LC-MS/MS分析結(jié)合優(yōu)化提取工藝探究啤酒中麩質(zhì)蛋白

于欣禾，李明慧，孫 珍

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079)

麩質(zhì)蛋白是小麥、大麥、黑麥和燕麥等早熟禾亞科谷物淀粉胚乳中的主要貯藏蛋白家族，占小麥總蛋白含量的70%～80%。根據(jù)麩質(zhì)蛋白在醇溶液中溶解度的不同可分為2種組分[1]，一種是溶于醇類的富含脯氨酸(Pro)和谷氨酰胺(Gln)的醇溶蛋白，另一種是不溶于醇的組分，稱為麥谷蛋白。許多不溶于醇的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與醇溶蛋白非常相似，據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，在還原劑存在的情況下，麥谷蛋白也可以被水溶性醇類提取。此外，硫氧還原蛋白的還原反應(yīng)可以改變小麥淀粉胚乳蛋白質(zhì)在谷物萌發(fā)和幼苗發(fā)育過程中的溶解度[3]。乳糜瀉疾病被定義為一種慢性T細(xì)胞介導(dǎo)的腸道病，由遺傳性易感個(gè)體食用麩質(zhì)引起的，其患者約占全球人口的1%。乳糜瀉疾病的臨床癥狀因患者而異，既包括腸道癥狀，如腹瀉或脂肪瀉，也包括腸外癥狀，如骨痛或骨質(zhì)疏松癥[4]等?，F(xiàn)階段，雖然已經(jīng)提出了幾種治療乳糜瀉疾病的方法，如：酶法[5-6]、使用降解麩質(zhì)蛋白的微生物[7]方法、使用工程改造過的谷物多肽和抑制性醇溶蛋白多肽[8]方法等，但對(duì)于乳糜瀉疾病患者來說，唯一有效的治療方法仍是終生堅(jiān)持嚴(yán)格的無麩質(zhì)飲食。根據(jù)歐盟委員會(huì)第1169/2011號(hào)條例規(guī)定：麩質(zhì)蛋白含量低于20 mg/kg的產(chǎn)品可貼上“無麩質(zhì)”標(biāo)簽，在20～100 mg/kg之間的產(chǎn)品可貼上“極低麩質(zhì)”標(biāo)簽。

目前，幾種典型的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，如R5、Skerritt和G12抗體可用于麩質(zhì)蛋白分析。其中，R5抗體與QQPFP、QQQFP、LQPFP和QLPFP序列結(jié)合最強(qiáng)[9-10]；Skerritt抗體能特異性識(shí)別高分子質(zhì)量麥谷蛋白[11-12]；G12抗體是針對(duì)合成的33聚體毒性α2-醇溶蛋白，能夠識(shí)別QPQLPY表位[13-14]。但使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法會(huì)因?yàn)槭称芳庸み^程中蛋白發(fā)生的各種變化及試劑盒的估算方式，造成麩質(zhì)蛋白含量的高估或低估[15-16]。此外，競(jìng)爭(zhēng)型酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并不能完全代表在不同發(fā)酵過程中產(chǎn)生的所有麩質(zhì)蛋白[17]。

在啤酒生產(chǎn)過程中，醇溶蛋白和其他儲(chǔ)存蛋白可能在制麥過程中被活化的蛋白酶降解[18]。糖化過程中的高溫也可能導(dǎo)致麩質(zhì)蛋白改性，影響酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的檢測(cè)結(jié)果。此外，谷氨酰胺(Q)殘基存在于免疫原性表位的結(jié)合位點(diǎn)，使得表位容易發(fā)生脫酰胺反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，對(duì)小麥有耐受性的受試者食用了含有去酰胺化麩質(zhì)蛋白的食品后，出現(xiàn)了嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。可見，在評(píng)價(jià)乳糜瀉疾病患者的食品安全性時(shí)，也應(yīng)考慮去酰胺化的谷蛋白肽。質(zhì)譜法具有高效、靈敏、微量分析等優(yōu)點(diǎn)[20-21]，是解析啤酒蛋白質(zhì)組學(xué)和肽組學(xué)的有力工具[22-24]，有研究使用質(zhì)譜等手段檢測(cè)發(fā)酵食品中水解麩質(zhì)蛋白[25-26]。

