算平均值,優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。

    1.8 正交試驗

    選擇裝液量(A)、接種量(B)、發(fā)酵時間(C)、發(fā)酵溫度(D)和轉(zhuǎn)速(E)為考察因素,采用5因素3水平L18(35)正交試驗設(shè)計,以抑制率評價不同因素對發(fā)酵液抑菌效果的影響,正交試驗因素與水平見表1。

    表 1 正交試驗的因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal test

    1.9 Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性檢測

    1.9.1 溫度對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響取相同量的無菌發(fā)酵液分別置于40、60、80、100、120 ℃溫度下作用 30 min,測定抑制率。

    1.9.2 紫外線對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響取相同量的無菌發(fā)酵液分別置于紫外光燈(254 nm)下放置30、60、90、120、150、180、210 min,測定抑制率。

    1.9.3 pH對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 取相同量的無菌發(fā)酵液將其pH分別用10% HCl和10%NaOH調(diào) 節(jié) 為1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、12.0、14.0,在25 ℃下作用2 h后將pH調(diào)回原pH(8.02),測定抑制率。

    1.9.4 時間對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響取相同量的無菌發(fā)酵液置于40 ℃下分別作用30、60、90、120、150、180、210 min,測定抑制率。

    1.9.5 酶對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 在相同量的無菌發(fā)酵液中分別加入質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶和復(fù)合蛋白酶,并調(diào)節(jié)至其最適pH,在各自適宜溫度下孵育2 h后,于100 ℃下處理5 min滅活酶,將pH調(diào)回原pH,測定抑制率。

    1.9.6 金屬離子對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響在無菌發(fā)酵液中分別加入終濃度為20 mmol·L-1的KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2,與發(fā)酵液按2∶8的體積比混合,作用2 h,測定抑制率。

    以上試驗均采用牛津杯法檢測抑菌活性,抑制率表示活性大小,未經(jīng)處理的無菌發(fā)酵液為對照,試驗設(shè)3個重復(fù),計算平均值。

    1.10 活性物質(zhì)的MIC測定

    參考徐潤[29]硫酸銨沉淀法并略作修改,添加100%硫酸銨飽和溶液于無菌發(fā)酵液中使溶液的最終濃度為70%,4 ℃靜置過夜,12 000 r·min-1離心20 min,收集沉淀,用0.02 r·min-1PBS(pH=7.2)將沉淀完全溶解,將溶解后的溶液移入透析袋內(nèi)(分子截留量為8~14 kD),每隔3 h更換一次透析液,直到用1% BaCl2溶液滴定透析外液無沉淀生成,將透析液濃縮到30 mL,冷凍干燥得到粗提物。

    MIC測定參考王青華等[30]的方法并略作修改,配制含有粗提物1 000、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、1.56 mg·mL-1的PDB培養(yǎng)基,在無菌的48孔培養(yǎng)板上分別加入含有不同濃度粗提物的PDB培養(yǎng)基0.2 mL,以純PDB為對照,然后每孔加入0.05 mL 104CFU·mL-1的康氏木霉孢子懸液,放置28 ℃培養(yǎng)24~48 h,待對照組中長出可見菌絲即可觀察。試驗設(shè)3個重復(fù),確定MIC的濃度。

    1.11 Z21菌對康氏木霉菌絲生長影響的顯微鏡觀察

    參考文娜[31]的方法并略作修改,距平板中央左右各3 cm處劃線接種一環(huán)具有抑菌活性的細(xì)菌,28 ℃培養(yǎng)24 h后,將8 mm康氏木霉菌塊轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中央,28 ℃培養(yǎng)4 d后,取靠近Z21菌一面、邊緣有明顯被抑制的康氏木霉菌絲,以無Z21菌的培養(yǎng)皿培養(yǎng)康氏木霉菌絲作為對照,送福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所進(jìn)行掃描電鏡觀察。

    1.12 木霉菌絲核酸和蛋白質(zhì)的泄露試驗

    參考陶陽[32]的方法并略作修改,配制質(zhì)量濃度為12.5、25、50 mg·mL-1Z21菌粗提物的PDB培養(yǎng)基9 mL,將康氏木霉接種于PDB培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h,形成含有較多菌絲的菌球。對照組不加入粗提物。分別于培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、24 h時取出一定量的培養(yǎng)液,4 ℃,4 500 r·min-1離心15 min取上清液,用分光光度計在260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質(zhì))處測定吸光值的變化,試驗設(shè)3個重復(fù),計算平均值。

