添加纖維素酶和乳酸菌對“桂牧1 號”雜交狼尾草青貯品質(zhì)的影響

何 瑋， 冉啟凡

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 400015；2.國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系云陽綜合試驗站，重慶 404500；3.重慶市草業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 400015）

“桂牧1 號”雜交狼尾草[（Pennisetum americanum×P.purpureum） ×P.durpureum schum.cv.GuimuNo.1]是獲得父母本綜合性狀的優(yōu)良牧草品種（李小鈴等，2018），具有生物量大、飼用價值高、質(zhì)地柔軟、適口性好等優(yōu)點，是長江中下游一帶及以南地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的重要生物飼料。 該草供草期主要集中在夏、秋兩季，冬季休眠，不利于全年均衡供草， 因此將夏季刈割的青綠飼草調(diào)制成干草或青貯飼料，以供家畜四季食用，對實際生產(chǎn)具有非常重要的意義（榮輝等，2009）。 重慶地區(qū)夏季潮濕多雨，曬制干草不易成功，牧草加工方式以青貯為主，但在生產(chǎn)實踐中，由于雜交狼尾草的可溶性碳水化合物含量相對較低，水分含量較高，緩沖度較大，而且莖稈中空，存有大量空氣，所以青貯的發(fā)酵進(jìn)程慢， 在青貯初期青貯料會產(chǎn)生過多的呼吸、發(fā)熱和滲液等，最終導(dǎo)致其青貯失敗（李振武等，2017）。 為促進(jìn)雜交狼尾草青貯飼料的良好發(fā)酵， 須選擇適當(dāng)?shù)那噘A添加劑來提高其青貯的成功率和品質(zhì)。 目前，乳酸菌制劑和纖維素酶制劑因其具有安全、易操作、無污染等優(yōu)點，在許多牧草青貯調(diào)制中普遍使用。 在狼尾草屬的王草（李茂等，2020）、象草（趙苗苗等，2015）、雜交狼尾草（劉金偉等，2014）青貯過程中添加纖維素酶及乳酸菌均可見報道， 但其添加的乳酸菌制劑多為商品制劑或各地研究院所制備。 而青貯飼料中乳酸菌種類豐富，不同地區(qū)、不同青貯原料的青貯飼料中乳酸菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量差異較大（張志飛等，2021）。本研究通過重慶本地的雜交狼尾草屬新鮮葉片中提取制備的乳酸菌制劑與纖維素酶制劑相結(jié)合，探討乳酸菌制劑和纖維素酶的不同添加方式對雜交狼尾草青貯成功率和青貯品質(zhì)的影響， 旨在探明外源添加劑添加對雜交狼尾草青貯加工的效果及篩選出本地最佳的乳酸菌、纖維素酶添加方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗用“桂牧1 號”雜交狼尾草種植于重慶市豐都縣大地牧歌農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司雜交狼尾草示范種植基地。 纖維素酶（CEL，浙江一諾生物科技有限公司）是由木霉代謝產(chǎn)物制成的固體粉末，酶活性為50000 U/g，使用溫度為30 ～60 ℃，最適溫度為50 ℃，最適pH 為4.8。 乳酸菌制劑：青12-5（LD1）、益4-J1（LD2）均為植物乳酸桿菌，由西南大學(xué)提供，菌含量為1×109cfu/g。

1.2 試驗設(shè)計 試驗采用單因子試驗設(shè)計， 共7個處理。 CK 為對照組，處理1 ～6 分別添加LD1乳酸菌制劑、LD2 乳酸菌制劑、 乳酸菌混合制劑、纖維素酶、纖維素酶+LD1 乳酸菌制劑、纖維素+LD2 乳酸菌制劑，每個試驗組設(shè)4 個重復(fù)。乳酸菌制劑添加水平為1×106cfu/g，纖維素酶添加量為0.5 g/kg，均以鮮物質(zhì)（FM）為基礎(chǔ)，纖維素酶+乳酸菌混合組各添加劑量不變，乳酸菌混合組各乳酸菌添加劑量減半，混合比例1:1。

1.3 試驗方法

1.3.1 青貯飼料的制作 田間用聯(lián)合收割機同時完成雜交狼尾草全株刈割和粉碎，粉碎后轉(zhuǎn)運至青貯加工場地，隨機稱取雜交狼尾草草段，按試驗設(shè)計計量將纖維素酶和乳酸菌均勻噴灑在草段上，對照組加等量蒸餾水，充分混勻，裝入聚酯乙烯青貯袋中，壓實抽真空密封后，在室溫條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 樣品預(yù)處理 青貯60 d 后， 準(zhǔn)確稱取樣品20 g，加入180 mL 去離子水，充分?jǐn)嚢韬螅ㄟ^4 層紗布和定性濾紙過濾，制備青貯浸出液，測定pH。 浸出液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，待測。

