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    人參皂苷Rb1通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

    2022-03-16 22:11:35劉志文徐江雁張振強(qiáng)張效威高改王萌萌王輝李真珍謝治深
    中國(guó)藥房 2022年5期
    關(guān)鍵詞:腎小管熒光素酶批號(hào)

    劉志文 徐江雁 張振強(qiáng) 張效威 高改 王萌萌 王輝 李真珍 謝治深

    中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2022)05-0535-07

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.05

    摘 要 目的 研究人參皂苷Rb1(G-Rb1)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及可能機(jī)制。方法 采用10 ng/mL 生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT。觀察10、20、30 μmol/L G-Rb1作用48 h后HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;測(cè)定1.0、2.5、5.0、10、20、30 μmol/L G-Rb1 作用24 h后人胚胎腎細(xì)胞HEK293中報(bào)告基因載體SBE轉(zhuǎn)錄活性,并測(cè)定上述濃度G-Rb1 作用24 h后對(duì)HK-2細(xì)胞相對(duì)活力的影響。檢測(cè)10、20、30 μmol/L G-Rb1作用24 h后HK-2細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)、纖連蛋白(FN) mRNA的表達(dá);檢測(cè)10、20、30 μmol/L G-Rb1作用24 h后HK-2細(xì)胞中α-SMA、Smad家族成員3(Smad3)、磷酸化Smad3(p-Smad3)、COL-Ⅰ、FN和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)。結(jié)果 10~30 μmol/L G-Rb1能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT,顯著抑制因TGF-β1刺激導(dǎo)致的SBE轉(zhuǎn)錄活性升高(P<0.05),并且對(duì)HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力無(wú)明顯影響(P>0.05)。在TGF-β1誘導(dǎo)下,細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白及其mRNA和Smad3、p-Smad3蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05),E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);而G-Rb1則可有效地逆轉(zhuǎn)上述蛋白或mRNA的表達(dá)。結(jié)論 G-Rb1可在一定程度上保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免受TGF-β1誘導(dǎo)引起的EMT,這可能與其抑制了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

    關(guān)鍵詞 人參皂苷Rb1;TGF-β1/Smad3信號(hào)通路;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;腎小管上皮細(xì)胞;上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

    Inhibition of ginsenoside Rb1 on the epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells by regulating TGF-β1/Smad3 signaling pathway

    LIU Zhiwen1,XU Jiangyan1,ZHANG Zhenqiang1,ZHANG Xiaowei1,GAO Gai1,WANG Mengmeng1,WANG Hui2,LI Zhenzhen3,XIE Zhishen1(1. Academy of Chinese Medical Science, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 2. College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 3. Medical Research Center, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

    ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the effects of ginsenoside Rb1 (G-Rb1) on epithelial-mesenchymal transition (EMT) of renal tubular epithelial cells and its potential mechanism. METHODS The growth factor β1 (TGF-β1) 10 ng/mL was used to induce EMT of human renal tubular epithelial cells HK-2. The morphological changes of HK-2 cells were observed after treated with 10, 20, 30 μmol/L G-Rb1 for 48 h. The transcriptional activities of biovector SBE in human embryonic kidney cell HEK293 were determined after 24 h treatment with 1.0, 2.5, 5.0, 10, 20, 30 μmol/L G-Rb1. Effects of above concentration of G-Rb1 on the viability of HK-2 cells were determined after 24 h of treatment. mRNA expressions of α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen Ⅰ (COL-Ⅰ) and fibronectin (FN) in HK-2 cells were detected after treated with 10, 20, 30 μmol/L G-Rb1 for 24 h. The expressions of α-SMA, Smad3, p-Smad3, COL-Ⅰ, FN and E-cadherin were detected after treated with 10, 20, 30 μmol/L G-Rb1 for 24 h. RESULTS G-Rb1 of 10-30 μmol/L significantly inhibited TGF-β1-induced EMT in HK-2 cells and? the increase of transcriptional activities of biovector SBE induced by TGF-β1 (P<0.05), but had no effects on relative activities of HK-2 cells (P>0.05). The protein and mRNA expressions of α-SMA, COL-Ⅰ and FN, the protein expressions of Smad3 and p-Smad3 were significantly up-regulated induced by TGF-β1 (P<0.05), while the protein expression of E-cadherin was significantly down- regulated (P<0.05); G-Rb1 could effectively reverse above protein or mRNA expressions. CONCLUSIONS G-Rb1 can protect renal tubular epithelial cells from EMT induced by TGF-β1 to a certain extent, which may be related to inhibiting the activation of TGF-β1/Smad3 signaling pathway.

