直接進樣-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定水中14種有機污染物

葉燕慧，劉陽春，王東霞，趙紅磊，郭 偉

(北京市水文總站，北京 100089)

水中有機污染物種類繁多，危害性不同，其中丙烯酰胺、滅草松、2,4-滴、樂果、苦味酸、聯(lián)苯胺、五氯酚、呋喃丹、甲萘威、阿特拉津、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、對硫磷和毒死蜱為水體中常見的14種有機污染物。聯(lián)苯胺具有強致癌性，被國際癌癥研究機構(IARC)列為第一類致癌物[1]；丙烯酰胺被IARC列為第2類致癌物；五氯酚、樂果、對硫磷是我國水中優(yōu)先控制的污染物[2]；苦味酸為高毒類物質；以呋喃丹、甲萘威、毒死蜱、馬拉硫磷、內(nèi)吸磷為代表的殺蟲劑和以阿特拉津、滅草松、2,4-滴等為代表的除草劑是我國使用較多的農(nóng)藥。上述14種有機污染物對人體危害性較強，均屬于我國現(xiàn)行國標嚴控指標項目[3-5]，并配套了相應的檢測方法，規(guī)定了最高限值。標準中指定的測試方法需對大體積水樣富集處理后方可進行分析，前處理過程冗長，試劑用量大，易對實驗人員的身體健康造成危害。目前，固相萃取法已廣泛用于有機物的分離富集，雖然較液-液萃取可節(jié)省大量溶劑，提高分析效率，但仍需大量水樣富集，操作繁瑣，有時甚至可產(chǎn)生假陽性結果。液相色譜-質譜是一種靈敏度高，選擇性好，分析速度快的定性、定量分析方法。液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法已逐漸應用于水中痕量有機污染物的測定[6-8]，其中直接進樣法也得到了一定的應用[9-13]。如，張明等[13]建立了直接進樣-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)法快速測定地表水中聯(lián)苯胺、苦味酸、甲萘威、阿特拉津和溴氰菊酯，該方法簡便快捷、靈敏準確。目前，已逐步開展水中部分理化性質相近化合物的多組分同時檢測研究，但不同理化性質化合物的多組分同時檢測的分析方法還較缺乏。此外，不同極性的目標化合物在色譜柱上的吸、脫附效率不同，在同時進樣檢測時通常存在相互干擾的現(xiàn)象。

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定有機物大多采用多反應監(jiān)測模式，為保證每種化合物的檢測靈敏度，需分時段監(jiān)測。動態(tài)多反應監(jiān)測(DMRM)可根據(jù)色譜分析時間對各組分保留時間窗口進行動態(tài)分配，僅當組分流出時才被采集。該分段方式不僅可以有效減少同時掃描不同離子對的數(shù)目，提高駐留時間、分析靈敏度和選擇性，還可有效提升實驗分析效率，適用于多種有機物的同時檢測。閆君等[14]報道了動態(tài)多反應監(jiān)測模式在食品領域的應用，但鮮有水質檢測方面的報道。此外，LC-MS/MS在測定標準樣品和待測樣品時對不同基質帶來的干擾較敏感，不同基質會對實驗結果產(chǎn)生一定的誤差，據(jù)文獻[15-16]報道，選擇合適的內(nèi)標可減少不同基質帶來的影響。

本研究擬建立直接進樣-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜-動態(tài)多反應監(jiān)測分析方法快速測定水中14種有機污染物。同時，使用上述14種同位素內(nèi)標，通過對比分析標準樣品與目標樣品的保留時間和碎片離子，對目標樣品進行分離及鑒定，使用內(nèi)標校正法對各分析物進行定量測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀(配備四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)、Agilent 6460三重四極桿質譜儀(配備Mass Hunter Acquisition Software B.01.08軟件)：美國Agilent公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水機：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑及材料

標準溶液：苦味酸有證標準溶液、13種混合有證標準溶液(丙烯酰胺、滅草松、2,4-滴、樂果、聯(lián)苯胺、五氯酚、呋喃丹、甲萘威、阿特拉津、內(nèi)吸磷、馬拉硫磷、對硫磷、毒死蜱)，濃度為100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司產(chǎn)品。