    1.13 數(shù)據(jù)處理

    將獲得的試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,Excel整理并制圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同單因素對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

    不同發(fā)酵時間、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度和搖床轉(zhuǎn)速對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響試驗結(jié)果見圖1。

    由圖1-A可知:發(fā)酵時間對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響(P<0.05)。抑制率隨著發(fā)酵時間延長,呈先上升后下降的趨勢,說明并不是發(fā)酵時間越長其抑制率越高,發(fā)酵前期抑制率過低,可能是細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物較少;后期抑制率降低,可能是后期營養(yǎng)物質(zhì)被耗盡,營養(yǎng)物質(zhì)不夠時,抑菌活性物質(zhì)被分解[33]。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時,抑制率最高,達(dá)到55.57%。所以選擇發(fā)酵時間為48 h。

    由圖1-B可知:裝液量對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響(P<0.05)。500 mL錐形瓶裝液量為50~250 mL時,隨著裝液量的增加,抑制率先上升后下降。其中在裝液量為150 mL時,無菌發(fā)酵液的抑制率最高為68.90%,所以選擇裝液量為150 mL。

    由圖1-C可知:接種量對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響(P<0.05)。抑制率隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當(dāng)接種量過大時,培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質(zhì)可能消耗過快,影響細(xì)菌后續(xù)生長;當(dāng)接種量過少時,菌數(shù)較少,產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)過少,抑制率不高[34]。當(dāng)接種量為3%時,抑制率最高,為67.76%,所以選擇接種量為3%。

    由圖1-D可知:發(fā)酵溫度對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性也有顯著影響(P<0.05),隨著溫度的升高,其抑制率先上升后下降,在37 ℃時,抑制率最低,只有28.9%;而28 ℃、30 ℃和35 ℃的抑制率較接近,差異不明顯,抑制率均為45%左右。當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃時,抑制率最高,達(dá)到67.36%,所以選擇發(fā)酵溫度為32 ℃。

    由圖1-E可知:搖床轉(zhuǎn)速對Z21菌無菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響(P<0.05)。一般來說轉(zhuǎn)速越高,氧氣越充分,細(xì)菌生長越好,但試驗中抑制率隨著轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)“先增大后減少”的趨勢,其原因可能為當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r·min-1時,轉(zhuǎn)速太低,氧氣不充分,細(xì)菌生長不好,代謝物質(zhì)較少。在轉(zhuǎn)速為120 r·min-1時,氧氣充分,細(xì)菌長勢好,分泌的抑菌物質(zhì)較多,其抑制率最高,為68.37%,而當(dāng)轉(zhuǎn)速為140~200 r·min-1抑制率下降,其原因可能為培養(yǎng)液的溶氧量已飽和,無法再增加,另一方面,細(xì)菌可能主要進(jìn)行生長,較少分泌代謝產(chǎn)物,抑制率降低[35-36],所以選擇轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。

    2.2 Z21菌發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

    由表2可知,影響甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Z21無菌發(fā)酵液抑菌活性的主次順序為E>D>A>B>C,最佳搖床發(fā)酵條件為A2B2C3D1E2,該工藝與試驗14一樣,按照此工藝進(jìn)行3組平行試驗,得到抑制率均為72%左右,較穩(wěn)定。結(jié)果表明,甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Z21優(yōu)化后的發(fā)酵條件為500 mL錐形瓶中裝液體培養(yǎng)基150 mL、接種量3%、發(fā)酵時間60 h、發(fā)酵溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速140 r·min-1。由表3可知,轉(zhuǎn)速對抑制率的影響顯著(P<0.05)。

    2.3 Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性

    不同溫度、紫外線、pH、作用時間、酶和金屬離子對Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響試驗結(jié)果見圖2。

