在線凈化/液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法快速篩查水產(chǎn)品中123種獸藥殘留

歐陽少倫，藍 草，陳文銳，安文佳，林 峰，莊燕君

（廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623）

隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，工業(yè)污水和環(huán)境污染日益嚴重，加之一些地區(qū)養(yǎng)殖密度過高，飼料質量差，致使水生生物抵抗力低、發(fā)病率增加。為了治療和預防各種病害、提高產(chǎn)量效益，水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程中存在誤用、濫用各種藥物的情況，主要包括三苯甲烷類染料、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類等。人們長期食用含漁藥殘留的水產(chǎn)品，藥物易在人體內(nèi)蓄積，可能會產(chǎn)生致畸、致癌的嚴重危害［1］，有些漁藥殘留會間接增強人體病原菌的耐藥性，增加治療難度。因此，世界各國對水產(chǎn)品中的獸藥殘留限量做了嚴格規(guī)定［2］。

目前對水產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測方法主要以氣相色譜法（GC）［3－4］、液相色譜法（HPLC）［5－6］、氣相色譜－質譜法（GC－MS）［7－8］、液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用法（LC－MS/MS）［9－12］、液相色譜－飛行時間質譜法（LC－TOF MS）［13－14］和液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法（LC－HRMS）［15－16］為主。但現(xiàn)有研究檢測的藥物種類單一，前處理凈化步驟較多，高通量檢測仍具有一定的局限性。水產(chǎn)品中獸藥殘留檢測已趨向多種類、高通量發(fā)展［17］，目前已有文獻報道了牛奶［18－19］、飼料［20］、豬肉［21］等基質中獸藥殘留的測定方法，但在水產(chǎn)品中獸藥多殘留高通量快速篩查方面的研究鮮有報道。

在線凈化技術TurboFlow主要通過擴散溶解、體積排阻等手段達到凈化目的，比傳統(tǒng)的固相萃取和基質分散萃取更具優(yōu)勢，已在食品領域得到了較好的應用［22－23］。本文建立了在線凈化/液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜高通量篩查水產(chǎn)品中123種獸藥殘留的方法，包括20種磺胺類、6種大環(huán)內(nèi)酯類、16種喹諾酮類、12種β-激動劑、17種苯并咪唑類、4種四環(huán)素類、2種鎮(zhèn)靜劑、6種激素、4種β-內(nèi)酰胺類、1種氨苯砜、2種抗球蟲藥、2種染料、24種糖皮質激素、1種氯霉素、6種雷索酸內(nèi)酯類。該方法前處理簡單，結果準確，適用于大批量水產(chǎn)品中多種獸藥殘留的快速篩查。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇、丙酮、異丙醇（HPLC級，F(xiàn)isher Scientific公司）；甲酸（分析純，Merck公司）；所用試劑除注明外均為分析純，實驗用水為超純水。123種化合物的標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司、德國Witega公司、美國Sigma公司、北京振翔公司、中國食品藥品檢定研究院、上海安譜公司，純度為91.2%～99.9%。

Transcend TLX在線凈化液相色譜Q－Exactive靜電場軌道阱質譜分析系統(tǒng)（由雙流路大體積大容量自動進樣器、1個低壓四元泵、1個高壓二元泵和Q－Exactive－Orbitrap質譜儀組成，美國Thermo Fisher公司）。Milli－Q超純水器（美國Millipore公司）；CPA22SD分析天平、BT 124S分析天平（Sartorius公司）；SiGMA 1－14高速離心機（德國Sigma公司）；MS3 basic旋渦振蕩器（IKA公司）；Promax 2020水平振蕩器（德國Heidolph公司）；S300H超聲波水?。ǖ聡鳨lma公司）。

數(shù)據(jù)處理軟件：TraceFinder EFS、Xcalibur、Aria均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 標準溶液配制

