食用明膠中豬源性成分檢測研究進展

朱曉艷，古淑青，孫 欣，鈕 冰，鄧曉軍

（1.上海大學 生命科學學院 食品工程系，上海 200436；2.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135）

明膠是一種重要的食品添加劑，通常用于糖果、果凍等食品的生產［1－2］，此外，還應用于藥品膠囊等醫(yī)療領域［3－5］。食用明膠主要來源于豬、牛、魚等動物的骨和皮，是膠原蛋白的水解產物［6］。在伊斯蘭教中，嚴禁食用含豬源性成分的非清真產品。一些伊斯蘭國家制定嚴格的法規(guī)［7］，要求生產商和進口商在產品上標明清真認證，以區(qū)別非清真產品。清真食品以其“健康”的理念，同樣吸引著非穆斯林消費者，清真產業(yè)成為快速增長的消費領域［8］，然而部分不法商家為降低成本采用較廉價的原材料（如豬明膠），導致摻假和貼錯標簽的現象時有發(fā)生。而不同物種間DNA和蛋白質的相似性、加工過程中DNA和蛋白質的降解，對食品中明膠來源的鑒定造成困難，因此迫切需要開發(fā)一種用于檢測豬源性明膠的可靠且靈敏的分析方法。

目前，已建立了多種檢測明膠及含明膠食品中豬源性成分的方法，主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）［9－15］、酶聯免疫吸附法（ELISA）［16－18］、液相色譜－串聯質譜法［19－25］和衰減全反射傅立葉變換紅外光譜法（ATR－FTIR）［26－28］等，方法可大致分為基于DNA的方法和基于蛋白質的方法（如圖1）。本文主要對不同分析方法的優(yōu)點與不足進行綜述，以期為明膠中豬源性成分的鑒定提供參考。

圖1 加工食品中豬源性明膠的檢測方法Fig.1 Detection methods of porcine gelatin in processed food

1 基于DNA檢測明膠中豬源性成分的方法

1.1 樣品前處理

PCR檢測的可靠性和敏感性取決于DNA的質量［29］，脂肪、多糖和礦物質等PCR抑制劑的存在，可能導致假陰性結果［30］；此外，食品加工過程會導致DNA的降解［31－32］。因此，對加工食品進行前處理以制備高質量DNA對PCR擴增至關重要。目前加工食品中DNA的提取方法主要分為裂解液提取法和試劑盒提取法。

1.1.1裂解液提取

該法可通過直接裂解釋放DNA，常用裂解液有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和異硫氰酸胍。通常步驟為：加入蛋白酶K降解蛋白質，使DNA充分游離；以酚－氯仿－異戊醇抽提，去除雜質；加入異丙醇或無水乙醇沉淀DNA，并將沉淀溶解于三羥甲基氨基甲烷－乙二胺四乙酸（Tris－EDTA，TE）緩沖液中。王瑞元等［33］比較了5種不同裂解液對奶糖中DNA的提取效果，結果表明改良SDS裂解液提取的DNA濃度、純度及PCR擴增效果最佳。

1.1.2試劑盒提取

市售DNA提取試劑盒多采用旋轉柱技術和/或移動固相提?。?4］，可最大限度回收DNA片段以確保DNA的高質量。Lee等［9］利用試劑盒從明膠膠囊中提取的DNA得率為6.5～131 ng/μL；Sultana等［11］從高度加工的食品樣品中得到的DNA提取量仍可達到約4～12 ng/μL。但該方法成本高昂、操作繁瑣。

1.2 PCR檢測方法

1.2.1常規(guī)PCR

常規(guī)聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）又稱傳統(tǒng)PCR，通過DNA聚合酶在一定反應體系中對DNA目標片段進行擴增，如圖2所示。常用的遺傳標記12S rRNA、16S rRNA、細胞色素b（Cytb）和細胞色素氧化酶I（COI）基因以及內部轉錄間隔區(qū)（ITS）和置換環(huán)（D-loop）區(qū)域，拷貝數高且高度保守，已被廣泛用于哺乳動物、魚類等物種的鑒定［35］。與單拷貝基因相比，這些多拷貝基因的使用可使PCR方法達到更低檢出限（LOD）。Lee等［9］利用16S rRNA基因成功區(qū)分了市售膠囊中的明膠來源，其中豬源性DNA的檢出限（LOD）達0.01 ng/μL。