內(nèi)標溶液：14種混合內(nèi)標溶液(丙烯酰胺-D3、滅草松-D7、2,4-滴-13C6、樂果-D6、2,4-二硝基苯酚-D3、聯(lián)苯胺-D8、五氯酚-13C6、呋喃丹-D3、甲萘威-D7、阿特拉津-D5、內(nèi)吸磷-S-甲基、馬拉硫磷-D6、對硫磷-D10、毒死蜱-D10)，濃度為100 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司產(chǎn)品。

主要試劑：乙腈(色譜純)，迪馬科技公司產(chǎn)品；乙酸銨(色譜純)，德國Merck公司產(chǎn)品；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 標準溶液配制

標準儲備液：分別移取100 μL 13種混合標準溶液和100 μL苦味酸單標溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的14種混合標準儲備液，于-18 ℃保存。

內(nèi)標儲備液：移取100 μL 14種混合內(nèi)標溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的14種混合內(nèi)標儲備液，于-18 ℃保存。

標準系列溶液：分別移取5、10、20、50、100、200、500、600、700、1 000 μL標準儲備液和200 μL內(nèi)標儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用水定容，得到0.5、1、2、5、10、20、50、60、70、100 μg/L 14種有機污染物的標準系列溶液，其中內(nèi)標濃度為20 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 水樣采集與制備

按照HJ 164—2020[17]和HJ 493—2009[18]的相關規(guī)定采集和保存樣品。用棕色玻璃瓶采集，當水樣充滿采樣瓶加蓋密封，4 ℃避光保存。水樣經(jīng)0.22 μm尼龍66濾膜過濾后，取1 mL置于棕色樣品瓶，加入20 μL內(nèi)標儲備液，混勻后進樣分析。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm×2.7 μm)；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；流動相：A為10 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min(95%A)，0.5～3 min(95%～75%A)，3～15 min(75%～35%A)，15～20 min(35%～1%A)，20～22 min( 1%A)，22.01～25 min(95%A)。

1.5.2質譜條件 電噴霧電離源(ESI±)；動態(tài)多反應監(jiān)測模式；干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力276 kPa；毛細管電壓3 500 V；質譜參數(shù)列于表1。14種有機污染物的MRM色譜圖示于圖1。

表1 14種有機污染物及其內(nèi)標物的質譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions of 14 organic pollutants and isotope internal standards

圖1 14種有機污染物混合標準溶液的MRM色譜圖(0.5 μg/L)Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard solution of 14 organic pollutants (0.5 μg/L)

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Mass Hunter Qualitative Analysis和Quantitative Analysis軟件進行數(shù)據(jù)的定性、定量處理，以樣品的保留時間和定性/定量離子的相對豐度定性，根據(jù)定量離子的峰面積采用內(nèi)標法定量。

2 結果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

2.1.1稀釋液優(yōu)化 通常，液相色譜在分離過程中存在“溶劑效應”，如果稀釋液選擇不合適，將影響色譜保留，導致色譜峰形異常，同時還會影響待測物的電噴霧電離效果，進而影響檢測靈敏度?；诖耍狙芯糠謩e以100%乙腈、50%乙腈-水溶液和純水為溶劑，將混合標準溶液配制成20 μg/L稀釋液進樣分析，觀察色譜峰形和分離效果。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著稀釋液中乙腈含量的增加，尤其是在純乙腈體系中，滅草松、樂果、聯(lián)苯胺、苦味酸等目標物及其內(nèi)標物的色譜峰出現(xiàn)前沿峰；而使用純水作為稀釋液時，所得的色譜峰峰形對稱且尖銳；其原因在于乙腈體系中樣品與初始流動相的極性相差較大，存在強烈的“溶劑效應”，導致對目標物的洗脫效果和峰形都較差。因此，為消除由于“溶劑效應”引入的系統(tǒng)誤差，同時與待測實際水樣中的溶劑條件保持一致，本實驗選擇純水作為混合標準溶液的稀釋液。