本研究擬采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法評(píng)價(jià)7種不同的麩質(zhì)蛋白提取方法，通過優(yōu)化提取工藝，檢測(cè)啤酒樣品中的去酰胺化麩質(zhì)蛋白多肽和麩質(zhì)蛋白碎片。希望通過對(duì)8種市售啤酒的麩質(zhì)蛋白圖譜進(jìn)行探索，為啤酒樣品中麩質(zhì)蛋白的提取及檢測(cè)提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Ultimate 3000 RSLC液相色譜儀：美國(guó)Dionex公司產(chǎn)品；Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Proteome Discoverer數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；萬分之一天平：北京丹佛儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司產(chǎn)品；水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；醫(yī)用離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與樣品

碘代乙酰胺、1,4-二硫蘇糖醇、三氟乙酸、甲酸、用于消化的酶(胰蛋白酶和糜蛋白酶)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；異丙醇、乙腈、甲醇：均為質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司產(chǎn)品；OASIS HLB固相萃取柱：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；離心過濾裝置(截留質(zhì)量3K和10K)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；蛋白濃度測(cè)定試劑盒：碧云天生物科技公司產(chǎn)品；RIDASCREEN Gliadian (R5)試劑盒：德國(guó)R-Biopharm公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析級(jí)。

8種啤酒分別為小麥王(S1)、凱爾特人(S2)、哈爾濱啤酒(S3)、青島全麥白啤(S4)、莫爾巴赫啤酒(S5)、釀酒狗啤酒(S6)、黑獅新動(dòng)啤酒(S7)和ORIGN啤酒(S8)，其詳細(xì)信息列于附表1(請(qǐng)登錄《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》網(wǎng)站http:∥www.jcmss.com.cn下載，以下同)。

1.3 蛋白質(zhì)提取

啤酒樣品超聲脫氣后，用3K超濾管在4 ℃下以6 140 r/min離心60 min濃縮20 mL啤酒樣品，超濾管底部溶液為Mr<3K組分(F3)。對(duì)于一步提取法，上清液用4倍樣品體積的55%異丙醇(V/V)和2% 1,4-二硫蘇糖醇(w/V)的混合液漩渦振蕩，在60 ℃孵育30 min后，用3K超濾管將溶液替換為相應(yīng)的緩沖液(6 mol/L鹽酸胍，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)。對(duì)于兩步提取法，在文獻(xiàn)[20]的基礎(chǔ)上，根據(jù)上層溶液在醇中的溶解度進(jìn)行分級(jí)。首先，將5 mL蛋白溶液用預(yù)冷的0.1 mol/L醋酸銨甲醇溶液(溶液Ⅰ)稀釋4倍，然后于-20 ℃孵育過夜，取出后在4 ℃下以8 680 r/min離心10 min，所得沉淀部分為醇不溶性組分(F1)；上清部分用3倍樣品體積的冷丙酮(溶液Ⅱ)在-20 ℃下繼續(xù)孵育4 h，丙酮溶液沉淀蛋白質(zhì)并離心3次，所得沉淀為醇溶性組分(F2)。對(duì)于兩步提取方案，分別用0.1 mol/L醋酸銨甲醇(M1)、0.1 mol/L 50%醋酸銨甲醇(M2)、50%異丙醇(M3)、80%異丙醇(M4)、60%乙醇(M5)和20%三氯乙酸丙酮(M6)作為溶液Ⅰ進(jìn)行提取方法優(yōu)化。一步提取法則采用“55%異丙醇+2%1,4-二硫蘇糖醇”(M7)溶液，按照Colgrave等[27]方法提取啤酒中的麩質(zhì)蛋白。

1.4 蛋白質(zhì)消化

將醇不溶性蛋白和醇溶性蛋白溶解于含有6 mol/L鹽酸胍的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中，用蛋白濃度測(cè)定試劑盒法測(cè)定各組分的蛋白濃度。樣品于4 ℃保存。