圖2 PCR特異性引物原理圖Fig.2 Schematic diagram of PCR specific primer

1.2.2多重PCR

多重PCR（Multiplex polymerase chain reaction，MPCR）指在常規(guī)PCR基礎上使用兩對及以上不同引物，同時擴增或檢測多個靶標。此方法較常規(guī)PCR具有高通量、特異性好、簡便快速等優(yōu)點［36］。Nikzad等［10］利用線粒體DNA（mtDNA）同時檢測膠囊中豬和牛的DNA，檢測靈敏度可達0.1%；Sultana等［11］針對Cyt b基因對清真品牌糖果進行四重PCR測定，成功區(qū)分了產品中的豬、牛和魚明膠，LOD可達0.001 ng。此方法由于在體系中同時進行多個PCR反應，對引物設計要求較高，技術要素和影響因素控制不當易造成特異性和靈敏度降低，甚至無法檢出［37］。需控制引物個數，并在保證引物特異性前提下減少引物間的非特異性結合。

1.2.3實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitine PCR，qPCR）指在常規(guī)PCR基礎上向體系中加入熒光基團，通過熒光信號進行實時監(jiān)測的一種核酸定量技術［38］。其擴增與檢測在封閉體系中進行，避免了常規(guī)PCR檢測中電泳帶來的污染問題。目前常用的熒光系統(tǒng)包括SYBR green、Taq Man探針和分子信標（MB），原理如圖3所示。Sudjadi等［12］采用D-loop序列檢測市售膠囊中豬源性DNA，LOD為5 pg；Mohamad等［13］利用染色體MPRE42重復序列結合MB檢測實際樣品中的豬DNA，LOD低至1 pg；Cai等［14］利用Taq Man探針在低至1 pg/mL的濃度下靈敏地檢測到膠囊中的豬DNA。

圖3 qPCR常用熒光系統(tǒng)原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of common fluorescence system of qPCR

1.2.4多重熒光定量PCR

多重熒光定量PCR（Multiple fluorescence quantitative PCR）指在qPCR基礎上使用兩對及以上不同引物和相應探針，同時對多個靶標進行檢測。此方法兼具多重PCR和熒光定量PCR的優(yōu)點，重復性好、靈敏度高、特異性強，可進行定量和定性分析，同時減少了環(huán)境污染［37］。Taq Man探針是多重熒光定量PCR體系中的常用探針，通過在不同序列末端標記不同熒光基團（Reporter）及相應的猝滅基團（Quencher），即可形成不同的Taq Man探針［39］。Sultana等［15］建立的qPCR方法對混合明膠的檢出限可達0.005 ng/μL，并成功應用于口香糖、果凍等市售清真樣品的鑒定。

1.2.5PCR－Southern雜交

PCR－Southern雜交是通過將變性生物素標記的擴增片段與固定在膜上的特異性探針雜交，對物種特異性進行識別的方法，其流程圖見圖4。Mutalib等［40］針對mt DNA Cytb基因設計引物，在Olipro?豬基因芯片上進行Southern雜交，LOD可達0.001 ng，而常規(guī)PCR方法均未檢出。將Southern雜交和PCR技術相結合，可以檢測到極少量的DNA擴增產物，方法靈敏、重復性好，但操作繁瑣。

圖4 PCR－Southern雜交流程圖Fig.4 Flow chart of PCR－Southern blot

2 基于蛋白質檢測明膠中豬源性成分的方法

2.1 樣品前處理

食品中的蛋白質經深加工后遭到嚴重破壞，因此對加工食品中微量蛋白質的提取顯得尤為重要。樣品前處理與檢測方法有關，在衰減全反射傅立葉變換紅外（ATR－FTIR）光譜法測定中，所有樣品不需要任何預處理［27－28］；采用質譜檢測時通常需要將提取的樣品進行酶解［19－21，23－24］。蛋白質的提取方法主要包括有機溶劑沉淀法、鹽析法和表面活性劑吸附法。

2.1.1有機溶劑沉淀法

有機溶劑可通過降低水溶液的介電常數，破壞蛋白質的水化膜，導致蛋白質分子發(fā)生聚集和沉淀［41］。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇和丙酮。但該方法易造成蛋白質變性，需將有機溶劑預冷（－20℃）并在低溫下操作。沉淀后還需將有機溶劑吹干，并將蛋白顆粒溶解在緩沖溶液中，加入適量保護劑（如2-巰基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS）穩(wěn)定蛋白質［17，42－43］。

