響應(yīng)面法優(yōu)化大花海棠不定芽誘導(dǎo)技術(shù)研究

翟懿銘， 嚴(yán) 瑞， 李林山， 張 黎

(1.銀川能源學(xué)院， 寧夏 銀川 750100； 2.寧夏大學(xué)， 銀川 750021)

大花海棠(Begoniabenariensis)為秋海棠科秋海棠屬多年生草本花卉[1]，作為園林景點的重要用花，在高溫環(huán)境中生長良好。“比哥”系列是大花海棠雜交一代品種，花期長，花朵碩大，色彩艷麗，在全光照和半陰環(huán)境下均開花良好。目前國內(nèi)對大花海棠“比哥”的研究主要集中在穴盤播種繁殖和扦插生產(chǎn)技術(shù)兩個方面[2-3]。由于大花海棠播種繁殖時種子萌發(fā)率低，生長周期長；扦插易導(dǎo)致觀賞性狀退化，影響生產(chǎn)效益，而組培快繁技術(shù)在花卉生產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用且效果顯著，可以有效解決大花海棠種苗再生以及快速繁殖等問題。

本試驗采用離體培養(yǎng)方法，獲得遺傳性狀一致的植株[4]。目前對大花海棠不定芽的誘導(dǎo)研究未見報道，本研究利用響應(yīng)面回歸分析法[5]，在大花海棠離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對不同植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選與優(yōu)化，開展脫毒苗的不定芽誘導(dǎo)以及快速增殖研究，對大花海棠的后續(xù)規(guī)模化發(fā)展有一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

大花海棠(Begoniabenariensis)“比哥”取自寧夏銀川市花木公司。選取當(dāng)年新抽、無病蟲害、生長健壯的大花海棠頂部帶芽幼嫩莖段作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1外植體滅菌

將大花海棠幼嫩莖段用自來水洗凈，切成2～3 cm的小段， 然后用流水沖洗30～60 min，并用毛筆刷洗表面。用無菌水沖洗4次后置于超凈工作臺，經(jīng)過酒精震蕩與無菌水沖洗后，放入0.1%的升汞中震蕩3～5 min(視材料木質(zhì)化程度)取出用無菌水沖洗4次。最后將莖段取出用手術(shù)刀將材料接觸升汞的部分切除，接入MS培養(yǎng)基。

1.2.2培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基， 調(diào)整pH值為6.4～6.8。培養(yǎng)條件為：溫度(23±1)℃， 在12.75～19.25 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下不定芽誘導(dǎo)和芽增殖的光照時間均為12 h/d。

1.2.3莖段不定芽誘導(dǎo)單因素試驗

以6-BA、NAA、TDZ和2，4-D為響應(yīng)指標(biāo)，采用單因素輪換法依次考察6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L)、TDZ(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)、2，4-D(0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L)、NAA(0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L)。每個處理接種10瓶，每瓶2個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)45 d后觀察記錄發(fā)芽個數(shù)并計算出芽率。

使用LSD檢驗法，對單因素分析來判斷各組間水平的差異性。

1.2.4莖段不定芽誘導(dǎo)優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗設(shè)計與分析進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化(表1)。研究大花海棠“比哥”莖段誘導(dǎo)出不定芽的關(guān)鍵因素， 以獲得芽分化最佳的條件參數(shù)。

表1 大花海棠“比哥”初代不定芽誘導(dǎo)優(yōu)化BBD試驗因素與水平

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及文獻(xiàn)[6]、文獻(xiàn)[7]，在單因素試驗的基礎(chǔ)上篩選出對莖段愈傷誘導(dǎo)不定芽影響最顯著的3個因素(6-BA、TDZ和2，4-D)，并篩選出有效濃度范圍，以出芽率(Y)為響應(yīng)值，以對大花海棠誘導(dǎo)不定芽影響顯著的3個因素：6-BA濃度(X1)、TDZ濃度(X2)和2，4-D濃度(X3)為考察因素。共17組試驗，重復(fù)3次，培養(yǎng)條件見1.2.2。

1.2.5繼代叢芽增殖

根據(jù)CCD設(shè)計原理，因素的取值范圍見表2。

表2 因素水平表(水平賦值表)

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1不同濃度6-BA對大花海棠“比哥”愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

由圖1可知，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時，大花海棠在培養(yǎng)第23天可以誘導(dǎo)出不定芽，出芽率為14.4%。當(dāng)6-BA濃度增加到1.0 mg/L時，不定芽的出芽率最高(24.47%)，此時膨大率達(dá)到最高值(21.54%)，同等條件下出芽天數(shù)所需時間較短(17 d)。原因可能是6-BA濃度越高，出芽率隨之增加，但過高反而抑制了外植體不定芽的萌發(fā)；而且6-BA的添加量決定了不定芽萌發(fā)的時間，6-BA濃度過低或過高同樣影響出芽率。綜上所述，6-BA對大花海棠“比哥”愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的最佳濃度為1.0 mg/L 。

