垂絲海棠組培快繁體系的建立

許丁帆， 劉艷軍， 張 彤， 黃俊軒， 武春霞， 李建科

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院， 天津 300392)

垂絲海棠(Malushalliana)屬薔薇科(Rosaceae)蘋(píng)果屬(Malus)落葉小喬木，為我國(guó)特有種，花開(kāi)艷麗，花梗柔軟下垂，枝干峭立，樹(shù)形優(yōu)美，且生性強(qiáng)健，對(duì)土壤酸堿性要求不嚴(yán)，廣泛應(yīng)用于園林綠化中，還可作盆花栽培[1]。垂絲海棠還具有一定的食用和藥用功能，其果實(shí)酸甜可食，其花可調(diào)經(jīng)和血，主治血崩[2]。同時(shí)，垂絲海棠也是一種抗寒、耐旱、耐鹽堿、耐缺鐵的蘋(píng)果砧木資源[3-4]。目前，垂絲海棠的繁殖方式主要有種子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖，生產(chǎn)上多采用嫁接繁殖，雖應(yīng)用廣泛，但繁殖效率較低、優(yōu)良性狀難以保存，限制了垂絲海棠優(yōu)樹(shù)選育和規(guī)模化的擴(kuò)繁[5]。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)對(duì)垂絲海棠需求量的不斷增大，利用組培快繁技術(shù)進(jìn)行垂絲海棠繁育，具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)高、后代遺傳穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，還可對(duì)母本的優(yōu)良性狀進(jìn)行保持、提純或復(fù)壯。

垂絲海棠屬木本植物，其組織培養(yǎng)難度較大，目前對(duì)其他海棠品種的組織培養(yǎng)研究較多[6-8]。近年來(lái)，已開(kāi)展一定的垂絲海棠組織培養(yǎng)研究。張慶田等[9]誘導(dǎo)垂絲海棠葉片分化不定芽，對(duì)垂絲海棠組培再生研究取得初步成功；許紀(jì)龍等[10]用帶芽嫩莖作外植體建立了垂絲海棠無(wú)菌繁育體系；張玲玲等[11]研究了垂絲海棠外植體消毒的影響因素、芽誘導(dǎo)啟動(dòng)最適培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)激素濃度組合；許以太等[12]以垂絲海棠當(dāng)年生莖段為外植體，探討不同植物激素對(duì)試管苗增殖以及植株再生的影響。但這些研究中再生體系建立不完善，很多研究仍存在有效增殖系數(shù)低、生根和組培苗移栽方面研究不夠等缺陷。本研究以春梢嫩枝莖段為外植體進(jìn)行垂絲海棠組織培養(yǎng)快速繁殖研究，通過(guò)篩選最適外植體、最佳消毒時(shí)間、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及移栽馴化方法，建立完整高效穩(wěn)定的垂絲海棠組培快繁體系，為垂絲海棠工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自天津市薊州區(qū)天津市海潤(rùn)澤苗木有限公司種植基地的健壯植株，于11月下旬，剪取植株上部無(wú)病蟲(chóng)害的一年生休眠枝條，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室；于翌年6月上旬，剪取植株春梢上端無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)旺盛、腋芽未萌發(fā)的半木質(zhì)化嫩枝，去除葉片和頂芽，保留葉柄，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體消毒

將取回的枝條用流水沖洗1 h后，在超凈工作臺(tái)中，將枝條剪成長(zhǎng)約1.5 cm的帶腋芽莖段，用70%乙醇溶液浸泡30 s，再用含2%有效氯的次氯酸鈉溶液消毒，消毒時(shí)間分別為6、8、10、12、14、16、18 min，期間不斷搖動(dòng)，消毒后用無(wú)菌水清洗3次，無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分，并剪去莖段兩端褐化部分，分別接種至1/2 MS培養(yǎng)基上。每個(gè)消毒時(shí)間處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，重復(fù) 3次，初代培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)外植體污染率、存活率和死亡率。

1.2.2基本培養(yǎng)基篩選

將消毒好的帶兩個(gè)腋芽的嫩枝莖段接種至1/2 MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后，將未污染的外植體移到不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。以MS、1/2 MS、Anderson、B 5、WPM為不同基本培養(yǎng)基，均添加10 mg/L GA3。每處理接種10瓶，每瓶接種4個(gè)莖段，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，觀察莖段腋芽生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)平均腋芽長(zhǎng)度。

1.2.3增殖培養(yǎng)