1.3.3 測定指標(biāo)及分析方法 將原料和青貯飼料于65 ℃烘箱中烘60 h 以上至恒質(zhì)量，測定干物質(zhì)（DM）含量；使用凱氏定氮儀測定粗蛋白質(zhì)（CP）含量； 采用半自動分析儀測定中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量（張麗英，2003）；粗灰分（CA） 含量用600 ℃灼燒殘渣法測定（和麗萍等，2000）；Ca 含量采用高錳酸鉀法測定；P 含量采用鉬黃分光光度法測定；pH 用pH 計測定；采用次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮（NH3-N） 含量（張麗英，2003）； 用高效液相色譜儀測定乳酸（LA）、 乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）含量（Shao 等，2007）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計 采用SPSS 19.0 和Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計， 差異顯著時采用Duncan’s 方法對各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌制劑篩選及生理生化特性 針對重慶秋冬低溫、夏季高溫、發(fā)酵容易失敗的問題，從本地雜交狼尾草、甜象草、紫象草新鮮葉片上分離選育低溫、高溫菌株，選用MRS 培養(yǎng)基及5、15、25、35、37、45、55 ℃培養(yǎng)條件下，通過生長速率、產(chǎn)酸速率進(jìn)行初步篩選，篩選出OD ＞2，pH ＜4 的81 株菌作為初始菌株，開展深一步低溫、中溫、高溫活性菌株的篩選試驗，最終篩選出高溫活性菌株（青12-5）和低溫、中溫活性菌株（益4-J1），制備成乳酸菌制劑LD1、LD2， 兩種乳酸菌均為同型乳酸發(fā)酵中的兼性異型乳酸發(fā)酵類型。 菌株菌落形態(tài)基本相似，菌落邊緣光滑整齊，呈乳白色凸起的圓形菌落；菌體為桿狀單個排列；革蘭氏染色為陽性，觸酶試驗為陰性。 生理生化指標(biāo)具體參數(shù)見表1。

表1 乳酸菌生理生化鑒定

2.2 青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì) 添加劑對雜交狼尾草青貯品質(zhì)的影響見表2。 對照組和處理4 青貯料pH 最低，顯著低于處理1、3、5、6（P＜0.05），與處理2 差異不顯著（P＞0.05）。 處理1 青貯料pH最高。 對照組青貯料乳酸含量最高， 顯著高于其他各組（P＜0.05），其次為處理6，為44.53 mg/g FM，比對照組低19.58%，乳酸含量最低的為處理5，比對照組低82.26%。乙酸含量除處理5 顯著高于其他組外（P＜0.05），比對照組高28.23%，其他組間差異不顯著（P＞0.05）。處理2 青貯料中不含丙酸，處理4 青貯料中丙酸含量也較低，比處理3低51.52%。對照組和處理2 青貯飼料中均不含有丁酸，處理3 丁酸含量最高，為30.60 mg/g FM。

表2 雜交狼尾草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)

2.3 青貯飼料的化學(xué)成分 添加劑對雜交狼尾草青貯飼料化學(xué)成分的影響見表3。 對照組干物質(zhì)含量 最 高， 處 理1、2、3、4、5、6 分 別 比 對 照 組 低2.34% 、4.74% 、3.77% 、4.80% 、7.60% 、2.57% （P＜0.05）。 處理1 青貯料中粗蛋白質(zhì)含量最高，比對照組高6.17%， 和處理4、2 及3 間差異不顯著（P＞0.05），與對照組、處理5、處理6 間差異顯著（P＜0.05）。 處理4 青貯料中性洗滌纖維含量最低，比處理5 低9.25%（P＜0.05）， 處理6 青貯料酸性洗滌纖維含量最低，為43.69%，比處理5 低6.04%（P＜0.05）。處理2 青貯料中粗脂肪含量最高，為3.02%，顯著高于其他處理（P＜0.05）。青貯料中粗灰分、能量、鈣、磷含量各處理間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 雜交狼尾草青貯飼料的化學(xué)成分%

3 討論

3.1 不同添加劑對雜交狼尾草青貯品質(zhì)的影響雜交狼尾草青貯60 d 后， 對照組和處理4 青貯料pH 為4.24，處理2 青貯料pH 為4.32，其他處理組pH 組均在4.5 及以上，LA 含量以對照組最高，為55.37 mg/g FM，AA 含量處理4 最低，為27.18 mg/g FM，處理2 中未檢出PA、BA。 本試驗中，單獨添加乳酸菌益4-J1，氨態(tài)氮含量較對照組低10.64%，表明益生菌對雜交狼尾草發(fā)酵品質(zhì)起到了一定的改善作用。 趙苗苗等（2015）研究表明，在象草中添加乳酸菌和纖維素酶能夠有效改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，本試驗結(jié)果與其不一致。 而Uchida 和Kitamura（1987）在熱帶牧草中接種乳酸菌，發(fā)現(xiàn)其對發(fā)酵品質(zhì)作用不明顯，本試驗與其結(jié)果一致。 在青貯過程中，添加乳酸菌可以提高青貯品質(zhì)（Cai 等，1998），但必須在青貯初期保證充足的發(fā)酵底物（張慧杰，2011）。熱帶牧草本身可溶性碳水化合物含量低，再加上在炎熱的8 月制作青貯料，植株中的葡萄糖和蔗糖等乳酸菌能夠利用的底物更加不足，導(dǎo)致青貯發(fā)酵以乙酸型發(fā)酵為主（趙苗苗等，2015）。

3.2 不同添加劑對雜交狼尾草青貯飼料營養(yǎng)成分的影響 在本試驗中， 雜交狼尾草青貯料中添加纖維素酶后， 青貯飼料CP 含量較對照組提高6.08%（P＜0.05），ADF、NDF 分別較對照組降低2.93%、4.81%（P＜0.05）， 表明添加纖維素酶后，雜交狼尾草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)得到顯著改善。添加乳酸菌和纖維素酶各處理，除處理5 外，其他處理青貯料CP 含量均高于對照組， 這和李茂等（2020）的研究結(jié)果一致。纖維素含量是影響家畜對飼草消化率的重要因素，含量越低則越容易被家畜消化。 除處理4 外，其他處理并不能有效降低青貯料中的NDF 含量。 除處理5， 其他處理青貯料的ADF 含量均比對照組低。這和Sheperd 等（1995）研究結(jié)果不一致，和張英等（2013）研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

“桂牧1 號”雜交狼尾草青貯時單獨添加纖維素酶，能提高青貯料CP 含量，降低ADF、NDF 含量；添加乳酸菌益4-J1，能有效抑制丙酸、丁酸產(chǎn)生，對青貯品質(zhì)有一定的改善作用。