圖1 不同濃度6-BA對大花海棠“比哥”愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

2.1.2不同濃度TDZ對大花海棠愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

由圖2可知,不同濃度的 TDZ對大花海棠不定芽出芽率的影響有極顯著差異。當(dāng)濃度在0.5～1.0 mg/L范圍內(nèi),出芽率與膨大率最高分別達(dá)到22.7%、21.3%,出芽天數(shù)下降至13 d。當(dāng)濃度為1.5 mg/L時組培苗出芽率降至17.3%,愈傷膨大率僅19.7%。說明同等條件下TDZ濃度高于1.0 mg/L會抑制不定芽的誘導(dǎo)。綜上所述,TDZ的最佳濃度為1.0 mg/L。

圖2 不同濃度TDZ對大花海棠“比哥”愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

2.1.3不同濃度的2，4-D對大花海棠增殖倍數(shù)的影響

由圖3可知，2，4-D對大花海棠的出芽率和出芽天數(shù)有顯著影響。當(dāng)濃度為0.3 mg/L時，大花海棠的出芽率最高(26%)，且出芽所需時間較短(25 d)。原因可能是濃度過高或過低都抑制不定芽誘導(dǎo)，從而影響膨大率和出芽時間。當(dāng)濃度為0.5 mg/L時，膨大率由26.8%降至23.1%。綜上所述，2，4-D對大花海棠增殖影響的最佳濃度為0.3 mg/L。

圖3 不同濃度2，4-D對大花海棠“比哥”愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

2.1.4細(xì)胞分裂素NAA對大花海棠增殖倍數(shù)的影響

由圖4可知,隨著NAA濃度的變化，不定芽出芽率存在極顯著差異。在0.1～0.3 mg/L濃度范圍內(nèi)，出芽率和膨大率最高分別達(dá)到12.4%、28.2%，出芽天數(shù)最低為24 d。當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時,組培苗出芽率最高僅15.5% ,愈傷膨大率僅15.2%。說明NAA濃度過高會降低組培苗發(fā)芽率并抑制愈傷膨大，出芽天數(shù)增加。綜上所述,NAA的最佳濃度為0.3 mg/L。

圖4 不同濃度NAA對大花海棠“比哥”愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑組合對大花海棠莖段不定芽誘導(dǎo)的影響

2.2.1Box-Behnken模型的建立

培養(yǎng)1～2周后， 隨著腋芽逐漸膨大，莖段基部出現(xiàn)愈傷化黃綠色塊狀物(圖5)。表3所示的17組試驗中，所有組合均可誘導(dǎo)出芽，其中第6組合誘導(dǎo)率最高，達(dá)81.3%，第17組合誘導(dǎo)率最低，僅為56.8%，兩者相差24.5%。

圖5 大花海棠“比哥”培養(yǎng)14 d后不定芽誘導(dǎo)情況

表3 大花海棠“比哥”不定芽誘導(dǎo)條件優(yōu)化BBD試驗結(jié)果

2.2.2模型擬合與優(yōu)化

運用Design-expert V 11.0.4.0軟件對表5結(jié)果進(jìn)行擬合，得回歸方程：Y=78.52+1.24X1+1.01X2+2.28X3-6.18X1X2-3.15X1X3-2.75X2X3-8.75X12-6.65X22-4.62X32。對上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果表見表4。

表5 不同處理組合叢芽增殖倍數(shù)試驗結(jié)果

由方差分析可知(表4)，3個因素對增殖倍數(shù)影響的主次順序為6-BA>TDZ>2，4-D。其中，所有一次項結(jié)果影響均為極顯著；交互項中X1X2影響極顯著，X1X3、X2X3影響對結(jié)果影響為顯著；X12、X22影響極顯著，X32影響顯著。且顯著性檢驗差異顯著(F=9.89，p<0.05) ；經(jīng)失擬性檢驗不顯著(F=3.18，p>0.1)，擬合情況較好(圖6 A)。

表4 方差分析

故利用解該回歸方程確定3種植物生長調(diào)節(jié)劑最佳互作配比，以芽誘導(dǎo)率為指標(biāo)解回歸方程得最佳濃度：X1=1.92 mg/L，X2=0.76 mg/L，X3=0.25 mg/L。

