綿羊成纖維細胞OAR-L1高效轉(zhuǎn)染方法的探索

吳飛，吳杰，陳學秋，周靜茹，張惠，黃艷，時恒枝，楊怡，馬光旭，杜愛芳

（浙江大學動物科學學院動物預防醫(yī)學研究所，杭州 310058）

細胞系（cell line）通常指能夠連續(xù)傳代的細胞，其易于傳代和編輯的特性使得其在生物學研究尤其是在探究癌癥發(fā)生發(fā)展機制及治療方案中具有重要的地位[1?2]。然而，廣泛應用的綿羊細胞系仍十分匱乏[3]，國內(nèi)易獲得的主要包括綿羊肺成纖維細胞（OAR?L1）和迪慶綿羊皮膚成纖維細胞（DQSHS1），前者是由中國科學院昆明細胞庫于1990年從雌性綿羊的肺組織中建立的細胞系，呈纖維狀，貼壁生長，2～3 d 以1∶3 的比例傳代，生長迅速，連續(xù)傳代后形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，非常適合做細胞模型。目前，在基于綿羊細胞的研究中，仍主要依賴于原代細胞的分離培養(yǎng)，鮮有將現(xiàn)有綿羊細胞系應用于研究中的報道[4?5]。同時，對綿羊細胞系或原代細胞高效轉(zhuǎn)染方法的探索也十分有限，缺乏可推廣的普適性結(jié)論[6?10]。因此，尋找一種能夠簡單、便捷地對綿羊細胞進行穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)染的方法十分重要。

真核細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究細胞內(nèi)基因及蛋白質(zhì)功能的一種重要手段，普遍應用于細胞生物學、免疫學和病原學等眾多學科的多個領域中，主要可分為物理學、化學和生物學方法[11?12]。每種方法都有其獨特的優(yōu)勢和劣勢，如電穿孔法、顯微注射法、基因槍粒子轟擊法和激光轉(zhuǎn)染技術(shù)等物理學方法能夠?qū)崿F(xiàn)精準打靶，但這類方法不僅需要特定的高精度儀器和專業(yè)的培訓，而且通常操作的細胞數(shù)量有限或受轉(zhuǎn)染細胞死亡率過高[11,13?14]。因此，這類方法在基于反芻動物細胞研究過程中的應用有限。目前，應用最為廣泛的仍是化學轉(zhuǎn)染方法，其中最常用的是脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑（LipofectamineTM2000 transfection reagent, Lipo 2000）、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine,PEI）及其類似的產(chǎn)品，其在原代綿羊細胞中轉(zhuǎn)染效果最好，但效率均未超過30%[4?5,15?16]。 另 外，成 纖 維 細 胞 轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（CytofectTMfibroblast transfection kit,CF2）因具有顯著提高原代成纖維細胞轉(zhuǎn)染效率的能力[17]，亦受到部分學者關(guān)注，但其是否能高效轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細胞系仍需要進一步探索。至于生物學方法，目前應用更多的仍是慢病毒，首先是因為這類病毒存在缺陷，在侵染了一代細胞后不會在受侵染的細胞中再次包裝新的病毒；其次是這類方法在細胞轉(zhuǎn)染效率上具有顯著的優(yōu)勢[18?19]，甚至能夠有效侵染多種公認的難轉(zhuǎn)染細胞系或原代細胞[13]。但這類方法在基于綿羊細胞的研究中，主要用于構(gòu)建過表達或敲降細胞株，鮮有將之用作普通轉(zhuǎn)染方法[20]的報道。

基于此，本研究擬使用PEI、Lipo 2000、CF2 和慢病毒侵染的方法，對OAR?L1細胞進行轉(zhuǎn)染效果的比較，以尋找能夠快捷、高效轉(zhuǎn)染OAR?L1 細胞的方法，為后續(xù)基于綿羊細胞的研究奠定理論基礎和提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株和質(zhì)粒