稱取10 mg標準品，分別用甲醇、乙腈或水等溶劑溶解并定容至10 mL，配制為1 mg/mL的單標儲備液，置于－18℃保存。使用時根據(jù)需要將化合物分組用甲醇進行混合或稀釋，所有稀釋液均置于4℃下避光保存。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件在線凈化程序主要為凈化和分離過程，凈化過程（TFC）由上樣泵驅動凈化流動相在TurboFlow柱上完成，分離過程（LC）由分離泵驅動分析流動相在分析柱上完成。整個程序通過切換2個六通閥使流路改變，實現(xiàn)在線凈化富集。

TurboFlow凈化柱：CycloneTMP（0.5 mm×50 mm，Thermo Fisher Scientific公司），凈化泵流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇，C為乙腈，D為丙酮∶異丙醇∶乙腈（20∶40∶40，體積比）。柱溫：室溫，進樣量：50μL。

色譜柱：Atlantis T3（100 mm×4.6 mm，3μm，Waters公司）；柱溫：35℃。流動相：正離子檢測和負離子檢測（糖皮質激素）時，A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；負離子檢測（除糖皮質激素外）時，A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 在線凈化梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of TurboFlow on-line cleanup

1.3.2質譜條件Q－Exactive－Orbitrap質譜儀（美國Thermo Fisher公司），配有電噴霧離子源（ESI）。正或負離子化模式；掃描范圍：m/z100～1 000；一級全掃描分辨率：R=70 000；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：7 arb；毛細管溫度：320℃；包含列表：on；離子最大容納數(shù)量：1e6；離子最大注入時間：100 ms；二級離子全掃描分辨率：17 500；歸一化碰撞能量：20%、40%、60%。其他質譜信息見表2。

表2 123種獸藥的名稱、分子式、部分質譜參數(shù)和定量下限Table 2 Names，formulas，some MS parameters and LOQs of 123 veterinary drugs

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

1.4 樣品前處理

稱取5 g均質樣品（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入7.5 mL乙腈－水（8∶2，體積比，下同）溶液，渦旋1 min，超聲15 min，水平振蕩15 min，以4 500 r/min離心5 min，上清液轉移至50 mL離心管中；殘渣再加入7.5 mL乙腈－水（8∶2）溶液，用玻棒搗碎下層殘渣，水平振蕩15 min，以4 500 r/min離心5 min，上清液合并于50 mL離心管中混勻，取適量樣液經(jīng)0.2μm濾膜過濾后上機測定。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

實驗對比了乙腈－水（8∶2）溶液、乙腈和1%乙酸乙腈3種提取溶劑對目標化合物的提取效率。結果表明，乙腈對大部分目標分析物的提取效果好，且能有效地沉淀樣品中的蛋白質，但部分目標分析物（如β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類藥物）的極性較大，提取劑中需加入水才能得到較好的提取效率；而喹諾酮類藥物在弱酸性條件下的提取效率更高。對于苯并咪唑類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等獸藥，上述3種提取溶劑均有很好的提取效率，其中乙腈－水（8∶2）溶液的提取效率略高；倍他米松、地塞米松、可的松醋酸醋和潑尼松龍醋酸酯在乙腈中的提取效率很低，可的松醋酸酯和潑尼松龍醋酸酯采用1%乙酸乙腈時的提取效率極低；對于噴布特羅、萊克多巴胺、苯氧丙酚胺、馬布特羅、溴代克侖特羅、馬噴特羅、溴布特羅、四環(huán)素類，以乙腈為提取溶劑時的提取效率很低，乙腈－水（8∶2）溶液的提取效率略高于1%乙酸乙腈。綜合考慮目標分析物的檢測濃度水平和提取效率，本實驗采用乙腈－水（8∶2）溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

