高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)牙膏中19種合成著色劑

石興紅，羅金梅，楊淡梅，符秋美，邱穎姮，鄔曉鷗，王曉煒

（深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000）

牙膏是由摩擦劑、保濕劑、增稠劑、發(fā)泡劑、芳香劑、水和其他添加劑為主要原料混合組成的膏狀物質(zhì)［1］，具有清潔口腔、防齲、抑牙菌斑、抗牙本質(zhì)敏感、減輕牙齦問(wèn)題等功能，是人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?。牙膏中的著色劑主要起改善產(chǎn)品感觀、提升使用者體驗(yàn)的作用，尤其是兒童牙膏，鮮艷的顏色更容易吸引孩子們的注意。由于兒童刷牙過(guò)程中可能存在吞咽現(xiàn)象，其安全風(fēng)險(xiǎn)因素尤需高度關(guān)注。

著色劑按來(lái)源可分為無(wú)機(jī)著色劑、天然著色劑和合成著色劑三大類，牙膏中常見的著色劑以合成著色劑為主，如食品紅12、食品黃4、食品藍(lán)2等［2］。合成著色劑具有色調(diào)多、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在食品加工業(yè)和化妝品中被廣泛應(yīng)用；但合成著色劑主要以苯、甲苯、萘等芳烴類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過(guò)磺化、鹵化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成，長(zhǎng)期或過(guò)量使用可能引起瘙癢、疼痛等不良反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至影響肝腎功能、產(chǎn)生遺傳毒性和致癌性等危害人類健康［3－4］，因此，我國(guó)《化妝品技術(shù)規(guī)范》（2015年版）（以下簡(jiǎn)稱《規(guī)范》）對(duì)合成著色劑的使用范圍及使用量都有明確規(guī)定［5］。我國(guó)《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例》第77條指出：“牙膏參照本條例有關(guān)普通化妝品的規(guī)定進(jìn)行管理”［6］。目前食品、化妝品中著色劑的檢測(cè)方法已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道［7－18］，涉及的方法包括高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）等，但牙膏中著色劑的檢測(cè)鮮有報(bào)道。為此，本文建立了HPLC同時(shí)測(cè)定牙膏中食品黃4等19種準(zhǔn)用合成著色劑的檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于牙膏中常用合成著色劑的定性與定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Alliance 2695－2998高效液相色譜儀，帶二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；XS105DU電子天平、S20酸度計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）；VORTEX 3 S025渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；BDA-1002超聲波清洗器（深圳波達(dá)超聲波清洗設(shè)備有限公司）；EBA21離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）。

19種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品：食品黃4（Food Yellow 4，CI 19140）、食品紅9（Food Red 4，CI 16185）、食品藍(lán)1（Food Blue 1，CI 73015）、食品紅7（Food Red 7，CI 16255）、食品黃3（Food Yellow 3，CI 15985）、酸性橙6（Acid Orange 6，CI 14270）、食品紅17（Food Red 17，CI 16035）、食品紅1（Food Red 1，CI 14700）、食品綠3（Food Green 3，CI 42053）、酸性紅87（Acid Red 87，CI 45380）、食品藍(lán)2（Food Blue 2，CI 42090）、酸性黃73（Acid Yellow 73，CI 45350）、食品紅14（Food Red 14，CI 45430）、酸性橙7（Acid Orange 7，CI 15510）、酸性紅92（Acid Red 92，CI 45410）、食品藍(lán)5（Food Blue 5，CI 42051）購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；食品黑2（Food Black 2，CI 27755）購(gòu)自美國(guó)IL公司；酸性黃1（Acid Yellow 1，CI 10316）購(gòu)自日本TCI公司；食品紅12（Food Red 12，CI 17200）購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司。

甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司），乙酸銨（HPLC級(jí)，美國(guó)Acros公司），甲酸（色譜純，上海Macklin公司），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。25批牙膏樣品均為市售品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件色譜柱：Agilent eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A為20 mmol/L乙酸銨溶液（pH 6.0），B為乙腈；流速為0.7 mL/min。梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，5%B；2.0～4.0 min，5%～13%B；4.0～9.0 min，13%～14.5%B；9.0～10.0 min，14.5%～20%B；10.0～15.0 min，20%～25%B；15.0～24.5 min，25%～35%B；24.5～25.0 min，35%～75%B；25.0～29.0 min，75%B；29.0～30.0 min，75%～5%B；30.0～40.0 min，5%B；進(jìn)樣量：5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：430、480、520、620 nm。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別取各著色劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，精密稱量，分別置于10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（按純度換算），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密吸取1 mL單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一20 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用10%甲醇溶液配制成各標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為1、5、12.5、25、35和50 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3樣品前處理稱取樣品1.0 g（精確至0.1 mg），置于10 mL具塞比色管中，加入4 mL水，在渦旋混合器上高速振蕩，使樣品分散；加入1.0 mL甲醇進(jìn)行消泡處理，繼續(xù)加入水至9 mL，渦旋混勻，超聲提取10 min，冷卻至室溫（若仍有氣泡，可滴加少量甲醇進(jìn)行消泡處理），用水定容至10 mL，以10 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.45μm微孔聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過(guò)濾，濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～800 nm范圍內(nèi)對(duì)19種著色劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描。結(jié)果表明，上述19種著色劑在紫外光區(qū)（254 nm左右）和可見光區(qū)均有較強(qiáng)吸收，在254 nm易受牙膏樣品中防腐劑色譜峰的干擾，故選用各化合物的可見光區(qū)特征吸收峰作為檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)各著色劑的最大吸收波長(zhǎng)，確定了19種著色劑的檢測(cè)波長(zhǎng)（見表1）。經(jīng)驗(yàn)證，19種著色劑在相應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)下，無(wú)干擾且響應(yīng)值高，方法特異性好。不同檢測(cè)波長(zhǎng)下19種合成著色劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mg/L）的液相色譜圖如圖1所示。

圖1 19種合成著色劑在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的液相色譜圖（5 mg/L）Fig.1 HPLC chromatograms of 19 kinds of synthetic colorants at different detection wavelengths（5 mg/L）

2.1.2色譜柱的選擇選擇常用的十八烷基鍵合硅膠色譜柱進(jìn)行液相分離，實(shí)驗(yàn)比較了Agilent zorbax SB－C18柱和Agilent eclipse XDB－C18柱對(duì)19種準(zhǔn)用著色劑的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩根色譜柱的分離效果相當(dāng)，但色譜柱填料是否封端對(duì)部分著色劑（食品紅9、食品紅7和食品綠3）的峰形影響較大，選用經(jīng)過(guò)封端的Agilent eclipse XDB－C18柱更合適。

2.1.3流動(dòng)相的選擇由于19種合成著色劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)有較大差異，包括有偶氮染料、噸染料和三芳甲烷染料等，但大部分著色劑均含磺酸根強(qiáng)陰離子。這些化合物與固定相之間可能存在離子相互作用和非極性吸附的雙重作用，要獲得理想的分離效果和良好的峰形，流動(dòng)相中乙酸銨濃度和pH值選擇非常重要。

考察了不同乙酸銨溶液濃度（10、20、30、50 mmol/L）對(duì)19種合成著色劑色譜保留行為的影響。結(jié)果表明，在相同色譜條件下，乙酸銨溶液濃度對(duì)大多數(shù)合成著色劑的分離效果影響不大，但乙酸銨溶液濃度為20 mmol/L時(shí)，食品黃3和酸性黃1、食品綠3和酸性紅87、酸性黃73及食品紅14的分離效果更佳，因此實(shí)驗(yàn)選定乙酸銨的最佳濃度為20 mmol/L。

采用乙腈－20 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，考察了pH值分別為4.5、5.0、5.5和6.0時(shí)，對(duì)19種合成著色劑色譜保留行為和峰形的影響。結(jié)果顯示，pH 6.0時(shí)，19種化合物達(dá)到基線分離且峰形較好；隨著酸度的增加，部分化合物在色譜柱上的保留增強(qiáng)，導(dǎo)致一些化合物出峰順序改變，不僅色譜峰重疊，分離效果差，同時(shí)存在嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象；因此，乙酸銨溶液以pH值6.0為宜。此外，考察了用甲酸和乙酸作為酸度調(diào)節(jié)劑時(shí)各化合物色譜峰的分離效果，發(fā)現(xiàn)采用甲酸的效果優(yōu)于乙酸。

