天蠶素抗菌肽在飼料應(yīng)用中的安全性研究

孫明杰 ， 盛永杰， 郝木強(qiáng)， 趙 倩， 柳亞茹， 謝全喜， 曹銀生

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000）

為避免抗生素濫用給人類健康帶來的多種危害， 尋找代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的藥物已成為現(xiàn)今研究熱點(diǎn)。近幾年隨著抗菌肽研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其作為抗菌的替代藥物發(fā)展?jié)摿薮蟆?由于抗菌肽獨(dú)特的抑菌機(jī)理， 病原微生物不易對其產(chǎn)生耐藥性，使其成為一種新型的抗微生物介質(zhì)。 另外，由于抗菌肽具有廣譜抗菌性、 耐酸堿、 熱穩(wěn)定等特征，使其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景和研究價(jià)值。 目前關(guān)于抗菌肽的應(yīng)用已經(jīng)有很多報(bào)道（孫得發(fā)等，2020；黃小建等，2020；王正楠，2020），但作為飼料添加劑與其相關(guān)的毒性試驗(yàn)報(bào)道較少。 本文研究了天蠶素抗菌肽作為飼料添加劑對小鼠的急性毒性和亞慢性毒性， 為抗菌肽作為飼料添加劑在畜牧領(lǐng)域中的應(yīng)用提供支撐數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 18 ～22 g 昆明小鼠，雌性，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 主要試劑 抗菌肽菌粉CEC-38，27 萬單位/g，由寶來利來生產(chǎn)車間提供。 含有不同劑量抗菌肽鼠糧由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司代加工。

1.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥方法 18 ～22 g 昆明小鼠共50 只，試驗(yàn)共分5 組，每組小鼠10 只。 1 ～5組采用一次最大灌胃量法 （1 mL/只）， 空腹8 h后， 灌胃不同劑量抗菌肽（800、1600、3200、6400、12800 單位/g）。

1.3.2 觀察及檢測指標(biāo) 動(dòng)物死亡情況： 每天定期觀察小鼠3 次， 包括動(dòng)物死亡數(shù)及各自的死亡時(shí)間。 中毒反應(yīng)癥狀：臨床觀察每天至少一次，觀察皮膚、被毛、眼睛和黏膜改變，呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及四肢活動(dòng)和行為方式的變化等，特別要注意有無震顫、驚厥、腹瀉、嗜睡等現(xiàn)象。 神經(jīng)毒性：驚厥、共濟(jì)失調(diào)和死亡。 植物神經(jīng)興奮：腹瀉或豎毛。病理學(xué)檢查：解剖進(jìn)行尸檢，觀察各器官有無改變， 對肉眼觀察有變化的臟器需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.4 小鼠亞慢性毒性試驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共分5 組， 每組小鼠10 只，雌性。 CK 為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼料。 1 ～4組為試驗(yàn)組， 飼喂含有不同劑量抗菌肽（40、400、4000、2 萬單位/g）鼠糧。 所有小鼠自由采食。 嚙齒類亞慢性毒性試驗(yàn)時(shí)間至少3 個(gè)月（2 ～6 個(gè)月），本試驗(yàn)亞慢性試驗(yàn)進(jìn)行4 個(gè)月飼喂觀察。

1.4.2 檢測指標(biāo) 在飼喂試驗(yàn)開始后每日觀察小鼠的表現(xiàn)，每周稱量小鼠體重、飼料，計(jì)算日增重、日采食量、 食物利用率。 在第4 個(gè)月剖殺部分小鼠，采集主要臟器，計(jì)算臟器指數(shù)，采集小鼠血液，測定小鼠血液常規(guī)和生化指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽急性攻毒試驗(yàn)結(jié)果 臨床觀察：各組小鼠皮膚、被毛、眼睛和黏膜無改變，呼吸、四肢活動(dòng)和行為方式無變化，無震顫、驚厥、腹瀉、嗜睡等現(xiàn)象，無腹瀉或豎毛。剖檢：各組小鼠主要臟器，胸腺、肺、肝、脾、胃、小腸、大腸、腎等部位未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。