2.1.2色譜條件優(yōu)化 色譜柱的選擇對于樣品的分離非常重要，為確保各化合物在色譜柱上有較好的保留和分離效果，比較了Poroshell 120 EC-C18柱(3.0 mm×100 mm×2.7 μm)、Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×100 mm×3.5 μm)和Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)對14種有機污染物的分離效果。結果表明，使用Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)時，流動相流量較大，與電噴霧離子化方式不匹配，導致離子化效率降低，質譜響應強度較低。相對于Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×3.5 μm)，Poroshell 120 EC-C18柱對各化合物具有較好的分離效果及峰形，原因在于該色譜柱裝填了一種具有實心核和多孔外殼的表面多孔型填料，由于分析物在多孔外殼內(nèi)外擴散速度更快，并具有非常均勻的填充柱床，所以這種色譜柱能夠在2.7 μm填料的柱壓下提供與亞2 μm填料相當?shù)闹?，并且能夠降低操作壓力、改善峰形，適用于優(yōu)化UPLC性能。因此，選用Poroshell 120 EC-C18色譜柱作為本實驗的分析柱。

由于電噴霧質譜需在溶液狀態(tài)下電離目標化合物，因此，流動相的選擇要兼顧各目標化合物的色譜分離效果及質譜離子化效率。甲醇作為流動相存在共流出現(xiàn)象，信號之間相互干擾；相較而言，乙腈體系能夠控制超高效液相色譜的系統(tǒng)壓力，并獲得較好的分離效果。本文分別考察乙腈-0.1%甲酸和乙腈-5 mmol/L乙酸銨作為流動相時14種有機物的分離效果。結果表明：選用0.1%甲酸能增加阿特拉津和甲萘威等化合物的響應值，但同時會導致聯(lián)苯胺等化合物的色譜峰變形；選用5 mmol/L乙酸銨能明顯改善各物質的峰形，大部分目標物的離子化效率高且峰形對稱。綜合考慮，最終選用乙腈-5 mmol/L乙酸銨作為流動相。

在梯度洗脫條件中，起始流動相通常采用高比例水相，有助于目標物與環(huán)境基體物質的分離，防止基質效應。本文以5 mmol/L乙酸銨水溶液(A)和乙腈(B)為流動相，比較方案1(0～0.5 min(95%A)，0.5～20 min(95%～1%A)，20～22 min(1%A)，22.01～25 min(95%A))和方案2(0～0.5 min(95%A)，0.5～3 min(95%～75%A)，3～15 min(75%～35%A)，15～20 min(35%～1%A)，20～22 min(1%A)，22.01～25 min(95%A))兩種梯度條件下的分離效果。結果表明，方案1的色譜峰出峰時間集中在3～20 min，由于該區(qū)間化合物的結構和極性類似，各化合物的化學性質和色譜行為可能導致一些目標化合物出現(xiàn)共流出峰，進而影響峰形及其分離效果，使信號響應降低；方案2通過增加梯度，并放緩3～20 min梯度，各化合物依次出峰，分離效果好，色譜峰峰形良好，有助于提高檢測靈敏度和準確度，故選方案2作為最佳梯度洗脫條件。

2.1.3質譜條件優(yōu)化 根據(jù)各化合物的分子結構特征和化學電離性質，選擇ESI源正、負離子模式分析?；瘜W結構中含羧基類的酸性化合物容易失去質子帶負電荷，一般采用負離子模式；化學結構中含氮的堿性化合物容易加和質子帶正電荷，一般采用正離子模式。本研究中，苦味酸、滅草松、2，4-滴、五氯酚采用負離子模式檢測，丙烯酰胺等10種化合物采用正離子模式檢測。

不分段采集方式中多個MRM重疊會使靈敏度降低，而分段采集方式易降低分析方法通量?；诖耍狙芯坎捎脛討B(tài)多反應監(jiān)測模式，按目標物保留時間設置監(jiān)測離子掃描時間窗口，在不同時間段分別進行MRM掃描，以增加窗口期目標離子的掃描頻率。該模式可提高質譜信號響應強度，增強質譜測定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，適合多種化合物的同時檢測。