采用文獻(xiàn)[28]方法，使用3K超濾管消化每個(gè)蛋白質(zhì)樣品，消化的蛋白量約500 μg。簡(jiǎn)而言之，樣品用10 mmol/L 1,4-二硫蘇糖醇還原后，以14 420 r/min離心20 min去除緩沖液和多余的1,4-二硫蘇糖醇，然后將樣品放在用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)配制的20 mmol/L碘代乙酰胺中，室溫避光孵育40 min。烷基化反應(yīng)后，用10 mmol/L碳酸氫銨溶液洗滌3次，以14 420 r/min離心20 min。最后，在10 mmol/L碳酸氫銨中加入胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合酶，使酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶30。在37 ℃孵育過夜后，以14 420 r/min離心20 min，收集洗脫的肽段進(jìn)行LC-MS分析。對(duì)于Mr<3K組分，即未消化的多肽樣品直接用OASIS HLB柱脫鹽，用80%乙腈-0.1%三氟乙酸洗脫。洗脫液冷凍干燥后，用0.1%甲酸復(fù)溶。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 預(yù)柱：C18 PepMap100(100 μm×2 cm×5 μm)；色譜柱：國(guó)產(chǎn)C18毛細(xì)管分析柱(自制，75 μm×12 cm×3 μm，填料為Dr. Masch GmbH公司生產(chǎn)的C18)；流速0.3 μL/min；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸-80%乙腈水溶液；梯度洗脫：0～3 min(4%～10%B)，3～25 min(10%～35%B)，25～31 min(35%～55%B)，31～32 min(55%～95%B)，32～42 min(95%B)，42～43 min(95%～4%B)。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描方式；標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量27%；電噴霧電壓2 300 V；毛細(xì)管加熱溫度275 ℃；完整多肽和碎片離子的分辨率分別為70 000和17 500；一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z350～1 800；選擇最強(qiáng)的20個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)為3×106。

1.5.3數(shù)據(jù)分析 使用Proteome Discoverer(2.2.0.388)以SEQUEST HT為搜索引擎處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫包含：大麥，214 798個(gè)序列；小麥，214 165個(gè)序列。肽鑒定的誤檢率控制在1%以下。對(duì)于酶解后的肽段部分(F1、F2組分)，胰蛋白酶和糜蛋白酶被指定為切割的酶，最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn)。肽段的切割位點(diǎn)必須完全符合指定蛋白酶的切割特異性。對(duì)于Mr<3K的部分沒有指定蛋白酶，因?yàn)樵谄【粕a(chǎn)過程中，高溫及自身水解等因素會(huì)使部分蛋白降解為肽段，而具體的切割特異性無從知曉，需要用非特異性的搜索方式考慮這部分。母離子允許的最大質(zhì)量誤差為1×10-5，碎裂離子允許的最大質(zhì)量誤差為0.02 u。最小多肽長(zhǎng)度設(shè)置為6個(gè)殘基，最大多肽長(zhǎng)度設(shè)置為144個(gè)殘基。半胱氨酸上的脲基甲基(+57.021 u)為靜態(tài)修飾，蛋氨酸氧化(+15.995 u)、蛋白N-端乙?；?+42.011 u)和脫酰胺化(+0.984 u)設(shè)置為動(dòng)態(tài)修飾。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

采用RIDASCREEN Gliadin(R5)夾心型酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)啤酒中麩質(zhì)蛋白。按生產(chǎn)廠家提供的說明書進(jìn)行醇溶蛋白的提取和測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法微量滴定板中的每個(gè)樣本均重復(fù)2次，每個(gè)孔的光密度(吸光度)用TECAN Infinite F50微板閱讀器(瑞士)在450 nm處測(cè)定，使用RIDA SOFT WIN(R-Biopharm，德國(guó))軟件分析3次樣條曲線數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS分析評(píng)價(jià)啤酒麩質(zhì)蛋白提取方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了M1～M6作為醇溶性蛋白提取液及一步分級(jí)法采用的M7溶液對(duì)啤酒中麩質(zhì)蛋白提取的效果，結(jié)果列于表1?？梢?，M3對(duì)醇不溶蛋白部分的麩質(zhì)蛋白鑒定率最高，鑒定了157個(gè)；而M1對(duì)醇溶蛋白部分的麩質(zhì)蛋白鑒定率最高，鑒定了179個(gè)；總體而言，M1鑒定到225個(gè)麩質(zhì)蛋白，是7種方法中最高的。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇M1作為提取液?？梢钥闯觯谔崛》桨窶1～M5中，醇不溶性組分和醇溶組分的鑒別有小部分重疊，主要原因可能是有些蛋白質(zhì)既不極易溶于醇，也不完全不溶于醇。此外，還可能是還原劑的存在(比如硫氧還原蛋白的還原反應(yīng))改變了蛋白質(zhì)在醇中的溶解度[3]。