待垂絲海棠腋芽長(zhǎng)至3.5～4.0 cm高時(shí)，剪取長(zhǎng)約3.0 cm的新梢接種到增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基以WPM為基本培養(yǎng)基，附加一定濃度配比的IAA和BA，探索IAA和BA濃度對(duì)腋芽增殖的影響。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種4個(gè)新梢，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的有效增殖系數(shù)及再生芽生長(zhǎng)情況。

1.2.4生根培養(yǎng)

剪取增殖培養(yǎng)獲得的2.0 cm以上的健壯苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，以WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的IAA或NAA。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種3個(gè)苗，試驗(yàn)重復(fù)3次。30 d后觀察每個(gè)處理的生根情況，統(tǒng)計(jì)生根率、平均根條數(shù)。

1.2.5組培苗移栽與馴化

選取生長(zhǎng)健壯、根系良好的垂絲海棠組培苗，室內(nèi)自然光下馴化煉苗5 d，將無(wú)菌苗取出，自來(lái)水清洗根部殘余培養(yǎng)基，移栽到裝有草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1(體積比)混合基質(zhì)的雙色育苗缽(外徑9 cm，高8 cm)中，基質(zhì)于使用前1周高壓滅菌備用；采用許丁帆等[13]發(fā)明的組培苗移栽保濕裝置培育15 d，后轉(zhuǎn)入室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)，于移栽第30天觀察記錄生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)移栽存活率。

1.2.6培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均采用100 mL廣口三角瓶為容器，每個(gè)三角瓶加入約40 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均添加7.0 g/L瓊脂，20 g/L蔗糖，滅菌前調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0，121 ℃、0.1 MPa下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，24 h光照，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.7計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

存活率(%)=(未污染存活的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

死亡率(%)=(未污染死亡的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

有效增殖系數(shù)=有效芽數(shù)/接種芽數(shù)(有效芽為高度大于1.0 cm的芽)；

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%；

平均根條數(shù)=生根植株的總根數(shù)/生根植株數(shù)；

移栽成活率(%)=(成活苗數(shù)/移栽苗數(shù))×100%；

采用Excel 2013軟件和SPSS Statistic 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)不同時(shí)期外植體消毒效果的影響

由表1可知，不同時(shí)期的外植體在外植體消毒效果上存在明顯差異。以一年生休眠枝條莖段為外植體時(shí)，外植體污染率雖隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低(外植體污染率最低為65.56%)，但仍處于較高水平的污染；

表1 不同外植體在不同消毒時(shí)間下的消毒效果

延長(zhǎng)外植體消毒時(shí)間，污染率未見(jiàn)顯著降低，而死亡率增高，過(guò)長(zhǎng)的消毒時(shí)間會(huì)導(dǎo)致外植體褐化死亡，存活率降低，說(shuō)明垂絲海棠一年生休眠枝條莖段不是外植體消毒的理想材料。當(dāng)以春梢嫩枝莖段為外植體時(shí)，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體污染率顯著下降，而外植體存活率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而呈先上升后下降趨勢(shì)，外植體死亡率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高。當(dāng)采用次氯酸鈉消毒春梢嫩枝莖段12 min時(shí)，外植體存活率最高達(dá)96.67%，顯著高于其他處理，且此時(shí)污染率與死亡率均較低；延長(zhǎng)外植體消毒時(shí)間，外植體存活率顯著降低，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此，采用春梢嫩枝莖段為外植體，并以2%有效氯次氯酸鈉溶液消毒處理12 min，外植體消毒效果最佳。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)垂絲海棠生長(zhǎng)的影響

由表2可知，在添加10 mg/L GA3的不同基本培養(yǎng)基上莖段腋芽均能萌發(fā)，但不同基本培養(yǎng)基上腋芽生長(zhǎng)情況明顯不同。在Anderson培養(yǎng)基上莖段腋芽萌發(fā)率最高，但腋芽生長(zhǎng)情況較差，平均腋芽高度低。在Anderson和1/2 MS培養(yǎng)基上，腋芽萌后可生長(zhǎng)一段時(shí)間，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，再生芽也逐漸停止生長(zhǎng)，并出現(xiàn)生長(zhǎng)點(diǎn)死亡的現(xiàn)象，不適合垂絲海棠生長(zhǎng)。在MS和B 5培養(yǎng)基上，腋芽萌發(fā)率、平均腋芽高度均較低，且腋芽萌發(fā)展葉后基本停止生長(zhǎng)，說(shuō)明這兩種培養(yǎng)基不適合垂絲海棠生長(zhǎng)。在WPM培養(yǎng)基上，莖段腋芽萌發(fā)后生長(zhǎng)健壯，葉色淡綠；平均腋芽高度最高，顯著高于其他基本培養(yǎng)基；腋芽萌發(fā)率也較高，為89.17%，與Anderson培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)率無(wú)顯著差異。因此，WPM培養(yǎng)基適合垂絲海棠生長(zhǎng)。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)垂絲海棠腋芽萌發(fā)與生長(zhǎng)的影響

