高效液相色譜法測(cè)定飼料中替米考星含量

牛 蓉， 秦麗波 ， 張夢(mèng)麗， 周蘭蘭

（1.河南宏信檢測(cè)技術(shù)有限公司農(nóng)產(chǎn)食品檢測(cè)中心，河南南陽 473000；2.牧原食品股份有限公司品控部，河南南陽 473000）

替米考星是一種較新的以泰樂菌素為前體的半合成大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素， 其分子式為C46H80N2O13，相對(duì)分子質(zhì)量為869.15，白色粉末狀，由順式和反式異構(gòu)體組成， 比例為85：15 （余軍軍，2021；Zhang，2021）。替米考星主要作用與其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物相同， 對(duì)革蘭氏陽性菌有明顯的活性， 對(duì)部分革蘭氏陰性菌及支原體也有一定的活性，主要用于由敏感菌引起的感染性疾病，特別是畜禽呼吸道感染疾病（Wang，2021）。 替米考星的靶組織為肺臟，可在肺部明顯蓄積，其飼料藥物添加劑僅批準(zhǔn)用于豬，休藥期為7 d，可促進(jìn)豬群生長(zhǎng)發(fā)育，提高飼料利用率。但是由于抗生素在養(yǎng)殖行業(yè)的濫用，抗生素殘留、環(huán)境污染、細(xì)菌耐藥性等問題接踵而來， 隨著人類對(duì)食品安全及環(huán)境衛(wèi)生的要求不斷提高， 減抗禁抗勢(shì)在必行（由大鵬，2021；李朝云，2020）。2019 年7 月10 日，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194 號(hào)公告：2020 年7 月1 日起， 飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料（劉宏偉，2019；藺春文，2019），這標(biāo)志著我國(guó)飼料行業(yè)將全面進(jìn)入“禁抗”時(shí)代。 這就要求盡快建立完善對(duì)應(yīng)的有關(guān)飼料中的抗生素質(zhì)量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。

目前關(guān)于替米考星的檢測(cè)方法主要集中在牛肉、豬肉、羊肉、雞肉、蜂蜜、魚類、牛奶等動(dòng)物源性食品上 （姚禪媛，2018；Zhao，2017；Jank，2015；楊迪，2014；Le，2013；Spisso，2010），《GB 31650-2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中公布了替米考星在不同動(dòng)物靶組織中的殘留限量。 替米考星的殘留通常在牛腎臟、肝臟和注射部位中含量最高（Horie，2013）。豬和羊在投喂了替米考星后，大部分藥經(jīng)糞便排出，而原形藥多聚集于肝和腎內(nèi)，肌肉等部位的殘留物濃度較小，整體處于正常水平（Granelli，2008）。 而對(duì)于禽類來說，肝中含有最高殘留濃度，腎臟次之，殘留最低的是肌肉、脂肪、皮膚（焦?jié)櫍?021；Leroy，1994）。

關(guān)于飼料中替米考星的測(cè)定方法僅有農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-4-2006 飼料中替米考星的測(cè)定 高效液相色譜法》， 該法前處理較為簡(jiǎn)單，但上機(jī)檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)。閆小峰等（2010）報(bào)道的飼料中替米考星檢測(cè)方法上機(jī)時(shí)間較短， 但前處理操作步驟較為復(fù)雜，整體檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)。本文旨在建立一套操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高的飼料中替米考星含量的高效液相色譜檢測(cè)方法， 為飼料中替米考星的質(zhì)量檢測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品， 含量80.70%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈為色譜級(jí)，美國(guó)天地有限公司；二丁胺、磷酸、四氫呋喃、甲酸均為分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 Waters E2695-2489 高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；HU20500B 超聲波清洗器，深圳市朗杰超聲電器有限公司；隔膜真空泵，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MS105DU 電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；MVM-200 多管混勻儀，南京祥中生物科技有限公司；DD5000 離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 替米考星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 mg/mL。稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（相當(dāng)于替米考星），用乙腈溶解并定容至10 mL，溶液濃度為1 mg/mL，置于-18 ℃冰箱避光保存，保存期12 個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別準(zhǔn)確吸取10、20、50、100、200、500 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于不同1.5 mL 離心管中， 用水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）定容至1.0 mL，配制成10、20、50、100、200、500 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，過濾后待測(cè)。