水產(chǎn)品本底復雜，會帶入脂肪、類脂及其它干擾組分。目前的在線凈化技術主要分為兩類：一類是簡單的SPE柱，可去除部分樣品雜質，但不能有效去除脂類物質，需要額外的離線去除脂肪步驟；另一類是在線凈化，凈化柱可同時去除脂肪等類脂類物質，樣品無需額外的離線去除脂肪步驟。本研究采用的TurboFlow技術屬于第二類在線凈化技術，流路示意圖見圖1。

圖1 TurboFlow整體流路示意圖Fig.1 Schematic diagram of overall velocity path of TurboFlow

TurboFlow色譜柱由50～100μm大粒徑填料填充而成，具有體積排阻作用和化學作用力。當使用大流速時（如2 mL/min），流動相在色譜柱內(nèi)形成湍流，在高流速下小分子化合物有足夠的時間快速擴散進入柱填料顆粒表面的小孔中，通過與填料表面的鍵合相相互作用保留在色譜柱上；保留較弱的小分子干擾物排出色譜系統(tǒng)（例如磷脂、鹽類、糖類），而大分子化合物（主要為蛋白）由于擴散速度慢而沒有足夠的時間擴散到填料表面或內(nèi)部，故不能保留在色譜柱上而被直接沖至廢液中。TurboFlow技術可實現(xiàn)一次性去除樣品中的磷脂、鹽類、蛋白等干擾物，實現(xiàn)快速高效的分離凈化。其在線凈化過程主要包括上樣、洗脫轉移和條件化3個步驟。本研究分別對TurboFlow的上柱條件、洗脫條件和凈化柱類型進行了優(yōu)化。

2.2.1上柱條件的優(yōu)化采用不接分析柱，分流進質譜方式優(yōu)化上柱條件。分別考察了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液－乙腈（98∶2）、0.1%甲酸水溶液－乙腈（95∶5）、0.1%甲酸水溶液－乙腈（90∶10）、0.1%甲酸水溶液－乙腈（75∶25）5種上柱溶劑對分析物保留的影響。結果表明：當有機相比例增至2%時，分析物在上柱步驟有不同程度的損失，隨著有機相比例的增加，分析物的損失不斷增大，在凈化柱的保留程度越低。因此，實驗采用0.1%甲酸水溶液作為上柱溶劑。

2.2.2洗脫條件的優(yōu)化采用0.1%甲酸水溶液分別配制25%乙腈、50%乙腈、75%乙腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和100%甲醇作為洗脫溶劑，考察了各類代表性藥物在不同洗脫溶劑下的回收率。結果表明，當洗脫溶劑的有機相比例高于水相時，由于有機溶劑比例過高導致溶劑不匹配，大部分物質的色譜峰前延嚴重或開叉。比較有機溶劑比例較低的4個洗脫條件發(fā)現(xiàn)，除了噻苯噠唑、克林霉素、乙?；前?、磺胺間甲氧嘧啶和氯羥吡啶等獸藥，乙腈對其他大部分目標分析物的洗脫能力優(yōu)于甲醇。除了糖皮質激素類，25%乙腈對大部分目標分析物的洗脫效果優(yōu)于50%乙腈。綜合考慮，選擇25%乙腈作為洗脫溶劑。

2.2.3在線凈化柱的選擇由于目標分析物大部分為極性或中等極性，實驗對比了反相苯基鍵合硅膠CycloneTMP柱（0.5 mm×50 mm）和鍵合硅膠C18凈化柱（0.5 mm×50 mm）對目標分析物的回收率。采用樣品空白基質配制質量濃度為10μg/L的混合標準溶液上樣，基質匹配標準曲線進行定量，部分代表性化合物的回收率見圖2。結果表明，多數(shù)目標分析物在CycloneTMP柱上的保留更好。綜合考慮，選擇CycloneTMP作為凈化柱。

圖2 代表性藥物在CycloneTM P和C18柱上的回收率Fig.2 Recoveries of representative drugs on Cyclone TM P and C18 columns

