水產(chǎn)品中酰胺類除草劑及其代謝物的氣相色譜－質(zhì)譜法測定

彭中校，張華威，李佳蔚，宮向紅，張秀珍*，徐英江，王 丹，劉永春

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006）

為了增大土地利用率，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，使收益最大化，除草劑已不可避免地應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。由于農(nóng)藥自身的特性與穩(wěn)定性，在施用后不可避免殘留在環(huán)境中，并通過降雨、淋溶等途徑進(jìn)入水體［1］，影響水生生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生風(fēng)險。

酰胺類除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用廣泛，常用的主要有甲草胺（Alachlor）、乙草胺（Acetochlor）、丙草胺（Pretilachlor）、丁草胺（Butachlor）以及異丙甲草胺（Metolachlor）等。2-甲基-6-乙基苯胺（MEA）是乙草胺、異丙甲草胺的中間體，2，6-二乙基苯胺（DEA）是甲草胺、丙草胺和丁草胺的中間體［2－3］，這兩種中間體也是酰胺類除草劑的代謝產(chǎn)物［4－6］。這些物質(zhì)在自然環(huán)境下能長期存在并蓄積于生物體內(nèi)，且均具有較強(qiáng)毒性，可對生物和人體健康產(chǎn)生危害［7］。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)除草劑殘留量檢測方法》（GB 23200.1－2016）［8］與《水體中甲草胺等六種酰胺類除草劑的多殘留測定氣相色譜法》（NY/T 1728－2009）［9］中規(guī)定了酰胺類除草劑在谷物、糧油以及水體中的殘留檢測方法，雖然其他食品可參照執(zhí)行，但是水產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜，含水量也與普通農(nóng)產(chǎn)品不同，而且國內(nèi)關(guān)于代謝物MEA、DEA的檢測方法甚少。因此，建立并完善同時檢測水產(chǎn)品中酰胺類除草劑及其代謝物的方法具有重要意義，對填補(bǔ)國內(nèi)水產(chǎn)品中除草劑殘留檢測研究領(lǐng)域的空缺具有重要參考價值。

國內(nèi)目前關(guān)于酰胺類除草劑農(nóng)藥殘留的檢測方法較多［10－13］，但同時檢測其代謝物或降解產(chǎn)物的方法鮮有報道。喬丹等［14］將旋蒸后的提取液經(jīng)凝膠色譜、固相萃取凈化后，收集洗脫液，建立了動物源性水產(chǎn)品中16種除草劑的檢測方法，但樣品前處理步驟繁瑣，時間較長。本研究通過優(yōu)化樣品前處理條件，簡化前處理步驟，采用簡潔、高效的氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS），建立了同時測定水產(chǎn)品中5種酰胺類除草劑及其2種代謝物的檢測方法。該方法靈敏度高，精密度好，能滿足水產(chǎn)品中5種酰胺類除草劑及其2種代謝物的定量分析要求。同時為了驗證方法的適用性，采用該方法檢測分析了山東省沿海海域四角蛤蜊（Mactraveneriformis）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、中國對蝦（Fenneropenaeuschinensis）和半滑舌鰨（C yno gl ossussemi l aevi s）樣品中酰胺類除草劑的殘留狀況，為深入研究酰胺類除草劑污染對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的直接影響提供了技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B/5977B，美國安捷倫公司）；SB－25－12DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技）；N－EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；H2050R低速離心機(jī)（長沙湘儀有限公司）。HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，沃特世公司）。

甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、二氯甲烷（農(nóng)殘級），均購自美國默克公司；實驗用水為三級水。乙草胺、甲草胺、異丙甲草胺、丁草胺、丙草胺、2，6-二乙基苯胺、2-甲基-6-乙基苯胺標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取（5±0.05）g經(jīng)均質(zhì)的樣品于50 mL離心管中，加入20 mL二氯甲烷－乙酸乙酯（3∶2，體積比，下同）混合溶劑旋渦混勻1 min，超聲提取20 min后，于10℃下4 000 r/min離心20 min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，使用15 mL二氯甲烷－乙酸乙酯（3∶2）對殘渣進(jìn)行重復(fù)提取，合并上清液，于40℃氮吹濃縮至約1 mL。加入1 mL甲醇，旋渦混合1 min，加入10 mL水混勻，經(jīng)3 mL甲醇、3 mL水活化后的HLB固相萃取柱凈化后以3 mL水淋洗，抽干5 min，用3 mL正己烷洗脫，收集洗脫液待測。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：J&W DB－17石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；柱溫程序：70℃維持1 min，以15℃/min升至200℃，維持1 min，再以2℃/min升至222℃，最后以10℃/min升至270℃，維持1 min；載氣（高純He）流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度230℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL。

1.3.2質(zhì)譜條件配置EI源；電子能量70 eV；接口溫度280℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度：150℃；溶劑延遲5 min，選擇離子監(jiān)測（SIM）模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1提取劑的選擇水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測的提取劑主要有正己烷［15－17］、乙腈［18］、二氯甲烷［19］及各種有機(jī)混合溶劑如鹽酸－乙醇混合溶劑［20］等，可根據(jù)樣品種類和測定的目標(biāo)物進(jìn)行選擇和優(yōu)化。代謝物MEA、DEA的檢測方法文獻(xiàn)較少，主要針對水、啤酒、血漿、尿液等液體基質(zhì)。選擇提取劑時，除去水產(chǎn)品樣品中的多余水分非常關(guān)鍵。提取劑選用不當(dāng)，不能充分滲透到樣品中，將導(dǎo)致提取效率低，造成目標(biāo)物回收率不能滿足要求。本實驗發(fā)現(xiàn)，用乙腈或丙酮提取，除草劑的回收率滿足要求，但由于提取液中含有大量水分，其濃縮過程較長，且對代謝物MEA、DEA的回收率低；而采用非極性的正己烷提取，目標(biāo)物的回收率不能滿足要求。經(jīng)試驗，采用二氯甲烷－乙酸乙酯（3∶2）混合溶劑進(jìn)行提取時，代謝物MEA、DEA與5種酰胺類除草劑的回收率結(jié)果滿意。

2.1.2凈化方法的優(yōu)化由于水產(chǎn)品樣品成分較復(fù)雜，而目標(biāo)物的含量很低，需對提取液進(jìn)行充分的凈化處理，以提高檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確性。固相萃取法［20－21］為常見的食品中藥物殘留檢測的凈化方法，其凈化效果依賴于待測成分與固體萃取劑相互作用力的強(qiáng)弱［22］，因此選擇合適的固體萃取劑和過柱方法非常重要。固相萃取技術(shù)操作簡單、前處理快速，在水產(chǎn)品分析中具有很大優(yōu)勢，同時，對去除色素和生物大分子的干擾效果良好［23］。HLB固相萃取柱是廣泛應(yīng)用的一種新型萃取柱，其填料既有親脂性，也有親水性，容量高、保留能力強(qiáng)［24］。本實驗結(jié)果表明，使用HLB固相萃取柱凈化樣品提取液，能排除大部分干擾物質(zhì)的影響，提高目標(biāo)物的信噪比、保證方法的靈敏度。

合適的洗脫液和洗脫體積是獲得良好凈化效果的關(guān)鍵因素。甲醇是HLB固相萃取柱的最常用洗脫劑，但須經(jīng)過濃縮、轉(zhuǎn)換溶劑才能用于GC－MS分析。本實驗發(fā)現(xiàn)，采用甲醇洗脫時，無論采用旋蒸還是氮吹方法濃縮，洗脫液中MEA、DEA均損失嚴(yán)重，回收率較低。選用正己烷、丙酮作為洗脫劑時，為避免濃縮過程的損失，對洗脫液體積進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果表明，用3 mL正己烷或丙酮洗脫，洗脫液不經(jīng)濃縮，直接進(jìn)行GC－MS分析，可保證7種目標(biāo)物的回收率均滿足要求。由于丙酮洗脫液中含有少量水，需要除水后進(jìn)行GC－MS分析，增加了操作步驟。因此，本實驗最終采用3 mL正己烷洗脫。