表1 7種不同麩質(zhì)蛋白提取法對(duì)醇不溶性和醇溶性麩質(zhì)蛋白的鑒定結(jié)果Table 1 Results of gluten proteins identified in alcohol-insoluble fraction and alcohol-soluble fraction using seven different gluten extraction protocols

本實(shí)驗(yàn)選取能夠被多種蛋白提取方法同時(shí)鑒定的5個(gè)蛋白，比較不同提取方法的蛋白質(zhì)覆蓋率和檢測(cè)到的多肽數(shù)量，結(jié)果列于表2。以1種蛋白質(zhì)(UniProt ID：Q94IJ6)為例，除了M6和M7外，該蛋白質(zhì)能夠通過5種提取方法(M1～M5)鑒定?？梢钥闯觯琈1鑒定了蛋白質(zhì)覆蓋率最高為38%的蛋白質(zhì)序列，同時(shí)鑒定出24個(gè)多肽，它們屬于Q94IJ6。同樣的情況發(fā)生在蛋白質(zhì)Q8W3W8、A5JSA3和A0A159KI54上。對(duì)于蛋白質(zhì)D2KFH1，使用M1鑒定到的蛋白質(zhì)覆蓋率略低于M6，但兩者識(shí)別的多肽數(shù)量相同，可能是由鑒定的多肽長(zhǎng)度不同導(dǎo)致的。根據(jù)附表2中的結(jié)果可以看出，M7和M1鑒定的蛋白平均覆蓋率較高，但考慮到M1鑒定的麩質(zhì)蛋白總數(shù)比M7多24%，綜合考慮仍然選擇M1作為優(yōu)化的提取方法。

表2 所選5種麩質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)覆蓋率和鑒定肽數(shù)Table 2 Protein coverage and the number of identified peptides of five selected gluten proteins

2.2 提取方法的重復(fù)性

本研究考察了M1提取法的重復(fù)性。在3個(gè)批次實(shí)驗(yàn)中，從同一瓶啤酒中提取20 mL等量啤酒樣品，分別鑒定出225、221和224種麩質(zhì)蛋白。3批實(shí)驗(yàn)均鑒定出的麩質(zhì)蛋白數(shù)為141種，占每次鑒定數(shù)量的43%以上。同時(shí)，在2批以上實(shí)驗(yàn)中共鑒定出205種相同麩質(zhì)蛋白，占總鑒定數(shù)目的63%以上。對(duì)這3批實(shí)驗(yàn)共同鑒定到的141種蛋白提取相應(yīng)的定量結(jié)果，用Origin軟件進(jìn)行皮爾斯相關(guān)系數(shù)計(jì)算，結(jié)果示于圖1。可以看出，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，表明M1提取方法的定量重復(fù)性較好。

圖1 重復(fù)實(shí)驗(yàn)中相對(duì)定量豐度的相關(guān)系數(shù)圖Fig.1 Correlation coefficient diagram of relative quantitative abundance in repeated experiments

2.3 LC-MS/MS鑒定啤酒中麩質(zhì)蛋白碎片和去酰胺化麩質(zhì)蛋白多肽

本實(shí)驗(yàn)對(duì)麩質(zhì)蛋白碎片研究的主要目的是研究啤酒樣品的肽組分?？紤]到啤酒中多肽在生產(chǎn)過程中存在自然水解，因此沒有指定酶特異性，最大限度地獲取水解肽信息。從分離的多肽組分(F3)中鑒定出430個(gè)肽序列，其中111個(gè)肽歸屬于37個(gè)麩質(zhì)蛋白片段，列于附表3，在該組分中能夠檢測(cè)到不同程度的麩質(zhì)蛋白水解。例如，VRVPVPQLQPQNPSQQQPQ和VPVPQLQPQNPSQQQPQ是從同一麩質(zhì)蛋白多肽中水解而來的；IIQPQQPAQLEAIR、IIQPQQPAQLEAIRSL和IQPQQPAQLEAIR是從同一麩質(zhì)蛋白多肽中衍生出來的。通過對(duì)含有抗體能識(shí)別表位的谷蛋白多肽進(jìn)行分析，在F3中檢測(cè)到47個(gè)含有免疫原性表位的谷蛋白多肽，這些表位來源于24個(gè)麩質(zhì)蛋白片段，列于附表4。例如，QPQPVQPQQP是在PQQP[29]的擴(kuò)展氨基酸基序中檢測(cè)到的多肽，而在多肽列表中也檢測(cè)到具有受損表位的QPQPVQPQQ。這驗(yàn)證了在啤酒生產(chǎn)過程中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)麩質(zhì)蛋白的表位會(huì)被破壞，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