細胞（HEK 293T細胞）、菌株（大腸埃希菌感受態(tài)細胞TOP10）和質(zhì)粒（pMD2.G、psPAX2 以及熒光質(zhì)粒pLentiCMV?EGFP?Puro、pLentiCMV?mCherry?Puro）均由本實驗室凍存，其中2種熒光質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 熒光質(zhì)粒圖譜示意Fig.1 Schematic diagram of fluorescent plasmid maps

1.2 試驗試劑

2×Taq主混合物購自上海近岸生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、BamHⅠ和SalⅠ，購自寶生物工程（大連）有限公司；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（PEI,Linear）（分子量25 000）、脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑（Lipo 2000）和成纖維細胞轉(zhuǎn)染試劑盒（CF2）分別購自美國Polysciences、Thermo Fisher Scientific 和Cell Applications公司；達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM）和Gibico 胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）分別購自以色列Biological Industries 公司和美國Thermo Fisher Scientific 公司；預染彩虹蛋白標志物10～180 kDa、FDbio?Femto ECL 發(fā)光液、一步法凝膠制備試劑盒（12%）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的山羊抗鼠IgG，購自杭州弗德生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自浙江易思得生物科技有限公司；綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）抗體（小鼠單抗）、Western一抗稀釋液和Western一抗二抗去除液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；mCherry 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物及序列測定

質(zhì)粒鑒定時所用的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）引物為測序通用引物（CMV?F，5′?CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG?3′；WPRE?R，5′?CATAGCGTAAAAGGAGCAACA?3′），由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司提供，且測序亦由該公司完成。

1.4 熒光質(zhì)粒表達鑒定

將實驗室保存的熒光質(zhì)粒pLentiCMV?EGFP?Puro、pLentiCMV?mCherry?Puro轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞TOP10 中并涂于氨芐抗性的溶菌肉湯（lysogeny broth,LB）平板上，次日挑取單克隆送往公司測序；用測序正確的菌液樣品在氨芐抗性的LB平板上劃線，次日挑取單克隆，于37 ℃條件下?lián)u菌3 h后進行菌液PCR鑒定，將陽性樣品接種至含5 mL氨芐抗性LB溶液的試管中擴繁，16～18 h后按說明書步驟進行質(zhì)粒抽提；測定所提質(zhì)粒的濃度并經(jīng)雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒在6孔板中按照2 μg/孔的劑量轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，后續(xù)結(jié)合熒光表達情況和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）結(jié)果對留存質(zhì)粒進行鑒定。

1.5 PEI、Lipo 2000 及CF2 轉(zhuǎn)染OAR-L1 細胞

鑒定成功的質(zhì)粒，分別以PEI（1 mg/mL）、Lipo 2000和CF2為轉(zhuǎn)染試劑，按不同的劑量轉(zhuǎn)染在24孔板中以梯度密度鋪板的OAR?L1 細胞（圖2）。待滿鋪的OAR?L1 細胞消化后重懸于2 mL培養(yǎng)基中，計數(shù)后將1×104、2×104、4×104、8×104個細胞分別接種至24 孔板A、B、C 和D 行對應的孔中，轉(zhuǎn)染時24 孔板的第1—6 列分別加入1、2、3、4、5、6 μL PEI、Lipo 2000 或CF2轉(zhuǎn)染劑（圖2C）。轉(zhuǎn)染參照相應試劑的說明書進行，48 h后觀察熒光表達情況。

1.6 慢病毒侵染OAR-L1 細胞

鑒定成功的質(zhì)粒在6孔板中按照每孔1 μg熒光質(zhì)粒、0.75 μg psPAX2、0.25 μg pMD2.G 的劑量共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，轉(zhuǎn)染過程如圖2B所示；隨后收集表達熒光蛋白的細胞上清液，以800g離心5 min，并經(jīng)0.45 μm的濾器過濾獲得包裝完成的病毒液；收集的慢病毒用于侵染以圖2C 方式鋪板的OAR?L1 細胞，侵染時24 孔板的第1—6 列每孔分別使用100、200、300、400、500、600 μL 病毒液，并補加100 μL 新鮮培養(yǎng)液，6 h后再補加250 μL培養(yǎng)液，24 h后換液，48 h后觀察熒光并采用蛋白質(zhì)印跡法驗證（圖2B）。