2.3 不同植物激素處理組合對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

由表3可知，在試驗(yàn)不同激素處理組合上，垂絲海棠均可增殖，但增殖方式不同。具體來(lái)看，在不添加激素的WPM培養(yǎng)基上，外植體上有少數(shù)腋芽直接萌發(fā)成芽，再生芽生長(zhǎng)正常，但增殖系數(shù)較低。培養(yǎng)基中添加一定濃度IAA后，增殖系數(shù)顯著提高，且隨著IAA濃度的增加而提高；添加0.5 mg/L IAA時(shí)，多數(shù)腋芽萌發(fā)并正常生長(zhǎng)；添加1.0 mg/L IAA時(shí)，腋芽直接萌發(fā)，但生長(zhǎng)速度較快，導(dǎo)致莖細(xì)弱，不利于后續(xù)試驗(yàn)。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的分裂素BA，外植體腋芽部位出現(xiàn)芽叢，但芽叢上再生芽生長(zhǎng)速度緩慢，有效增殖系數(shù)低，多數(shù)再生芽不能正常生長(zhǎng)；且BA濃度為1.0 mg/L 時(shí)，芽叢上部分再生芽玻璃化，單獨(dú)使用BA不能獲得理想的增殖效果。當(dāng)IAA和BA配合使用時(shí)，外植體腋芽部位出現(xiàn)芽叢；當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/LIAA和0.5 mg/L BA時(shí)，有效增殖系數(shù)最高，但再生芽生長(zhǎng)緩慢，部分再生芽頂端玻璃化。因此，理想的垂絲海棠增殖培養(yǎng)基為：WPM+0.5 mg/L IAA。

表3 不同濃度IAA和BA對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

2.4 生長(zhǎng)素種類及濃度對(duì)組培苗生根的影響

由表4可知，在不加生長(zhǎng)素的WPM培養(yǎng)基上，垂絲海棠的生根率和平均根條數(shù)較低，根細(xì)長(zhǎng)，根毛少，生長(zhǎng)緩慢。在WPM培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素對(duì)誘導(dǎo)生根有顯著的影響，但不同的生長(zhǎng)素對(duì)生根的影響效果不同。培養(yǎng)基中添加IAA，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根生長(zhǎng)緩慢，且根粗短、肉質(zhì)，無(wú)根毛，這種根一般不具備主動(dòng)吸收功能，不利于后續(xù)移栽試驗(yàn)。而在培養(yǎng)基中添加NAA時(shí)，不同濃度水平下垂絲海棠生根率和平均根條數(shù)差異顯著；添加0.25 mg/L NAA時(shí)，組培苗生根率、平均根條數(shù)最高，生根率為92.22%，平均根條數(shù)為5.84條，顯著高于其他處理下的生根率與平均根條數(shù)，且根粗壯，根毛多，生長(zhǎng)速度較快；但增加NAA使用濃度后，組培苗生根率、平均根條數(shù)降低，根毛逐漸變少，在根莖處會(huì)形成愈傷組織。因此，垂絲海棠最佳生根培養(yǎng)基配方為WPM+0.25 mg/L NAA。

表4 不同生長(zhǎng)素種類及濃度對(duì)組培苗生根的影響

2.5 組培苗移栽馴化

共選取90株生長(zhǎng)健壯、根系良好的垂絲海棠組培苗，室內(nèi)自然光下馴化煉苗5 d后，移入草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1(體積比)的混合基質(zhì)中培養(yǎng)，移栽30 d后有86株垂絲海棠長(zhǎng)勢(shì)良好，其移栽成活率為95.56%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)外植體消毒、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和馴化移栽等關(guān)鍵技術(shù)的研究，建立垂絲海棠組培快繁體系。以垂絲海棠生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年春梢莖段為外植體，70%酒精30 s+2%次氯酸鈉消毒12 min，接種至WPM+10 mg/L GA3上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)；待腋芽萌發(fā)，剪取新梢接種至WPM+0.5 mg/L IAA上進(jìn)行增殖培養(yǎng)獲得再生芽；剪取再生芽于WPM+0.25 mg/L NAA上生根；生根后自然光下馴化煉苗5 d，移栽到草炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1(體積比)的消毒基質(zhì)中，移栽成活率可達(dá)95.56%。本試驗(yàn)結(jié)果為垂絲海棠工廠化育苗及后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