2.3 藥物的定性分析

采用Full Scan/ddMS2模式對123種化合物進行掃描，獲得目標物的保留時間、母離子及二級質譜圖等信息。采用mzVault軟件建立標準二級譜庫，每種目標物包含多個特征離子，結合化合物的結構、裂解原理選擇相對豐度較高的2個離子作為特征碎片離子，見表2。通過Exactfinder軟件導入包含化合物名稱、分子式、精確質量數(shù)、保留時間和特征碎片的表格，并通過Librarymanager軟件導入二級質譜圖，建立了定性篩查數(shù)據(jù)庫。設置篩查參數(shù)要求提取母離子精確質量數(shù)與理論質量數(shù)的相對偏差≤5×10－6，二級碎片離子精確質量數(shù)的相對偏差≤10×10－6，保留時間偏移0.5 min，最小響應為10 000，軟件匹配度不小于90%。

參考《獸藥殘留檢測中質譜方法確證指南》［24］、《食品法典委員會食品中獸藥殘留物的最大殘留限度（MRLs）和風險管理建議》［25］，按照目標分析物的定量下限作為篩查截止?jié)舛冗M行方法試驗，結果表明本篩查方法在截止?jié)舛人缴系募訇幮月剩é抡`差）＜5%，符合歐盟2002/657/EC決議［26］規(guī)定的篩選方法性能指標要求。

2.4 基質效應

通過標準曲線法考察基質效應，分別配制空白基質工作曲線和溶劑標準曲線，按下式計算基質效應（ME）：ME=B/A，A和B分別表示溶劑標準溶液和基質標準溶液中藥物的峰面積。當ME大于1時，表明存在基質增強效應；當ME小于1時，表明存在基質抑制效應；當ME等于1時，表明無基質效應或基質效應很弱。結果表明，大部分化合物的ME小于1，存在基質抑制效應。因此，本方法采用樣品空白基質溶液配制標準曲線進行定量檢測。

2.5 方法學驗證

根據(jù)各藥物的檢出限選擇合適質量濃度范圍（0.05～50μg/L）配制基質標準曲線溶液，按本方法進行測定，外標法定量。結果表明，123種藥物在各自質量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，相關系數(shù)（r2）均大于0.99。因目標分析物同時存在禁用和限用藥物，所以本方法的定量下限（LOQ）為各目標分析物的最低加標濃度，123種藥物的LOQ為0.1～50μg/kg（見表2）。以草魚空白樣品為基質，按各藥物的LOQ、2LOQ、10LOQ為加標水平進行回收實驗，各加標水平平行測定6次。結果顯示，123種藥物的回收率為53.7%～129%，相對標準偏差（RSD）為2.7%～19%，方法的準確度和精密度均滿足檢測要求。

2.6 實際樣品檢測

采用本方法對100份水產(chǎn)樣品（包括草魚、鯽魚、黃骨魚、鱸魚、多寶魚等）進行篩查，檢測結果與二級譜庫的匹配度均大于90%，其中有6個樣品檢出氯霉素，8個樣品檢出恩諾沙星，9個樣品檢出氫化可的松，2個樣品檢出氧氟沙星。選取4個代表性陽性樣品，采用不同檢測方法進行確證分析，陽性樣品的檢測結果見表3和圖3。結果表明：陽性結果基本一致，本方法可滿足實際檢測需要。

圖3 氯霉素標準溶液（A）與多寶魚陽性樣品（B）的譜圖Fig.3 Spectra of chloramphenicol standard（A）and a turbot positive sample（B）

表3 不同方法對陽性樣品檢測結果的對比Table 3 Comparison of different detection methods for positive samples

3 結 論

本文建立了可高通量快速篩查水產(chǎn)品中123種藥物殘留的在線凈化/液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術。所建方法的篩查濃度水平能夠滿足水產(chǎn)品中藥物殘留管理要求，有效提高了水產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測水平，對于提高水產(chǎn)品風險監(jiān)測水平具有重要的意義。