綜上，本文采用正、負離子模式，動態(tài)多反應監(jiān)測模式，優(yōu)化后的離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)列于表1。對14種有機污染物的混合標準溶液(0.5 μg/L)按照1.5節(jié)條件進樣分析，14種有機污染物均有良好的響應。

2.2 方法學考察

2.2.1標準曲線的繪制 目前，水中有機物的定量分析多采用外標法[19-21]，但存在測定儀器、樣品基質帶來的誤差。本研究通過在水樣中加入14種同位素內(nèi)標，經(jīng)內(nèi)標校正，可有效避免誤差，提高分析準確度，此外，還可通過內(nèi)標物的峰形、峰面積監(jiān)測樣品與儀器的運行狀態(tài)是否正常，同位素內(nèi)標與目標物之間的對應關系列于表1。

按優(yōu)化后的檢測條件將14種化合物系列標準溶液按濃度由低到高的順序依次進樣測定，以待測物濃度為橫坐標，待測物峰面積與相應同位素內(nèi)標物峰面積之比(待測物峰面積/內(nèi)標物峰面積)為縱坐標，得到的標準曲線示于圖2，各化合物的線性范圍、回歸方程和相關系數(shù)列于表2。結果表明，各化合物在較寬的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)R2均在0.999以上。

圖2 水中14種有機污染物的標準曲線Fig.2 Standard curves of 14 organic pollutants in water

表2 水中14種有機污染物的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限和標準限值Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), LODs, LOQs and standard limits of the 14 organic pollutants in water

2.2.2檢出限與定量限 配制低濃度水平的14種待測物，以分子離子對的信噪比S/N≥3對應的質量濃度作為方法的檢出限(LOD)，以S/N≥10對應的質量濃度作為方法的定量限(LOQ)，列于表2。14種待測物的LOD為0.01～0.05 μg/L，LOQ為0.05～0.10 μg/L，明顯低于國家規(guī)定的濃度限值[3-5]，能夠滿足直接進樣測定地表水、地下水和生活飲用水中14種有機污染物的檢測要求。

2.2.3加標回收率與精密度 選用不含14種待測組分的地表水、地下水和生活飲用水樣品，分別添加低、中、高3個濃度水平的混合標準溶液，配制成濃度為1、50、90 μg/L的水樣，每個濃度水平平行測定6次，分別加入20 μL內(nèi)標儲備液，測定加標回收率及精密度，結果列于表3?？梢?，在不同水體中，3個加標水平下14種有機污染物的平均回收率為77.9%～114%，相對標準偏差(RSD)為0.2%～14.1%，方法的準確性和精密度較好，能夠滿足環(huán)境監(jiān)測質量控制要求。

表3 3個加標水平下，14種有機污染物的加標回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 14 organic pollutants at three spiked levels (n=6)

續(xù)表3

2.3 實際樣品測定

采集北京城區(qū)地表水、地下水、生活飲用水3份水樣，經(jīng)濾膜過濾后加入內(nèi)標，采用本方法對實際樣品進行分析檢測，結果在地表水樣中檢出了阿特拉津，其濃度為0.689 μg/L，遠低于國家標準規(guī)定的濃度限值(3 μg/L)[3]，示于圖3，其余有機污染物均未檢出。

圖3 陽性地表水樣品中阿特拉津的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of atrazine in a positive surface water sample

3 結論

本文建立了一種基于電噴霧電離源正、負離子掃描，動態(tài)多反應監(jiān)測、同位素內(nèi)標定量分析的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法，用于測定水中14種有機污染物。該方法無需對水樣富集，操作簡便快速、靈敏度高，方法精密度和加標回收率能夠滿足國家標準的質量控制要求和限量檢測要求，可為大批量同時快速檢測地表水、地下水和生活飲用水中14種有機污染物提供技術參考。