2.2.3響應(yīng)分析

由圖7可知，6-BA濃度不變，隨著TDZ和2，4-D的增大，誘導(dǎo)率整體趨勢呈先增加后降低；等高線呈閉合的橢圓形且響應(yīng)面凸起，表明TDZ和2，4-D交互作用較強(qiáng)且有最大值。當(dāng)固定2，4-D時，隨著TDZ和6-BA的增大，誘導(dǎo)率呈先增后降的趨勢；響應(yīng)面凸形，表明TDZ和6-BA交互作用最大。當(dāng)固定TDZ時，隨著2，4-D和6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)率同樣呈拋物線趨勢；等高線為閉合橢圓形且響應(yīng)面為凸形，說明2，4-D用量和6-BA交互作用較強(qiáng)且有最大值。上述分析和表4中顯著性分析結(jié)果一致，且正態(tài)分布合理(圖6 A)，經(jīng)驗證性試驗驗證配比MS+1.03 mg/L TDZ+1.95 mg/L 6-BA+0.26 mg/L 2，4-D， 平均誘導(dǎo)率為82.69%，證明該模型具有可行性(圖6 B)。

圖6 A為殘差概率正態(tài)圖；B為實際與預(yù)測的出芽率線性相關(guān)圖

圖7 莖段誘導(dǎo)不定芽出芽率隨6-BA、TDZ和2，4-D變化的響應(yīng)面圖及對應(yīng)的等高線圖

2.3 叢芽增殖倍數(shù)及生長情況

2.3.1建立模型

利用軟件對表5進(jìn)行二次多項回歸擬合，計算出誘導(dǎo)叢芽培養(yǎng)基中6-BA(X1)、NAA(X2)對增殖倍數(shù)(Y)的二元回歸方程?；貧w方程為Y=5.22+0.215X1-0.085X2-0.22X1X2-0.286 4X12-0.428 9X22。其中，相關(guān)系數(shù)R2=0.95，校正系數(shù)R2=0.92。

2.3.2叢芽增殖模型擬合與優(yōu)化

由方差分析可知(表6)，調(diào)整系數(shù)為0.979，信噪比大于4，說明模型可靠。2個因素對增殖倍數(shù)影響的主次順序為6-BA濃度>NAA濃度。一次項中X1對結(jié)果影響極顯著，X2影響顯著；交互項對結(jié)果影響顯著，二次項影響極顯著。

表6 回歸模型各項方差分析

殘差正態(tài)圖顯示，殘差緊緊圍繞對角線分布，滿足正態(tài)性，模型合理可用(圖9 A)， 本實驗研究了模型推測出的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比MS+1.01 mg/L 6-BA+0.32 mg/L NAA對大花海棠增殖倍數(shù)的影響，該組合的大花海棠莖段理論增殖倍數(shù)為5.24。經(jīng)驗證性試驗表明， 該組合的平均增殖倍數(shù)為5.31，誤差僅為0.18%，證明方程擬合效果好(圖9 B)，且該模型具有可行性。

圖8 叢芽增殖

2.3.3響應(yīng)分析

根據(jù)回歸方程做出相應(yīng)響應(yīng)面和等高線，考察6-BA和NAA對大花海棠莖段增殖倍數(shù)的影響。由圖10所示，等高線呈閉合橢圓狀且3 D圖中6-BA坡度大于NAA，說明6-BA和NAA相互作用顯著，而6-BA在培養(yǎng)基中的濃度變化對增殖倍數(shù)影響高于NAA。

A為6-BA與NAA增殖倍數(shù)響應(yīng)面圖；B為6-BA與NAA增殖倍數(shù)等高圖

3 結(jié)論與討論

本試驗利用響應(yīng)面試驗設(shè)計方法篩選出大花海棠脫毒苗最佳啟動條件和增殖條件，李莉等[8]研究證明，此方法是選擇最佳試驗方案的一種高效、直觀、快速的試驗設(shè)計方法，目前已有將此方法用于植物組培的報道[9]，如彭文麗等[10]、段新鈺等[11]、謝勇武等[12]對油梨、獼猴桃和金線蓮的研究。本試驗采用響應(yīng)面法驗證了大花海棠快繁不同生長階段的植物生長調(diào)節(jié)劑的互作效應(yīng)，證明了該方法在篩選最佳配方上的高效性和科學(xué)性。鄧仁菊等[13]研究發(fā)現(xiàn)，外源激素在莖段直接誘導(dǎo)不定芽過程中起著重要的作用。因此本試驗在外植體選擇上，利用大花海棠成熟植株帶頂芽(或腋芽)的莖段，并通過添加植物生長調(diào)節(jié)劑達(dá)到莖段直接誘導(dǎo)不定芽的目的。

綜上所述，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計，探索出了大花海棠脫毒苗不同階段的植物生長調(diào)節(jié)劑最佳配比，培養(yǎng)出了遺傳性狀與母本一致的大花海棠脫毒苗，具有潛在園林應(yīng)用價值。

圖9 A為殘差概率正態(tài)圖，B為實際與預(yù)測的增殖倍數(shù)之間的線性相關(guān)圖