急性攻毒試驗(yàn)小鼠在最大劑量為1.28 萬單位/g，灌胃1 mL 時(shí)并未致死，臨床觀察和剖檢結(jié)果說明，天蠶素抗菌肽在最大劑量時(shí)無毒性。

2.2 抗菌肽亞慢性毒性試驗(yàn)

2.2.1 抗菌肽對小鼠臨床表現(xiàn)的影響 臨床觀察：各組小鼠皮膚、被毛、眼睛和黏膜無改變，呼吸、四肢活動(dòng)和行為方式無變化，無震顫、驚厥、腹瀉、嗜睡等現(xiàn)象，無腹瀉或豎毛。

2.2.2 抗菌肽對小鼠日增重的影響 飼喂試驗(yàn)開始前2 個(gè)月，每周稱量小鼠體重，計(jì)算小鼠的日增重，后期延長稱重時(shí)間。 結(jié)果如圖1 顯示，前4 周小鼠生長較快，后期小鼠日增重變化不大，小鼠基本停止生長。 CK 組和試驗(yàn)1、2、3、4 組間日增重?zé)o顯著差異（P＞0.05）。 表明飼喂抗菌肽并未影響小鼠的正常生長。

圖1 天蠶素抗菌肽對小鼠日增重的影響

2.2.3 抗菌肽對小鼠日采食量的影響 飼喂試驗(yàn)開始前2 個(gè)月，每周稱量小鼠采食量，計(jì)算小鼠的日采食量。試驗(yàn)后期延長稱量時(shí)間。由圖2 可知，試驗(yàn)組1 ～4 組小鼠飼喂抗菌肽后前5 周日采食量顯著低于對照組（P＜0.05）。 從第6 周開始，除4 組外，各組日采食量與對照組差異不顯著（P＞0.05），1 ～3 組日采食量逐漸與對照組相當(dāng)，4 組采食量一直保持最低。

圖2 天蠶素抗菌肽對小鼠日采食量的影響

2.2.4 抗菌肽對小鼠食物利用率的影響 通過小鼠日增重與日采食量之比，計(jì)算小鼠食物利用率。由圖3 可知，小鼠食物利用率隨飼喂時(shí)間延長，各組呈現(xiàn)降低趨勢。第1 周，各試驗(yàn)組顯著低于對照組（P＜0.05）。 飼喂抗菌肽提高了食物利用率。 除第8 周和第16 周，4 組小鼠食物利用率一直顯著高于其他各組（P＜0.05）。 1 ～3 組小鼠食物利用率也高于對照組。

圖3 天蠶素抗菌肽對小鼠食物利用率的影響

2.2.5 抗菌肽對小鼠臟器指數(shù)的影響 飼喂4 個(gè)月后，各組剖殺10 只小鼠。采集小鼠主要器官，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 臟器指數(shù)是指某個(gè)臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100 g 體重計(jì)。 如肝/體比，即（全肝濕重/體重）×100。 由表1 可知，飼喂不同濃度抗菌肽4 個(gè)月對小鼠主要臟器指數(shù)無顯著性影響（P＞0.05）。 并且剖檢并未觀察到器官病變。

表1 抗菌肽對小鼠臟器指數(shù)的影響（n=10）g

2.2.6 抗菌肽對小鼠血液生化指標(biāo)的影響 飼喂4 個(gè)月后， 剖殺， 毛細(xì)管采集小鼠血液20 μL 于1.5 mL 抗凝離心管中， 送于骨科醫(yī)院進(jìn)行測定，數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表2。 飼喂不同濃度抗菌肽4 個(gè)月對小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮無顯著性影響（P＞0.05）。 說明抗菌肽對小鼠肝、腎功能無影響。