1.7 慢病毒保存條件和時間

包裝完成后收集的病毒液共分為8 份，其中2份在收集后立即侵染OAR?L1細胞，其余6份分成2組分別儲存在4 和－80 ℃條件下，并在第5、10、15天各自取出1 份侵染OAR?L1 細胞，每次侵染48 h后觀察熒光表達情況。

1.8 慢病毒共侵染OAR-L1 細胞

本研究中共侵染以2種方式進行，一種是先包裝再共同侵染，另一種是同時包裝2種慢病毒質(zhì)粒，獲得混合的病毒液后再進行侵染。前者的病毒包裝過程如圖2B 所示，獲得的2 種病毒液按照1∶1 的比例侵染OAR?L1細胞；后者的包裝過程也相似，不同的是在轉(zhuǎn)染時將1 μg 紅色熒光質(zhì)粒、1 μg 綠色熒光質(zhì)粒與0.75 μg psPAX2 和0.25 μg pMD2.G 充分混合，后續(xù)過程與前面一致，48 h后觀察熒光表達情況。

圖2 轉(zhuǎn)染、侵染流程和細胞鋪板情況Fig.2 Protocols of transfection,infection and cell plating

1.9 融合其他外源蛋白的慢病毒共侵染OAR-L1細胞

pLentiCMV?EGFP?Puro 及pLentiCMV?mCherry?Puro 經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ位點雙酶切后連接入一段外源基因，構(gòu)建能夠表達特定蛋白的熒光質(zhì)粒，再根據(jù)1.7節(jié)結(jié)果選擇合適的共侵染方式進行共侵染試驗，通過觀察熒光表達情況和采用蛋白質(zhì)印跡法驗證結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計與分析

通過ImageJ 1.52v軟件統(tǒng)計轉(zhuǎn)染后表達熒光的細胞數(shù)；利用t檢驗對不同轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義；采用GraphPad Prism 6繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種熒光質(zhì)粒的表達鑒定結(jié)果

用本實驗室留存質(zhì)粒（pLentiCMV?EGFP?Puro和pLentiCMV?mCherry?Puro）轉(zhuǎn)染TOP10 后挑取單克隆，菌液PCR 鑒定結(jié)果顯示，所有克隆均擴增出長約750 bp 的目的條帶（圖3A）；BamHⅠ/SalⅠ雙酶切結(jié)果可見長約750 bp 的目的條帶（圖3B）。分 別 將 鑒 定 正 確 的pLentiCMV?EGFP?Puro 和pLentiCMV?mCherry?Puro 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T 細胞，結(jié)果（圖3C）顯示，HEK 293T 細胞分別成功表達綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果中可見與理論大小一致的目的條帶，進一步證明熒光蛋白在細胞中進行了表達。綜上所述，本實驗室留存的pLentiCMV?EGFP?Puro 和pLentiCMV?mCherry?Puro 質(zhì)粒能夠表達相應的熒光蛋白，且能在HEK 293T 細胞中高效表達，適用于后續(xù)的試驗。

圖3 熒光質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.3 Results of fluorescent plasmid identification

2.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染OAR-L1細胞的效果比較

PEI、Lipo 2000 和CF2 轉(zhuǎn)染OAR?L1 細胞的結(jié)果顯示，3 種轉(zhuǎn)染試劑對OAR?L1 細胞的轉(zhuǎn)染效率均未超過30%，且CF2 最佳轉(zhuǎn)染效率要顯著低于PEI 和Lipo 2000（圖4）。同時，根據(jù)轉(zhuǎn)染后不同組熒光細胞數(shù)目可知，3 種轉(zhuǎn)染試劑對細胞密度和試劑使用量都有比較嚴格的要求，當轉(zhuǎn)染條件為2 μL CF2 或3 μL Lipo 2000 且鋪板細胞量為2×104個時，或1 μL PEI 在鋪板細胞量為4×104個時才能達到各自最佳轉(zhuǎn)染效果（圖4）。