2.1.2鹽析法

向含有蛋白質的溶液中加入鹽溶液，可以改變蛋白質的疏水相互作用，增強或減少蛋白質的溶解性［41］。常用的中性鹽主要有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。此法不易使蛋白質變性，但提取效率較低，可通過適當加大樣品濃度、調節(jié)pH值和溫度提高分離效率。

2.1.3表面活性劑吸附法

由于蛋白質包含極性、非極性和帶電基團，故表面活性劑可與蛋白質形成復合物。這一原理被廣泛應用于提取和純化蛋白質［44］。根據極性基團的解離性質，表面活性劑可分為陽離子型表面活性劑（Cationic surfactant，CS）、陰離子型表面活性劑（Anionic surfactant，AS）、兩性表面活性劑（Zwitterionic surfactant，ZS）以及非離子型表面活性劑（Non-ionic surfactant，NIS）。聚山梨醇20（Tween20）是一種典型的食品級低分子量NIS，可以充分提取吸附蛋白［42，45］。較有機溶劑沉淀法和鹽析法，表面活性劑吸附法可減少試劑使用和實驗步驟。

2.2 明膠中豬源性蛋白質的檢測方法

2.2.1酶聯免疫吸附法（ELISA）

酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbnent assay，ELISA）是一種將抗原－抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合的免疫分析方法［46］，最常用的兩種ELISA方法為間接法和夾心法。由于該方法樣品制備簡單，并且具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點，成為一種檢測商業(yè)產品中明膠的可行方法，但近緣物種之間膠原蛋白序列的高度同源性，導致抗體受到交叉反應的限制，表現出較差的物種特異性。

Tukiran等［16］建立了3種競爭性間接ELISA方法用于快速檢測食用燕窩（EBN）中的豬明膠，LOD分別為0.033、0.082、0.052 mg/mL；進一步研究表明，該方法同樣適用于果凍、棉花糖等加工產品的檢測，LOD為0.05μg/mL［17］；Doi等［18］建立了兩種適用于分析不含熟肉制品的加工食品中豬明膠的夾心ELISA方法，檢測限可達0.78 ng/mL。

2.2.2十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

SDS－PAGE電泳根據蛋白質分子量不同進行分離，通過物種特異性蛋白質條帶分析明膠來源，方法準確、簡單、快速、經濟。Yap等［47］通過SDS－PAGE方法對市售膠囊進行檢測，觀察到豬明膠樣品在110 kDa處有明顯條帶；Azira等［42］結合主成分分析（PCA）方法對數據進行分析，可以檢測到牛明膠中5%的豬明膠摻雜率。但此方法分辨率較低，不適用于檢測復雜基質中的明膠來源，可結合等電聚焦電泳分離蛋白質，經酶切成肽段后以高分辨率質譜進一步分析［48］。

2.2.3基于特征肽段的質譜法

2.2.3.1液相色譜與質譜聯用法質譜是表征和鑒定蛋白質的首選方法。將蛋白質酶解成肽段后進行質譜分析，可根據氨基酸組成和物種特征肽段，確定復雜基質中蛋白質的來源［49］。此方法簡單、準確、靈敏，被廣泛應用于食品的摻假鑒定［50－51］。Zhang等［19］采用高效液相色譜－串聯質譜（HPLC－MS/MS）得到豬特征肽段GPPGSAGAPGK，并發(fā)現脯氨酸羥基化引起的質量差異可影響多肽鑒定；Ward等［20］經超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）檢測到加工產品中的豬特異性識別肽AGPAGPDGPLGPAGSR、LNGPAPGR和LGPLGSPGL，其響應強且無雜峰；Guo等［21］在UPLC－MS/MS多反應監(jiān)測（MRM）模式下，以AGVMGPOGSR作為特征肽段，對豬明膠的檢測具有較高專一性，在0.04%低含量下仍可檢出。

2.2.3.2高效液相色譜－線性離子阱/靜電場軌道阱質譜法線性離子阱/靜電場軌道阱（LTQ/Orbitrap）質譜利用離子在特定靜電場中的運動頻率不同進行質量分析，具有極高的分辨率和質量精確度［52］，可以明確地區(qū)分明膠來源。Sha等［22］采用LTQ/Orbitrap質譜通過各自特征肽段對混合物中的牛皮明膠、豬皮明膠和阿膠明膠進行了明確區(qū)分。每種明膠中可檢測到的特征肽段的數量隨著混合物中目標明膠濃度的降低而減少；在目標明膠含量較低（＜10%）情況下仍可檢測到多個目標特征肽段。