表3 8種啤酒的每個(gè)組分(F1、F2、F3)中確定的麩質(zhì)蛋白或麩質(zhì)蛋白片段的數(shù)量Table 3 Number of gluten proteins or gluten fragments identified in each fraction (F1, F2, F3) of eight types of beer

谷氨酰胺(Q)殘基含量高，不僅谷氨酰胺表位容易受損，而且谷氨酰胺容易發(fā)生去酰胺化。谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸會(huì)影響抗體與抗原的相互作用，從而限制抗體的識(shí)別能力，但是去酰胺化的麩質(zhì)蛋白仍然可能引起過敏反應(yīng)。通過對(duì)麩質(zhì)蛋白多肽的脫酰胺化進(jìn)行研究，可以看出，脫酰胺化在3個(gè)組分的鑒定中是普遍存在的。盡管樣品制備的步驟(包括變性、還原、烷基化和酶消化)可能直接影響谷氨酰胺(Gln)脫酰胺化檢測(cè)的總水平，但Gln的脫酰胺化速度比天冬酰胺(Asn)慢很多，這是因?yàn)榱於０翻h(huán)的形成速度比五元琥珀酰亞胺環(huán)的形成速度慢[30]。在利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析樣品過程中發(fā)現(xiàn)，4%～9%多肽發(fā)生了一定程度的非酶促天冬酰胺脫酰胺反應(yīng)[31]，推測(cè)谷氨酰胺的自發(fā)脫酰胺化在谷氨酰胺脫酰胺化檢測(cè)總水平中所占的比例要小得多。因此，本實(shí)驗(yàn)沒有區(qū)分樣品制備前或過程中發(fā)生的谷氨酰胺脫酰胺化。通過將谷氨酰胺的脫酰胺化(+0.984 u)作為動(dòng)態(tài)修飾，在F1和F2組分中分別測(cè)定了430和573個(gè)脫酰胺的肽段，列于附表5、6，F(xiàn)3中還檢測(cè)到52個(gè)脫酰胺的肽段，列于附表7。例如，檢測(cè)到表位為QQLFP(加粗字體顯示)的QPQQLFPQQPQQPLPQPQQPF在Q4殘基上發(fā)生脫酰胺化，而Q4就是表位的Q殘基。QPFPQPQLPYPQPHLPYPQPQPF的QPQLPY被確定是在Q7殘基上去酰胺化。此外，許多含有免疫原性表位的谷蛋白多肽也存在脫酰胺化反應(yīng)，但沒有準(zhǔn)確的定位。因此，本方法可作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果的補(bǔ)充方法，用于脫酰胺化麩質(zhì)蛋白的多肽以及麩質(zhì)蛋白碎片的檢測(cè)。

2.4 LC-MS/MS分析8種啤酒中麩質(zhì)蛋白圖譜

在啤酒生產(chǎn)過程中，麩質(zhì)蛋白被降解為可溶性多肽和游離氨基酸。因此，完整麩質(zhì)蛋白和麩質(zhì)蛋白降解肽都應(yīng)該考慮在內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)使用3K超濾管從多肽中分離出可能完整或輕微降解的麩質(zhì)蛋白，用優(yōu)化的提取方案對(duì)過濾上清液進(jìn)行進(jìn)一步處理，將麩質(zhì)蛋白濃縮成2個(gè)組分(醇不溶性組分F1和醇溶性組分F2)，最后，將富集組分(F1、F2)和分離得到的多肽組分(F3)進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析，其流程示于圖2。

注：T+C表示胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合酶液圖2 LC-MS/MS結(jié)合優(yōu)化提取條件鑒定8種啤酒中麩質(zhì)蛋白的過程Fig.2 Outline of the strategy of identification of gluten in eight types of beer using LC-MS/MS combined with optimized extraction protocol