外植體消毒是建立組織培養(yǎng)快繁體系的第一步。試驗(yàn)以垂絲海棠莖段為外植體，分別選取一年生休眠枝條莖段和當(dāng)年春梢嫩枝莖段進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，以春梢嫩枝莖段為外植體，并以70%酒精30 s結(jié)合2%次氯酸鈉溶液消毒處理12 min，其消毒效果理想。這可能與外植體的帶菌狀況與生理狀態(tài)有關(guān)，冬季休眠枝中內(nèi)源微生物較多，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，消毒相對(duì)困難；而6月上旬植株生長(zhǎng)時(shí)間短，自身和表面帶菌少，且細(xì)胞活性強(qiáng)，消毒相對(duì)容易。同時(shí)，前人建立垂絲海棠無(wú)菌體系均以升汞為消毒劑，雖然升汞消毒效果較好，但由于升汞具有較大的毒性，使用受到管控，目前已較少使用。本試驗(yàn)以低毒、環(huán)保的次氯酸鈉溶液作為消毒劑，得到了替代升汞且污染率、死亡率較低，存活率較高的消毒方法。

基本培養(yǎng)基提供了植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)元素，但因?yàn)楦鞣N植物的遺傳特性、生物學(xué)特性和生態(tài)學(xué)特性不一致，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求各不相同，甚至同種間不同品種對(duì)基本培養(yǎng)基的需求也不相同[14-15]。MS通用培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用，但這并不能說(shuō)明MS培養(yǎng)基適用于所有植物。有研究表明，MS對(duì)木本植物有一定的毒害作用；一般速生樹(shù)種宜用高鹽培養(yǎng)基，慢生樹(shù)種需要適當(dāng)降低鹽濃度[16-17]。本試驗(yàn)以MS、1/2 MS、Anderson、B 5、WPM五種植物常用基本培養(yǎng)基，研究不同基本培養(yǎng)基對(duì)垂絲海棠腋芽萌發(fā)與生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，WPM培養(yǎng)基適合垂絲海棠生長(zhǎng)，這與張玲玲等[11]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明低鹽濃度培養(yǎng)基更適合用于垂絲海棠腋芽啟動(dòng)萌發(fā)與生長(zhǎng)。

一般認(rèn)為，植物器官的分化取決于內(nèi)源激素的平衡，外源激素通過(guò)改變內(nèi)源激素的平衡而產(chǎn)生作用，外加的細(xì)胞分裂素及生長(zhǎng)素達(dá)到一定的濃度和比例，才使器官發(fā)生達(dá)到預(yù)期目的[18]。本試驗(yàn)在垂絲海棠增殖培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)2種增殖方式：通過(guò)腋芽產(chǎn)生叢生芽或腋芽直接萌發(fā)成芽。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用外源生長(zhǎng)素IAA垂絲海棠增殖方式為腋芽直接萌發(fā)成芽；而單獨(dú)使用外源分裂素BA或IAA與BA配合使用時(shí)，垂絲海棠通過(guò)腋芽產(chǎn)生叢生芽進(jìn)行增殖，這與蔡文博等[19]認(rèn)為，生長(zhǎng)素類物質(zhì)在2種方式中均是必需的結(jié)論不一致，可能是外植體的內(nèi)源激素水平不一致，而與其認(rèn)為細(xì)胞分裂素類物質(zhì)在促發(fā)叢生芽的方式中是必需的，但在腋芽萌發(fā)成新梢中不是必需的結(jié)論相一致。試驗(yàn)選擇以腋芽直接萌發(fā)成芽的方式進(jìn)行增殖，雖然增殖系數(shù)相對(duì)較低，但大多數(shù)再生苗生長(zhǎng)健壯，可直接進(jìn)行生根培養(yǎng)。因此，從組培效率看，腋芽直接萌發(fā)成芽的增殖方式效率更高，并且在一定程度上保證了垂絲海棠在組培快繁過(guò)程中的遺傳性狀的穩(wěn)定性。