    KEYWORDS? ?ginsenoside Rb1;TGF-β1/Smad3 signaling pathway; transforming growth factor β1; renal tubular epithelial cells; epithelial-mesenchymal transition

    糖尿病腎臟疾?。╠iabetic kidney disease,DKD)是糖尿病患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,且30%~47%的糖尿病患者都伴隨有DKD,而DKD是終末期腎病的主要原因[1-4]。上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是DKD發(fā)生的主要病理特征之一[5]。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后,會(huì)影響腎小管重吸收功能,并引發(fā)腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF),導(dǎo)致腎功能下降[6]。因此,抑制腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT可延緩DKD的進(jìn)程[7-8]。研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad家族成員3(transforming growth factor-β1/mothers against decapentaplegic homolog 3,TGF-β1/Smad3)通路的激活與DKD的發(fā)展及腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT密切相關(guān)[9]。TGF-β1能有效誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)如膠原蛋白、纖連蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)的表達(dá)[10-11]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),人參能夠抗糖尿病,調(diào)節(jié)EMT[12-13]。人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1,G-Rb1)是人參的主要活性成分之一[14]。臨床上已有報(bào)道,G-Rb1能改善早期DKD患者的腎功能[15]。此外,G-Rb1可抑制FN、Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ,COL-Ⅰ)和TGF-β1的表達(dá),減輕小鼠腎組織損傷[16]。但G-Rb1是否能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT尚不明確。因此,本研究擬采用TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,探討G-Rb1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及其是否對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用,為 G-Rb1 治療DKD提供參考。

    1 材料

    1.1 主要儀器

    本研究所用的主要儀器有FORMA SERIES Ⅱ WATER JACKET 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);Eclipset S100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);CKX41型熒光倒置顯微鏡(北京元中銳科集成檢測(cè)技術(shù)有限公司);7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)儀(美國(guó)ABI公司);Mini-protean 3 Dodeca型電泳系統(tǒng)、 ChemiDoc MP型全能型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    1.2 主要藥品與試劑

    本研究所用的主要藥品與試劑包括:G-Rb1對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)41753-43-9,純度≥98%),人源TGF-β1試劑(美國(guó)PeproTech公司,批號(hào)100-21-10UG),特異性Smad3抑制劑SIS3鹽酸鹽(美國(guó)MCE公司,批號(hào)HY-13013/CS5768,純度98.02%),DME/F-12(1 ∶ 1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司,批號(hào)SH30023.01),DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Corning公司,批號(hào)10013CVR),胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),報(bào)告基因載體SBE(Smad binding element)質(zhì)粒(武漢淼靈生物科技有限公司,批號(hào)P0756),Luciferase Assay Sysem Free- zew Pack熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司,批號(hào)0000440829),BeyoRTM Ⅲ cDNA第一鏈合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào)103118190503),Power UpTM SYBRTM Green PCR Master Mix(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,批號(hào)00837276),MTT檢測(cè)試劑盒、RIPA試劑盒、TritonX-100、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)分別為725C056、R0010、T8200、PC0020),辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào)BST14B25C15K27),兔源α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)多克隆抗體(武漢塞維爾生物科技有限公司,批號(hào)GB111364),兔源FN多克隆抗體、兔源E-鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體、小鼠源COL-Ⅰ單克隆抗體、小鼠源Smad3單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為15613-1-AP、20874-1-AP、66761-1-lg、66516-1-lg),兔源磷酸化Smad3(p-Smad3)單克隆抗體(美國(guó)CST公司,批號(hào)9520),小鼠源β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司,批號(hào)sc-8432),HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Proteintech Group公司,批號(hào)分別為SA00001-1、SA00001-2);其余試劑均為分析純,水為超純水。

    1.3 細(xì)胞

    人腎小管上皮細(xì)胞HK-2、人胚胎腎細(xì)胞HEK293均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中,將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DME/F- 12培養(yǎng)基中。待細(xì)胞融合至80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代,取6~10代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.2 HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組(含1‰二甲基亞砜的DME/F-12培養(yǎng)基)、TGF-β1組(10 ng/mL TGF-β1,質(zhì)量濃度參考文獻(xiàn)[17]設(shè)置)、SIS3組(10 nmol/L SIS3+10 ng/mL TGF-β1,陽(yáng)性對(duì)照藥SIS3的濃度參考產(chǎn)品說(shuō)明書設(shè)置)以及10 、20、30 μmol/L G-Rb1組(分別為10、20、30 μmol/L G-Rb1+10 ng/mL TGF-β1,G-Rb1濃度參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入相應(yīng)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48 h后,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并收集圖像。