本實(shí)驗(yàn)在8種啤酒的3種組分中均鑒定出麩質(zhì)蛋白，示于圖3?？梢钥闯觯捎诠任锍煞趾歪勗旒夹g(shù)的不同，啤酒之間存在顯著的差異。以啤酒樣品S4為例，從F1、F2中共鑒定出225個(gè)麩質(zhì)蛋白，F(xiàn)3中共檢測(cè)到36個(gè)麩質(zhì)蛋白，重疊部分(6個(gè)麩質(zhì)蛋白)僅占麩質(zhì)蛋白鑒定總數(shù)(255個(gè)麩質(zhì)蛋白)的2.3%。因此，結(jié)合蛋白質(zhì)組分和肽組分可以顯著提高麩質(zhì)蛋白的鑒定能力，結(jié)果列于表3。從啤酒樣品S4中鑒定的麩質(zhì)蛋白分布來看，小麥含量最高(51%)，其次是小麥麥谷(33%)、大麥(7%)、黑麥(6%)、類燕麥(3%)。根據(jù)麩質(zhì)蛋白分類，可以推斷啤酒釀造原料應(yīng)含有大麥和小麥，小麥所占比例可能大于大麥。由于麥芽中黑麥和類燕麥的含量較低，它們可能是麥芽中的雜質(zhì)，或是同源鑒定的結(jié)果[32]。

圖3 8種啤酒中麩質(zhì)蛋白的分布Fig.3 Distribution of gluten proteins identified in eight types of beer

用RIDASCREEN Gliadin(R5)夾心型酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒對(duì)這8種啤酒進(jìn)行鑒定。根據(jù)3次樣條曲線，計(jì)算出S2、S3、S4和S5的麩質(zhì)蛋白含量均在270 mg/kg以上；S1的麩質(zhì)蛋白含量為108.69 mg/kg，明顯高于20 mg/kg；S6、S7和S8的麩質(zhì)蛋白含量分別為15.81、19.75和10.77 mg/kg；S6和S8的麩質(zhì)蛋白含量均小于20 mg/kg，這與S6和S8是無麩質(zhì)啤酒的事實(shí)一致；而以大麥為主要原料發(fā)酵的S7麩質(zhì)蛋白含量也低于20 mg/kg，這顯然是不真實(shí)的。由此可見，S7的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果并不能真實(shí)地反映麩質(zhì)蛋白含量。

在S6和S8的3種組分中鑒定出的麩質(zhì)蛋白總數(shù)分別為26個(gè)和37個(gè)，是8種啤酒中最少的，與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法結(jié)果一致。然而，經(jīng)過整個(gè)發(fā)酵過程，一些麩質(zhì)蛋白以及麩質(zhì)蛋白相關(guān)肽段仍然可能保留在啤酒中。Watson等[33]用夾心型(R7001)和競(jìng)爭(zhēng)型(R7021)RIDASCREEN Gliadin R5酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分析51款比利時(shí)大麥麥芽啤酒，定量分析麩質(zhì)蛋白和多肽，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)啤酒含有較低含量的麩質(zhì)蛋白，只有少數(shù)啤酒是真正不含麩質(zhì)蛋白(即含量≤20 mg/kg)。因此，為保證無麩質(zhì)啤酒的安全性，麩質(zhì)蛋白濃度和麩質(zhì)蛋白對(duì)應(yīng)肽段濃度均應(yīng)控制在20 mg/kg以下。對(duì)于麩質(zhì)含量遠(yuǎn)高于20 mg/kg的S1、S2、S3、S4和S5啤酒，可用質(zhì)譜法檢測(cè)出多種類型的麩質(zhì)蛋白和麩質(zhì)蛋白碎片。因此，質(zhì)譜法可作為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的補(bǔ)充來確認(rèn)無麩質(zhì)啤酒的食品安全性。

3 結(jié)論

本研究采用優(yōu)化的麩質(zhì)蛋白提取工藝結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜法分析，對(duì)8種市售啤酒的麩質(zhì)蛋白圖譜進(jìn)行探究。在所選的包括無麩質(zhì)啤酒在內(nèi)的所有類型的啤酒中，醇溶組分、醇不溶組分和多肽組分中均鑒定出麩質(zhì)蛋白。該方法可作為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的補(bǔ)充，以確保無麩質(zhì)啤酒的安全性。