圖4 3種試劑轉(zhuǎn)染OAR-L1細胞的效果Fig.4 Effects of three different reagents transfecting OAR-L1 cells

2.3 慢病毒侵染OAR-L1 細胞的效果

由圖5 可見，慢病毒侵染能夠在OAR?L1 細胞中高效表達異源蛋白，且其侵染效率與細胞鋪板密度和病毒液用量沒有明顯的相關(guān)性。但該種方法得到的表達效率要顯著高于PEI、Lipo 2000、CF2組最佳轉(zhuǎn)染效率（圖6）。

圖5 慢病毒侵染OAR-L1細胞的效果Fig.5 Effects of lentivirus infecting OAR-L1 cells

圖6 不同轉(zhuǎn)染試劑最佳轉(zhuǎn)染效率下的熒光細胞數(shù)目Fig.6 Numbers of fluorescent cells under the best transfection efficiencies of different regents

2.4 儲存條件和時間對慢病毒侵染效果的影響

在4 或－80 ℃分別存儲5、10、15 d 后，慢病毒侵染OAR?L1 細胞的效果如圖7 所示。從中可知，慢病毒在4 或－80 ℃條件下保存15 d 內(nèi)并不會對侵染效率產(chǎn)生明顯影響。因此，收集的慢病毒在4或－80 ℃條件下均能保存較長時間。

圖7 不同保存條件和時間對慢病毒侵染OAR-L1細胞效果的影響Fig.7 Effects of different storage conditions and time on the infection efficiencies of OAR-L1 cells by lentivirus

2.5 不同方式包裝慢病毒共侵染OAR?L1的結(jié)果

2種慢病毒包裝方式共侵染OAR?L1細胞的結(jié)果顯示，2 種方法都能實現(xiàn)在OAR?L1 細胞中同時表達2 種外源蛋白，但分開包裝病毒再共同侵染的方式共表達效率更高（圖8）。

2.6 融合其他外源蛋白對慢病毒共侵染OAR-L1細胞的影響

2種熒光質(zhì)粒連接外源基因后，在HEK 293T細胞中包裝相應的慢病毒，再共侵染OAR?L1 細胞，結(jié)果顯示，OAR?L1 細胞表達的融合外源基因的熒光蛋白強度要明顯低于空載熒光蛋白的強度，且前者熒光共定位的比例也明顯較后者低，但其本身的共定位比例并不低（圖8～9）。

圖8 2種包裝方式對慢病毒共轉(zhuǎn)染OAR-L1細胞的影響Fig.8 Effects of two packaging methods on co-transfection of OAR-L1 cells by lentivirus

3 討論

本研究通過比較不同的轉(zhuǎn)染試劑對OAR?L1細胞的轉(zhuǎn)染/侵染效果發(fā)現(xiàn)，PEI 介導的細胞轉(zhuǎn)染效率雖然要比Lipo 2000稍高，但PEI的細胞毒性也更大，這與曹慧玲等[15]的研究結(jié)果相符。但這2 種目前公認的轉(zhuǎn)染效率較高的轉(zhuǎn)染試劑對受轉(zhuǎn)染細胞應該具有選擇性，因為它們對OAR?L1細胞的轉(zhuǎn)染效率都不超過30%，與其他類似的研究結(jié)果[4?5,6?10,16]相當；CF2 轉(zhuǎn)染OAR?L1 時也同樣沒有取得理想的效果，可能是因為這種試劑中含有的能夠提高原代細胞轉(zhuǎn)染效率的成分會抑制細胞系的轉(zhuǎn)染效率。值得關(guān)注的是，在本試驗中，雖然慢病毒包裝和侵染過程較其他轉(zhuǎn)染方式用時更長，但結(jié)合上述結(jié)果可知，慢病毒侵染的方式能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達外源熒光蛋白的目的，與在其他細胞系中獲得的研究結(jié)果[21?23]一致，較本研究中其他轉(zhuǎn)染方法而言是一種更理想的OAR?L1 細胞轉(zhuǎn)染方式。當使用pLentiCMV?EGFP?Puro 和pLentiCMV?mCherry?Puro熒光質(zhì)粒時，侵染效率超過90%，然而，這2 種質(zhì)粒融合目的基因后侵染效率會有所降低，后續(xù)的試驗還發(fā)現(xiàn)這種影響與所融合的基因相關(guān)，即是否能夠取得理想的侵染效果，可能在一定程度上也依賴于所插入的目的基因。