    2.3 HEK293細(xì)胞中SBE的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定

    采用熒光素酶報(bào)告基因法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞,按4×104個(gè)/孔接種于96孔板中,待細(xì)胞融合度超過(guò) 80%時(shí),將SBE質(zhì)粒用PolyJetTM DNA體外轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,6 h后更換DMEM高糖培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對(duì)照組(含1‰二甲基亞砜的DME/F-12培養(yǎng)基)、TGF-β1組(10 ng/mL TGF-β1)、SIS3 組(10 nmol/L陽(yáng)性對(duì)照藥 SIS3+10 ng/mL TGF-β1)和不同濃度G-Rb1組(1.0、2.5、5.0、10、20、30 μmol/L G-Rb1+10 ng/mL TGF-β1),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔;并另設(shè)空白對(duì)照組(該組無(wú)細(xì)胞只有DMEM高糖培養(yǎng)基)。加入相應(yīng)的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h后,按照熒光素酶報(bào)告基因試劑盒方法進(jìn)行操作,采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度值,并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活力:相對(duì)熒光素酶活力=(實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度值-空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度值)/(對(duì)照組熒光強(qiáng)度值-空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度值)。相對(duì)熒光素酶活力越高,表示SBE的轉(zhuǎn)錄活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.4 HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力測(cè)定

    采用MTT法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,按“2.3”項(xiàng)下方法分組(不設(shè)陽(yáng)性對(duì)照藥組;給藥組擴(kuò)大濃度范圍,加設(shè)1個(gè) 40 μmol/L G-Rb1組)及造模、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。加入相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,每孔避光加入終質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT試劑20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)基,每孔加入二甲基亞砜 150? ? ?μL,振搖10 min。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度(OD)值,并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力:細(xì)胞相對(duì)活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.5 HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA表達(dá)測(cè)定

    采用RT-qPCR法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用Trizol 法抽提細(xì)胞中總RNA,驗(yàn)證總RNA純度后,按BeyoRTM Ⅲ cDNA試劑盒方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再按照Power UpTM SYBRTM Green PCR Master Mix試劑盒方法進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)條件:50 ℃加熱 2 min,95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 變性15 s,60 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法分析各目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列由武漢淼靈生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

    2.6 HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白表達(dá)測(cè)定

    2.6.1 Western blot法測(cè)定HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將處理后的HK-2細(xì)胞用PBS清洗3遍,收集細(xì)胞,根據(jù)RIPA試劑盒說(shuō)明書方法提取細(xì)胞中總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白高溫變性后,進(jìn)行SDS凝膠電泳(55 V,30 min;120 V,60 min)分離,然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜(電流350 mA),5%脫脂奶粉封閉2 h;加入一抗(β-actin、α-SMA、FN、p-Smad3一抗的稀釋比例均為1 ∶ 1 000,Smad3一抗的稀釋比例為 1 ∶ 3 000,COL-Ⅰ一抗的稀釋比例為1 ∶ 5 000,E-cadherin一抗的稀釋比例為 1 ∶ 10 000),4 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜10 min×3 次,加入相應(yīng)二抗(稀釋比例均為1 ∶ 10 000),室溫孵育2 h;TBST洗膜 10 min×4次,在自動(dòng)凝膠成像儀上顯影。使用Image J V1.8.0軟件測(cè)定各條帶的灰度值,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.6.2 免疫熒光法測(cè)定HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞,按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將處理后的HK-2細(xì)胞用PBS清洗3遍,于冰上使用4%多聚甲醛固定1 h,PBS洗去殘留的多聚甲醛;在室溫下使用0.3% TritonX-100透化30 min,使用山羊血清封閉2 h,加入α-SMA、FN、E-cadherin一抗(稀釋比例均為1 ∶ 250),4 ℃孵育過(guò)夜;除去一抗,PBS搖洗5 min×3次,加入相應(yīng)二抗(稀釋比例均為1 ∶ 300),避光孵育 1 h;除去二抗,PBS搖洗5 min×3次,避光加入DAPI 復(fù)染30 min;PBS搖洗后,加入熒光抗猝滅劑。在暗室中使用熒光倒置顯微鏡采集圖像,并使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定蛋白的熒光強(qiáng)度值,該值越大,表示目標(biāo)蛋白陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    3 結(jié)果

    3.1 HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

    對(duì)照組HK-2細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)特征,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,形成融合的單層細(xì)胞;TGF-β1組HK-2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞拉長(zhǎng)且呈梭形、間隙增大,形態(tài)上趨向于成纖維細(xì)胞樣改變,具有EMT的典型特征;SIS3組和10、20、30 μmol/L G-Rb1組大多數(shù)HK-2細(xì)胞均保有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)特征。結(jié)果表明,G-Rb1能夠在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。各組HK-2細(xì)胞的顯微圖見(jiàn)圖1。