    由圖2-A可知,經(jīng)40~60 ℃溫度處理,Z21菌發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性較強(qiáng),抑制率維持在72%,較穩(wěn)定;經(jīng)80~100 ℃處理后,抑菌率略微下降,在65%左右,但抑制率仍在50%以上。而經(jīng)120 ℃處理后的發(fā)酵液的抑制率急劇下降(P<0.05),低至8.17%,幾乎喪失。說明Z21菌發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)對于100 ℃以內(nèi)的溫度其結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,能耐受100 ℃高溫,而在120 ℃后抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,幾乎沒有抑制率。

    由圖2-B可知,Z21菌發(fā)酵液在紫外環(huán)境下處理30~90 min,抑制率變化不大(P>0.05),維持在75%左右,與未經(jīng)紫外照射的CK組的抑制率沒有顯著性影響;經(jīng)紫外環(huán)境下處理120~210 min,抑制率仍保持在72%左右,抑菌率保持較穩(wěn)定,說明Z21菌抑菌活性物質(zhì)具有紫外穩(wěn)定性。

    由圖2-C可知,Z21菌發(fā)酵液在酸性條件下的抑制率較高,說明活性物質(zhì)在酸性條件較堿性條件穩(wěn)定。與pH=8(CK)時的發(fā)酵抑制率比較,Z21菌發(fā)酵液在pH>8或pH<8條件下抑菌率稍有下降,但抑菌率仍然較高,說明Z21菌抑菌活性物質(zhì)在pH為1~14的環(huán)境較穩(wěn)定,可以作為食品防腐劑在食品中廣泛使用。

    由圖2-D可知,Z21菌發(fā)酵液在40 ℃水浴30 min時,其抑菌率與CK組相比無顯著性差異(P>0.05),水浴60~120 min,抑制率稍有變化,但均維持在72%左右,處理150~210 min后,抑制率下降至61%左右,總體維持在60%左右,說明Z21菌的抑菌活性物質(zhì)在40 ℃環(huán)境下相對較穩(wěn)定。

    由圖2-E可知,無菌發(fā)酵液經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理后,抑制率為67.68%,與CK組比較,下降了5%,而經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶處理后的抑制率比CK組低了10%,維持在60%左右,但均高于50%,仍具有較強(qiáng)的活性,說明Z21菌抑菌活性物質(zhì)對這5種酶不敏感。

    由圖2-F可知,發(fā)酵液經(jīng)KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2金屬離子處理后,抑制率發(fā)生了變化,說明金屬離子對其有影響。Zn2+、Cd2+、Ca2+處理組與CK組比較,抑制率下降了7%左右,而經(jīng)K+、Na+、Mg2+處理后,抑制率降低了15%左右,變化明顯(P<0.05),說明其抗菌活性物質(zhì)在一定程度受到了這些金屬離子的脅迫,但總體抑制率均保持在56%以上,保持較高的抑菌活性。

    2.4 活性物質(zhì)的MIC

    MIC(Minimum inhibitory concentration),是 指最低抑菌濃度,是測量抗菌物質(zhì)抗菌活性大小的一個指標(biāo)。經(jīng)過最優(yōu)方法提取得到的粗提物,其抑制康氏木霉孢子萌發(fā)的測定結(jié)果見表4。

    將完全不生長菌絲的一孔判定為終點,該孔濃度即為MIC。從表4可以看出,當(dāng)空白孔中康氏木霉菌絲生長時,粗提物濃度為25 mg·mL-1的孔,菌絲未生長,故粗提物的MIC為25 mg·mL-1。

    表 2 Z21菌發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results on Z21 fermentation conditions

    表 3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 ANOVA analysis on orthogonal test results

    2.5 Z21菌對康氏木霉菌絲生長影響的顯微鏡觀察

    Z21菌對康氏木霉菌絲表面顯微特征的影響的掃描電鏡圖如圖3所示。

    從掃描電鏡可以看出(圖3):對照組的康氏木霉的菌絲表面平整,菌絲體飽滿,有許多孢子梗,說明菌絲生長狀態(tài)良好。處理組中的康氏木霉菌絲表面明顯皺縮,菌絲明顯變細(xì),有的菌絲斷裂,視野中未發(fā)現(xiàn)孢子梗,說明菌絲的生長發(fā)育以及孢子梗的分化受到明顯抑制。

    圖 2 Z21菌發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性Fig. 2 Stability of antibacterial activity of Z21 fermentation broth