2.1.4柱溫的選擇溫度變化可改變目標(biāo)化合物在流動(dòng)相和固定相間的分配系數(shù)，實(shí)驗(yàn)比較了柱溫分別為25、30、35、40℃時(shí)對(duì)19種合成著色劑分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，各化合物的保留時(shí)間相對(duì)縮短，酸性黃73的變化最為明顯。當(dāng)柱溫達(dá)到35℃，19種著色劑的分離效果最佳。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

19種合成著色劑的理化性質(zhì)相似，易溶于水，可用水直接提??；由于牙膏中含有發(fā)泡劑（普遍使用的是月桂醇硫酸鈉），直接用水提取，發(fā)泡劑影響樣品分散及定容，需加入甲醇進(jìn)行消泡處理。實(shí)驗(yàn)直接使用5%、10%、20%、25%、50%甲醇溶液提取，結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇溶液濃度高于20%時(shí)，溶劑效應(yīng)導(dǎo)致食品黃4和食品紅9分解成2個(gè)色譜峰，回收率下降。為了確保樣品提取完全及定容準(zhǔn)確，樣品先用水進(jìn)行分散提取，再加入少量甲醇進(jìn)行消泡后定容，并控制最終提取溶液中甲醇含量低于20%。

此外，還比較了不同超聲提取時(shí)間（5、10、15、20 min）對(duì)陽(yáng)性樣品中目標(biāo)化合物提取效率的影響。結(jié)果表明，超聲提取時(shí)間超過(guò)10 min后提取效率不再增加，故選擇10 min為最佳超聲提取時(shí)間。

2.3 線性范圍、檢出限與定量下限

取“1.2.2”系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1可知，19種組分在1～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。稱取1.0 g空白樣品，加入不同濃度的待測(cè)組分，按“1.2.3”處理后進(jìn)樣，以各待測(cè)化合物的信噪比（S/N）分別計(jì)算得出方法檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）。結(jié)果顯示：19種著色劑的LOD和LOQ分別為0.3～2.6μg/g和0.9～8.6μg/g（見表1）。方法的靈敏度能滿足目前的檢測(cè)要求。

表1 19種合成著色劑的檢測(cè)波長(zhǎng)、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限及定量下限Table 1 Detection wavelengths，linear equations，linear ranges，correlation coefficients（r），LODs and LOQs of 19 synthetic colorants

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取空白樣品1.0 g，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其含量分別為25μg/g和400μg/g，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6份，按“1.2.3”所述方法進(jìn)行處理并測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。19種著色劑的回收率為95.2%～103%，RSD（n=6）均小于5%，表明方法具有較好的準(zhǔn)確度及精密度。

表2 牙膏中19種著色劑的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Average recoveries and RSDs of 19 colorants spiked in toothpaste

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

用所建立的測(cè)定方法對(duì)市售25批牙膏進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中各化合物的保留時(shí)間及紫外-可見吸收光譜圖進(jìn)行定性定量分析，陽(yáng)性樣品的色譜圖見圖2，檢測(cè)結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)顯示：有7批樣品檢出食品藍(lán)2，含量范圍為1.1～17.8μg/g；有4批樣品檢出食品黃4，含量范圍為4.8～31.1μg/g；有4批檢出食品黃3，含量范圍為2.6～25.5μg/g；有1批樣品同時(shí)檢出食品黃4、食品藍(lán)2和食品黃3；有3批樣品分別檢出食品紅12、食品綠3和酸性紅92，含量分別為4.5、1.1、55.3μg/g；其他著色劑未檢出。

圖2 牙膏樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of positive toothpaste samples

表3 實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果（μg/g）Table 3 Test results of real samples（μg/g）

（續(xù)表3）

3 結(jié) 論

本研究建立了HPLC測(cè)定牙膏中19種合成著色劑的檢測(cè)方法，可有效排除牙膏基質(zhì)干擾，并通過(guò)優(yōu)化色譜條件，使19種著色劑在26 min內(nèi)能得到良好的分離，在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定，提高了各成分的靈敏度。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于牙膏中著色劑的檢測(cè)；其推廣應(yīng)用對(duì)牙膏中準(zhǔn)用著色劑的安全監(jiān)管具有積極意義。