1.4 試劑配制 1 mol/L 磷酸二丁胺緩沖液（DBAP）：在700 mL 水中加入168 mL 二丁胺，然后緩慢加入70 mL 磷酸，邊加邊攪拌，振蕩使二丁胺溶解， 冷卻至室溫， 用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5±0.1，轉(zhuǎn)移至1000 mL 容量瓶中，加水至1000 mL，備用。

水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）： 取805 mL 水、115 mL 乙腈、25 mL 1 mol/L 磷酸二丁胺緩沖液（DBAP）、55 mL 四氫呋喃，混勻，有機(jī)濾膜過濾，備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 樣品制備 取有代表性的樣品至少500 g，用四分法縮減至200 g， 粉碎通過1 mm 孔徑篩，混勻，貯存磨口瓶中備用。

1.5.2 樣品提取 平行做2 份實(shí)驗(yàn)。 稱取試樣約5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）20 mL，渦旋混合30 s，振蕩10 min，超聲10 min，于4000 r/min 離心5 min，取上清液過微孔濾膜，供高效液相色譜儀分析。

1.5.3 色譜條件 色譜柱：C18 色譜柱，250 mm×4.6 mm；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；流動(dòng)相：水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理優(yōu)化

2.1.1 提取溶液的優(yōu)化 替米考星屬于無色弱堿性化合物，分子量較高，易溶于酸性水溶液和極性溶劑，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-4-2006 中飼料中替米考星的測(cè)定采用的是乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-磷酸緩沖液（200：25：25，V：V：V），閆小峰等（2010）采用乙腈和磷酸二氫鉀緩沖液先后提取。 本研究分別選取乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-磷酸緩沖液（200：25：25，V：V：V）、水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）、甲醇、乙腈為提取液，取空白飼料，加標(biāo)為200 mg/kg，分別用以上4 種不同提取液提取，每種提取方式設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果顯示當(dāng)提取液為乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-磷酸緩沖液（200：25：25，V：V：V）和水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）時(shí)，平均回收率較高， 接近100%（表1）， 由于水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）與本研究中流動(dòng)相一致，為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程，減少試劑配制，本研究最終選擇水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃 （805：115：25：55，V：V：V：V）為提取液。

表1 不同提取溶劑對(duì)替米考星提取率影響

2.1.2 提取次數(shù)的優(yōu)化 本研究考察了提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。 稱取空白飼料樣品5 g，加標(biāo)量為200 mg/kg，選水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）為提取液，考察提取1 次（20 mL）、2 次（10、10 mL）、3 次（7、7、6 mL）對(duì)提取效果的影響，每組3 個(gè)重復(fù)，對(duì)比其平均回收率。 結(jié)果顯示，提取1 次（20 mL）時(shí)即可達(dá)到提取效果，增加提取次數(shù)并未提高回收率（表2），且會(huì)延長(zhǎng)整體前處理時(shí)間，綜合提取效果及時(shí)間成本考慮，最終選擇提取1 次（20 mL）。

表2 提取次數(shù)、振蕩時(shí)間及超聲時(shí)間對(duì)替米考星提取率影響

2.1.3 振蕩及超聲時(shí)間的優(yōu)化 振蕩法為常用提取方式之一，一般選取振蕩時(shí)間為20 ～30 min。 超聲波提取是通過空化作用使分子運(yùn)動(dòng)加快，同時(shí)將超聲波的能量傳遞給樣品，使組分拖脫附和溶解加快（李俊鎖，2002）。 本研究考察振蕩時(shí)間及超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響，稱取空白飼料樣品5 g，加標(biāo)量為200 mg/kg，加入20 mL 水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃（805：115：25：55，V：V：V：V）提取，分別考察振蕩10、20、30 min， 超聲10、20、30 min對(duì)提取效果的影響，每組3 個(gè)重復(fù)。 結(jié)果顯示振蕩10 min，超聲10 min 即可達(dá)到提取效果，延長(zhǎng)振蕩及超聲時(shí)間并未提高回收率（見表2），因此本文選擇振蕩10 min，超聲10 min 為最優(yōu)條件。