2.2.3.3基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法（MALDITOF MS）是一種簡單、高效、低成本的物種鑒定常規(guī)技術。Flaudrops等［23］利用MALDI－TOF MS從豬明膠中鑒定出10個特異峰，豬明膠添加量降至1%時，仍在10個豬物種特征峰中發(fā)現了5個峰。但該項技術由于需要高性能質譜儀與色譜聯用，其應用受到限制。

2.2.3.4納升級超高效液相色譜－串聯質譜法納升級分離技術是使用流速在10～1 000 nL/min范圍內的色譜柱進行食品分析的一種方法［53］。該技術提供了一種更快、更好的食品成分分離手段，具有前所未有的靈敏度和特異性，特別是當與MS檢測聯用時，有助于解決復雜樣品中低濃度物質的分析問題。此外，該方法的新穎之處在于，可在不依賴數據的采集模式下工作，并借助交替的高、低碰撞能量提供明膠的母離子和子離子信息。但與傳統(tǒng)的HPLC儀器相比，該方法耗時、成本高，不適宜常規(guī)分析［53－55］。

Yilmaz等［24］利用納升級超高效液相色譜和電噴霧電離四極桿飛行時間質譜（nanoUPLC－ESI－QTOF MS）成功地區(qū)分了奶酪、酸奶和冰激凌中的豬和牛明膠；Dal Belloa等［25］開發(fā)了一種基于納升級高效液相色譜－高分辨質譜（nanoUPLC－HRMS）的方法檢測紅酒中的豬明膠，最低檢出限為5μg/mL。

2.2.4衰減全反射傅立葉變換紅外光譜法（ATR－FTIR）

傅立葉變換紅外光譜（FTIR）基于不同化合物的分子結構不同，通過不同和特定的紅外光譜（生物分子指紋）區(qū)分明膠來源，具有快速、簡便、無損且只需制備少量樣品的優(yōu)點，成為鑒別不同食品中摻假和真?zhèn)螁栴}的有效工具［43］。但FTIR光譜法的數據結果通常需要結合主成分分析（PCA）和化學計量學等現代統(tǒng)計工具進行處理。Cebi等［26］依據由肽鍵的C==O伸縮振動引起的酰胺－Ⅰ吸收帶以及酰胺－Ⅱ吸收帶成功區(qū)分了牛明膠和豬明膠，并成功應用于軟糖的分析［27］；Aloglu等［28］結合模糊的多元規(guī)則建設專家系統(tǒng)（FuRES）和支持向量機（SVM）的分類方法成功區(qū)分了牛、豬和魚明膠。

2.2.5微生物酶法

微生物酶法是利用微生物中天然明膠酶的特異性作用水解豬明膠的一種方法。該方法環(huán)保、快速，可以通過重組或定向進化提高酶活與特異性，但菌種篩選可能不盡人意［56］，需有針對性的采集樣品并通過大量實驗確定培養(yǎng)條件。Shahimi等［57］對可能的產明膠酶菌落進行篩選，并確定了可能與豬明膠特異性水解表達相關的基因序列，重組酶的檢出限為微摩爾（μmol）級。雖未確定特異性水解豬明膠的蛋白酶，但該方法有望成為利用微生物資源鑒定豬明膠的新型方法，并為開發(fā)基于蛋白質的快速試紙條法和生物傳感器提供了參考。

表1～2分別列出了部分基于DNA與基于蛋白質檢測明膠中豬源性成分的方法及特點。

表1 PCR檢測明膠中豬源性DNA的方法Table 1 Detection methods of porcine DNA in gelatin by PCR

表2 基于蛋白質檢測豬源性明膠的方法Table 2 Methods for determination of porcine gelatin based on protein

3 展 望

本文總結了各種分析方法在純明膠樣品和在食品系統(tǒng)中辨別明膠來源的潛力。其中，傅立葉變換紅外光譜（FTIR）、液相色譜－質譜聯用（LC－MS/MS）等理化分析方法為豬明膠的檢測提供了良好的途徑，SDS－PAGE電泳、ELISA和實時熒光PCR等生物學分析方法對豬明膠的檢測具有良好的特異性。未來的研究應進一步探索現代技術對明膠來源進行分類的有效性。此外，為提高清真產品鑒定中明膠分析的精密度和準確度，今后應進一步將兩種或兩種以上分析方法聯合應用；同時應探索新的快速和非破壞性的方法，如生物傳感器、高光譜成像技術［58］和化學成像方法［59－60］。