表2 抗菌肽對小鼠血液生化指標(biāo)的影響（n=10）

2.2.7 抗菌肽對小鼠血常規(guī)的影響 眼球采血于離心管中，5000 r/min 離心10 min ， 取上清送于骨科醫(yī)院進(jìn)行測定，數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表3。 數(shù)據(jù)顯示各試驗(yàn)組血常規(guī)各指標(biāo)與CK 組相比無顯著差異性（P＞0.05）。

表3 抗菌肽對小鼠血常規(guī)的影響（n=10）

3 討論

毒理研究中動(dòng)物的體重變化是機(jī)體各器官、系統(tǒng)發(fā)育狀況的總和， 是反映受試毒物對機(jī)體毒性作用的一項(xiàng)綜合指標(biāo)， 對于判斷受試物毒性作用強(qiáng)度有一定的參考價(jià)值（沈建忠，2002）。因大多數(shù)雌性動(dòng)物耐受性強(qiáng)于雄性，且個(gè)體之間差異小，故選用雌性小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

為了減少用藥應(yīng)激，亞慢性毒性試驗(yàn)周期持續(xù)4 個(gè)月，試驗(yàn)周期較長，因此采用混飼給藥方式， 將抗菌肽按照比例添加到飼料中， 重新制粒，最大程度減少應(yīng)激反應(yīng)，可更好地檢驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)。 飼喂試驗(yàn)開始前，粉碎各組代加工飼料，測定代加工飼料抗菌肽活性是否受損， 確保試驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

小鼠2 ～6 個(gè)月飼喂試驗(yàn)可以作為評價(jià)藥物或毒物亞慢性危害的主要參考依據(jù)。 本試驗(yàn)通過混飼給藥觀察小鼠的臨床表現(xiàn)、 組織病理學(xué)變化，以及測定血液學(xué)、血清生化指標(biāo)、臟器系數(shù)等幾個(gè)方面來考察抗菌肽毒性（姜玲玲等，2016；蘇亞楠等，2015；張玲等，2004）。 臟器系數(shù)又稱臟體比， 是試驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與體重之比值。 臟器系數(shù)常能反映試驗(yàn)動(dòng)物總的營養(yǎng)狀態(tài)和內(nèi)臟的病變情況，臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。 正常狀態(tài)下，臟器系數(shù)比較恒定， 當(dāng)接觸外來物質(zhì)致使臟器受到損害，臟器重量發(fā)生改變，臟器系數(shù)將發(fā)生變化（孫全文等，2010）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，長期飼喂含天蠶素抗菌肽飼料，小鼠體重、血液常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器系數(shù)與對照組相比均無顯著差異，剖檢觀察顯示小鼠內(nèi)臟器官無損害，未見與藥物作用相關(guān)病理變化， 故可認(rèn)定天蠶素抗菌肽作為飼料添加劑可長期使用。

另外由于試驗(yàn)用天蠶素抗菌肽為規(guī)?；a(chǎn)獲得，因此在檢驗(yàn)急性毒性試驗(yàn)時(shí)未用純品，而是直接灌胃水溶菌粉， 灌胃1.28 萬單位/g 1 mL 為最大給藥量， 但作為支持天蠶素抗菌肽在畜牧行業(yè)中應(yīng)用試驗(yàn)也足以說明其安全性。

與傳統(tǒng)抗生素殺菌方式不同， 抗菌肽具有獨(dú)特的殺菌作用方式， 其能夠特異性地選擇結(jié)合位點(diǎn)， 通過降解細(xì)菌膜的某些必要成分或通過特定膜受體而進(jìn)入病原體起到殺菌作用 （Schmitta ，2016），這種獨(dú)特的殺菌方式，使抗菌肽在飼料應(yīng)用中具有安全、綠色、高效等優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明， 飼喂不同濃度抗菌肽小鼠的前期采食量顯著下降，后期逐漸趨于對照組，整個(gè)飼喂周期日增重與對照組差異不顯著， 食物利用率顯著升高；小鼠的臨床表現(xiàn)、臟器指數(shù)、血液常規(guī)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)均與對照組差異不顯著。 天蠶素抗菌肽對小鼠生長有積極的生物學(xué)影響，未見毒性。