    表 4 Z21菌發(fā)酵液粗提物抑制康氏木霉孢子萌發(fā)的MICTable 4 MIC of crude Z21 fermentation extract on T. koningii spore germination

    2.6 Z21菌粗取物對木霉菌絲核酸和蛋白質(zhì)的泄露情況

    用25 mg·mL-1粗提物的PDB培養(yǎng)康氏木霉的菌絲,根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸具有紫外吸收的性質(zhì),利用比色法測定康氏木霉菌絲細(xì)胞外液體的蛋白質(zhì)和核酸含量,以此探究是否有內(nèi)容物質(zhì)(主要是蛋白質(zhì)和核酸)的泄露[33]。測定結(jié)果如圖4和圖5所示。

    從圖4和圖5可以看出,與對照組相比,隨著時間的延長,含有粗提物的培養(yǎng)液中的康氏木霉菌絲培養(yǎng)液在260 nm和280 nm處的紫外吸光值不斷增加,分別從最開始的0.03和0.03增加到0.15和0.16,說明康氏木霉菌絲細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸和核酸等物質(zhì)泄露到了細(xì)胞外,導(dǎo)致培養(yǎng)液的260 nm和280 nm處吸光值增加。綜上所述,推測該活性物質(zhì)可能是蛋白類物質(zhì)或者為脂肽類物質(zhì)[37],且作用于真菌的細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞膜透性有所改變,細(xì)胞內(nèi)容物外流。

    圖 3 受Z21菌影響的康氏木霉菌絲表面掃描電鏡圖Fig. 3 SEM images of T. koningii hyphae surface as affected by Z21

    圖 4 Z21菌發(fā)酵液粗提物對康氏木霉菌絲細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄露的影響Fig. 4 Effect of crude Z21 fermentation broth extract on protein leakage of T. koningii hyphae

    圖 5 Z21菌發(fā)酵液粗提物對康氏木霉菌絲細(xì)胞內(nèi)核酸泄露的影響Fig. 5 Effect of crude Z21 fermentation broth extract on nucleic acid leakage of T. koningii hyphae

    3 討論與結(jié)論

    甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Z21發(fā)酵液對黑曲霉、康氏木霉等真菌有很強(qiáng)的抑菌活性[27],150 μL無菌發(fā)酵液對康氏木霉的抑制率最高達(dá)72%左右。隨著人們對食品安全的認(rèn)識和要求不斷提高,化學(xué)防腐劑的使用已成為一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此,安全、高效和低成本的生物防腐劑將成為防腐劑的發(fā)展趨勢[24]。芽孢桿菌屬的細(xì)菌可生成抑菌活性物質(zhì),對霉菌的生長有較強(qiáng)的抑制作用[38],且芽孢桿菌屬對人、畜和環(huán)境安全,成為開發(fā)天然生物防腐劑的熱點研究之一。武利勤等[39]發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)芽孢桿菌RA對棉花黃萎病菌和禾谷鐮孢菌等9種植物病原菌抑制率均在50%以上。采俊香等[40]研究表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌G-5產(chǎn)生的抗菌蛋白對多種植物病原真菌有較好抑菌效果。He等[21]通過試驗得到甲基營養(yǎng)芽孢桿菌BCN2對從采后枇杷果實中分離出的5種病原真菌有抑制作用,使枇杷果實保鮮期達(dá)10 d。

    Z21菌發(fā)酵液耐熱,耐酸、堿,對紫外線、許多酶和金屬離子不敏感,這與前人的研究結(jié)果相似,解淀粉芽孢桿菌W10產(chǎn)生的新型小抗菌肽5240在100 ℃處理20 min和pH 4~10范圍內(nèi)可以保持其抑菌活性[41],甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌G-5[40]、Hg18[42]產(chǎn)生的抗菌蛋白具有較好的光、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。Lee等[43]從韓國傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品分離出一株芽孢桿菌,產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)Anti-LM7在pH4~9和80 ℃作用30 min均保持較強(qiáng)的抗菌活性。吳艷清等[44]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌YQ5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對高溫、pH(2~12)、紫外線照射均不敏感。由此可見,Z21菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)不僅抑菌率較高,且穩(wěn)定性較好,具有開發(fā)為天然生物防腐劑的潛力和應(yīng)用前景。

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