圖1 7種目標(biāo)物在不同洗脫液下的回收率Fig.1 Recoveries of 7 target compounds under different elution solvents

2.2 特征離子的選擇

以全掃描模式對7種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，選擇質(zhì)譜圖中豐度高、干擾少的離子作為特征離子，采用SIM模式進(jìn)行測定。7種目標(biāo)物的監(jiān)測離子見表1。

表1 7種目標(biāo)物的保留時間、監(jiān)測離子、線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 1 Retention times，monitoring ions，linear equations，correlation coefficients and linear ranges of 7 compounds

2.3 色譜條件優(yōu)化

氣相色譜－質(zhì)譜分析的定性依據(jù)是保留時間和特征離子，柱溫是目標(biāo)物保留時間的決定因素。本實驗對柱升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，有效避免了雜質(zhì)干擾，7種物質(zhì)的分離效果以及峰形良好?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品（四角蛤蜊）及空白加標(biāo)樣品的總離子流色譜圖見圖2。

圖2 7種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液（A，50μg/L）、空白樣品（四角蛤蜊）（B）及空白加標(biāo)樣品（C）的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of 7 compounds standards（A，50μg/L），blank sample of Mact ravener ifor mis（B）and spiked sample of Mactrav enerif or mis（C）

2.4 檢出限與線性范圍

取MEA、DEA、異丙甲草胺質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、25μg/L，乙草胺、甲草胺、丁草胺、丙草胺質(zhì)量濃度分別為2.0、5.0、10、20、50μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣分析，以定量離子峰面積為y軸，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。MEA、DEA、異丙甲草胺在1.0～25μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其余4種目標(biāo)物在2.0～50μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其響應(yīng)值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.998 8。7種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。

以信噪比S/N≥3為檢出限（LOD），S/N≥10且回收率、精密度滿足殘留檢測要求為定量下限（LOQ）。其中MEA、DEA、異丙甲草胺的LOD為0.5μg/kg，LOQ為1.5μg/kg；另外4種的LOD為1.0μg/kg，LOQ為3.0μg/kg。

2.5 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

稱取3組，每組4個（5.00±0.05）g的空白樣品，分別進(jìn)行四角蛤蜊、許氏平鮋（S ebast es sch legelii）、三疣梭子蟹（Portunus t ritub erculatus）中7種化合物低、中、高3個加標(biāo)水平的回收試驗。其中MEA、DEA、異丙甲草胺的低、中、高3個加標(biāo)水平分別為2.5、5.0、10μg/kg，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺的低、中、高3個加標(biāo)水平分別為5.0、10、20μg/kg，重復(fù)測定6次。四角蛤蜊的加標(biāo)回收率為69.7%～111%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.40%～7.6%（表2）；許氏平鮋的加標(biāo)回收率為65.3%～118%，RSD為1.7%～9.3%；三疣梭子蟹的加標(biāo)回收率為61.4%～113%，RSD為0.90%～7.1%。

表2 四角蛤蜊樣品的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of the target compounds of M a ct ravenerif or mis（n=6）

2.6 實際樣品檢測

將本方法用于山東省沿海海域四角蛤蜊、大菱鲆、中國對蝦和半滑舌鰨樣品的檢測。其中1份四角蛤蜊樣品中檢出代謝物MEA，檢出量為3.74μg/kg，檢出率為2.5%。陽性樣品的色譜圖見圖3。

圖3 四角蛤蜊陽性樣品的離子流色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of a Mactr ave neri formi s positive sample

3 結(jié) 論

本研究以二氯甲烷－乙酸乙酯混合溶劑為樣品提取液，通過HLB固相萃取柱凈化，建立了水產(chǎn)品中5種酰胺類除草劑及其代謝物MEA、DEA的GC－MS測定方法。該方法樣品前處理簡單，定量下限、回收率以及精密度均能滿足實驗室檢測要求，適用于水產(chǎn)品中5種酰胺類除草劑及其代謝物的同時測定。