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化 農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-4-2006 及中華人民共和國(guó)獸藥典（2020 年版）中替米考星的檢測(cè)波長(zhǎng)均為280 nm， 為驗(yàn)證280 nm是否為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，本研究測(cè)定了50 μg/mL 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液在250 ～350 nm 的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在290 nm 波長(zhǎng)下， 響應(yīng)最大 （圖1）， 因此選擇290 nm 為最佳波長(zhǎng)。

圖1 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL）在不同波長(zhǎng)下的響應(yīng)值

2.2.2 色譜柱及柱溫的選擇 實(shí)驗(yàn)選擇了ZORBAX Extend-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm） 及ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）兩種不同長(zhǎng)度的色譜柱，對(duì)替米考星進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在使用長(zhǎng)度為150 mm 色譜柱時(shí)， 替米考星出峰時(shí)間為5.124 min（反式）和5.744 min（順式），使用長(zhǎng)度為250 mm 色譜柱時(shí)， 替米考星出峰時(shí)間為5.309 min（反式）和6.065 min（順式）（圖2），即使用長(zhǎng)度為150 mm 色譜柱并未明顯提前替米考星出峰時(shí)間，用長(zhǎng)度為250 mm 色譜柱時(shí)，替米考星順式峰及反式峰分離效果較好， 因此本研究選擇使用ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

圖2 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（250 mm）

化合物在色譜柱上的行為是吸附解析動(dòng)態(tài)分配平衡的過程， 柱溫的變化對(duì)化合物的保留時(shí)間及分離效果有一定的影響。因此選取20、25、30 ℃三種不同柱溫分析50 μg/mL 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液。發(fā)現(xiàn)替米考星在3 種溫度下均能夠很好的分離，溫度為20 ℃時(shí)保留時(shí)間最長(zhǎng)，30 ℃時(shí)保留時(shí)間最短，但時(shí)間無較大差異，因此對(duì)柱溫不做要求，在室溫條件下即可。

2.3 線性范圍、 檢出限及定量限 配制10、20、50、100、200、500 μg/mL 不同質(zhì)量濃度的替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本實(shí)驗(yàn)色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。用替米考星順式及反式異構(gòu)體峰面積之和（Y）和質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示回收方程具有良好的線性關(guān)系，為Y＝32927X-59269，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9991。 以空白飼料為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，加標(biāo)范圍為0.1 ～50 mg/kg，按3 倍信噪比（S/N＝3）和10 倍信噪比（S/N＝10）計(jì)算方法的檢出限和定量限，結(jié)果顯示替米考星的檢出限為5 mg/kg，定量限為10 mg/kg。

2.4 回收率及精密度 以空白飼料的基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，分別添加不同濃度的替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得加標(biāo)水平分別為20、50、100、200、500 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做6 個(gè)平行樣品， 在本實(shí)驗(yàn)分析條件下測(cè)定， 結(jié)果顯示該方法平均回收率為92.0% ～101.2%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02% ～5.17%（表3），滿足飼料中替米考星檢測(cè)分析要求。

表3 替米考星的平均回收率及精密度（n=6）

2.5 穩(wěn)定性 將加標(biāo)濃度為200 mg/kg 的飼料樣品按照本實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行處理，將處理后的樣品溶液分別在0、24、48、74 h 時(shí)上機(jī)測(cè)定， 對(duì)比替米考星的峰面積及RSD（表4）。 結(jié)果顯示，該樣品在室溫條件下放置72 h 內(nèi)，替米考星含量無明顯變化。

表4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本研究建立了飼料中替米考星的高效液相色譜測(cè)定方法，相較于農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-4-2006，本實(shí)驗(yàn)將提取液與流動(dòng)相進(jìn)行了統(tǒng)一， 規(guī)定了樣品稱樣量，減少了提取液的體積，優(yōu)化了液相色譜洗脫程序及檢測(cè)波長(zhǎng)。通過以上各參數(shù)的優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)條件可明顯節(jié)約試劑成本、 人工成本及時(shí)間成本，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，準(zhǔn)確率及穩(wěn)定性高，適用于大批量飼料中替米考星含量的測(cè)定。