雖然使用慢病毒侵染的方式能夠高效地表達外源基因，但收獲的病毒液如何保存及有效期的問題值得重視。一般來說，包裝的慢病毒常通過4、－80 ℃冰箱或添加其他凍存劑等方式保存[20,24]?；诖耍驹囼炋骄苛嗽?和－80 ℃條件下保存不同時間后，病毒液侵染OAR?L1細胞效率的變化。結(jié)果顯示，無論是在4 ℃還是在－80 ℃保存條件下，15 d內(nèi)病毒液的侵染效率不會受到影響，因此，可提前包裝收集足夠的病毒液凍存后使用。另外，隨著科學研究日益深入，單個基因的轉(zhuǎn)染越來越難以滿足科研需求，因此，本研究還探索了利用慢病毒侵染的方式在OAR?L1 細胞中實現(xiàn)共轉(zhuǎn)染的條件。結(jié)果表明，分別包裝后再共同侵染OAR?L1細胞能夠獲得更高的共轉(zhuǎn)率，這種方法在融合目的基因后依然有效，這使得在OAR?L1細胞中研究基因與基因間的相互作用成為可能。

雖然，目前已證實慢病毒在細胞轉(zhuǎn)染效率和保存方面具有優(yōu)勢，但限于細胞系和毒株等試驗材料的缺乏，本研究并未就其本身是否影響細胞的各項機能、是否參與其他胞內(nèi)病原體涉及的信號通路以及是否適用于這些病原體的研究進行深入的探索。另外，近年來轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)研究越來越熱，通常的單個基因轉(zhuǎn)染或2個基因共轉(zhuǎn)并不能滿足這類研究的需求，如泛素化研究需要至少同時向細胞內(nèi)導入3個基因（靶基因、泛素化連接酶和泛素）[25?26]，本試驗尚未找到很好的方法去驗證慢病毒侵染能否滿足這類需求，因為這可能需要表達第3種甚至更多種熒光蛋白，后續(xù)可以進行更為深入的探索。

圖9 融合其他外源蛋白對慢病毒侵染OAR-L1細胞的影響Fig.9 Effects of fusing with other exogenous proteins on the infection of OAR-L1 cells by lentivirus

4 結(jié)論

本研究通過比較PEI、Lipo 2000、CF2以及慢病毒介導的4種轉(zhuǎn)染方法在OAR?L1細胞中的轉(zhuǎn)染效果，確定慢病毒侵染的方式比其他3 種方法更高效地在該細胞內(nèi)表達了外源蛋白。此外，分開包裝再共同侵染的方式能獲得更高的共轉(zhuǎn)率，而插入的目的基因會降低共轉(zhuǎn)效率且這種降低程度與插入基因自身特性相關(guān)聯(lián)。綜上所述，慢病毒介導的轉(zhuǎn)染方法能夠在難轉(zhuǎn)染細胞中實現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)基于OAR?L1 細胞對綿羊甚至其他反芻動物展開相關(guān)研究奠定基礎，同時，也能夠為探索其他難轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染方法提供參考。