    3.2 HEK293細(xì)胞中SBE的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,TGF-β1組HEK293細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活力顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組比較,各給藥組HEK293細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活力均顯著降低(P<0.05),且G-Rb1的作用具有一定的濃度依賴趨勢(shì)。這說(shuō)明G-Rb1可抑制SBE的轉(zhuǎn)錄活性,也提示G-Rb1對(duì)TGF-β1/ Smad3通路的激活可能具有抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

    3.3 HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,TGF-β1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力顯著降低(P<0.05);與TGF-β1組比較,1.0~30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明1.0~30 μmol/L G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3通路激活的抑制不是由于影響了細(xì)胞活力導(dǎo)致的。結(jié)果見(jiàn)表3。

    3.4 HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,TGF-β1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組比較,SIS3組、30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量,20 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中COL-Ⅰ、FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量和10 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

    a:與對(duì)照組比較,P<0.05 ;b:與TGF-β1組比較,P<0.05

    3.5 HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

    3.5.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比較,TGF-β1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與TGF-β1組比較,SIS3組和20、30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05);10 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中p-Smad3、FN蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2和表5。

    3.5.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比較,TGF-β1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、FN蛋白的熒光強(qiáng)度值均顯著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白的熒光強(qiáng)度值顯著降低(P<0.05)。與TGF-β1組比較,SIS3組和10、20、30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、FN蛋白的熒光強(qiáng)度值均顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白的熒光強(qiáng)度值均顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3(以E-cadherin蛋白的免疫熒光圖為例進(jìn)行展示,其余圖略)和表6。

    4 討論

    隨著人們生活水平的提高,DKD的患病率也呈升高趨勢(shì),而目前臨床上尚無(wú)特效藥物治療DKD。DKD又被稱為腎小球硬化癥,主要病理表現(xiàn)為RIF,而腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT是RIF發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)[5-6]。Smad3是TGF-β1/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵因子,TGF-β1可通過(guò)下游的Smad3通路調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),參與EMT的進(jìn)程[9]。研究表明,TGF-β1/Smad3通路是EMT的主要通路之一[17-18]。α-SMA作為肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白,其在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)水平的高低可間接反映腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的程度[19]。E-cadherin作為上皮細(xì)胞膜上的一種鈣依賴性黏附蛋白,對(duì)維持細(xì)胞間緊密連接、保持上皮細(xì)胞極性具有十分重要的作用,所以其也作為腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的一個(gè)重要指標(biāo)[19]。伴隨著腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,ECM成分(如COL-Ⅰ、FN蛋白)大量表達(dá)[6,19],促進(jìn)RIF的發(fā)生發(fā)展。G-Rb1作為人參的主要成分,能夠有效改善DKD,但其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及機(jī)制尚未闡明。

    本研究先使用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT,以此來(lái)研究G-Rb1能否通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路,從而抑制腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。結(jié)果顯示,TGF-β1作用于HK-2細(xì)胞48 h后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了EMT樣改變;細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白及其mRNA的表達(dá)上調(diào),E-cadherin蛋白的表達(dá)下調(diào)。而聯(lián)合給予不同濃度G-Rb1后,HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白及其mRNA的表達(dá)不同程度下調(diào),E-cadherin蛋白的表達(dá)不同程度上調(diào)。該結(jié)果提示,G-Rb1能夠在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。

    為了探究G-Rb1抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制,本研究使用HEK293細(xì)胞(轉(zhuǎn)染時(shí)的工具細(xì)胞),通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法探究G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3通路激活的影響(SBE是TGF-β1/Smad信號(hào)通路激活報(bào)告基因載體,可利用SBE熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)評(píng)估G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響)。此外,為了排除基因轉(zhuǎn)錄活性下降是由于影響了細(xì)胞活力導(dǎo)致的,本研究設(shè)計(jì)了MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力。結(jié)果顯示,與TGF-β1組比較,不同濃度G-Rb1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活力均顯著降低,且1.0~30 μmol/L G-Rb1對(duì)細(xì)胞的相對(duì)活力無(wú)顯著影響。該結(jié)果說(shuō)明,G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活具有抑制作用,且該作用不是因?yàn)橐种屏思?xì)胞活力引起的。并且,通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,給予不同濃度G-Rb1后,HK-2細(xì)胞中Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)也不同程度下調(diào),這也進(jìn)一步證實(shí)了G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活具有抑制作用。

    綜上所述,本研究證實(shí)G-Rb1可在一定程度上保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免受TGF-β1誘導(dǎo)引起的EMT,這可能與其抑制了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究初步解釋了G-Rb1在臨床上防治DKD的可能作用機(jī)制,但因研究對(duì)象為細(xì)胞,并不能完全模擬G-Rb1在人體內(nèi)的作用機(jī)制,故本研究仍存在一定的局限性,需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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    (收稿日期:2021-11-18 修回日期:2022-01-17)

    (編輯:林 靜)

    2778501705384

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