甜高粱EMS誘變獲得新種質(zhì)的研究

王 煒 陳 琛 葛玉彬 羅俊杰 葉春雷

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，甘肅 蘭州 730070)

甜高粱(SorghumbicolorL. Moench)為粒用高粱的變種，是一種重要的飼草作物和能源作物[1-2]。甜高粱具有生物量大、莖稈含糖量高、抗旱耐鹽堿等優(yōu)點，適合在降水稀少、鹽堿地、貧瘠和邊際土地中種植[3-4]。近年來隨著人民生活水平的持續(xù)提高，人們對肉蛋奶等產(chǎn)品的需求日益擴大，國家適時推出農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革，為促進畜牧業(yè)的快速發(fā)展，調(diào)整種植業(yè)結(jié)構(gòu)[5]。此外，甜高粱是生產(chǎn)生物乙醇的主要作物之一，具有抗逆、耐瘠薄等特性，符合我國在“不與糧爭地，不與人爭糧”的原則下發(fā)展非糧生物質(zhì)能源的政策導(dǎo)向[6]。因此，作為能飼兼用的甜高粱在我國農(nóng)牧業(yè)的產(chǎn)業(yè)調(diào)整中具有重要意義，其中甜高粱種質(zhì)資源創(chuàng)制及新品種培育是一項重要的基礎(chǔ)性工作。

甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)是一種最常用化學(xué)誘變劑，其操作簡單易行、誘變效果好速度快，誘變產(chǎn)生的突變體主要是單基因突變，誘變后代材料穩(wěn)定，因此EMS誘變已被廣泛應(yīng)用于小麥[7-9]、大麥[10-11]、花生[12-13]、黃瓜[14-15]、亞麻[16-17]等多種作物的種質(zhì)資源創(chuàng)制和突變體庫構(gòu)建。在高粱上，研究者采用EMS誘變獲得了具有矮稈[18-21]、多分蘗[18]、早熟[19-20]、不育[22-23]等特性的突變體，但大部分這些突變體僅為早期世代材料，性狀尚未穩(wěn)定，在基礎(chǔ)研究中不能作為永久性材料保存而重復(fù)使用，在應(yīng)用研究中則不能作為種質(zhì)使用。因此，本研究以甜高粱自交系甜94為供試材料，采用EMS誘變技術(shù)進行甜高粱新種質(zhì)的創(chuàng)制，以期獲得可穩(wěn)定遺傳的特異性狀突變體材料，為甜高粱新品種的選育及其功能基因組研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甜高粱自交系甜94，由平?jīng)鍪修r(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱課題組提供。

1.2 方法

誘變劑EMS(分子式C3H8O3S，分子量124.16，M0880-5G)購自美國Sigma公司。采用WYT手持糖度儀(成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司生產(chǎn))測定含糖量；采用游標卡尺測量莖粗。

1.2.1 EMS誘變甜高粱適宜劑量與時間組合的篩選 參照Kim等[24]和董文科等[25]的方法，用磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH值7.0)分別配制0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的EMS溶液，以蒸餾水處理作為對照(CK)，終止溶液為1 mol·L-1的硫代硫酸鈉(Na2S2O3)。選取飽滿、大小一致的甜94種子，自來水沖洗5～10 min清除甜高粱種子表面的灰塵等雜質(zhì)，蒸餾水沖洗3次，將種子置于濾紙上吸干表面水分，之后放入150 mL的三角瓶中，分別加入已配制好的EMS溶液120 mL，處理時間分為8 h和16 h，各3次重復(fù)。處理期間置于搖床中(轉(zhuǎn)速60 r·min-1，溫度25℃)，黑布覆蓋搖床，防止EMS見光分解。誘變完成后，將置于搖床中的離心管取出，加入適量1 mol·L-1的Na2S2O3清洗1遍，再用濃度為100 mmol·L-1的Na2S2O3洗3遍，每次輕搖 5 min，將溶液倒掉，自來水沖洗5～6 h，之后用蒸餾水沖洗5次，每次5 min，以除去種子表面殘留的EMS；將種子置于濾紙上吸干表面水分，自然風(fēng)干后將處理后的種子放入鋪有2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿直徑10 cm)中，每個培養(yǎng)皿中加入5 mL蒸餾水，置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)(溫度25℃)。觀察種子萌發(fā)情況，2周后統(tǒng)計發(fā)芽率(germination rate，GR)、成苗率(plantlet survival rate，PSR)和致死率(lethality rate，LR)。將存活幼苗移栽入大田，1周后再次統(tǒng)計幼苗存活率。以致死率達到50%(半致死率)作為適宜的EMS誘變甜高粱的適宜濃度和時間組合[4,7]。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

成苗率=苗存活數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

致死率=(1-誘變成苗率/對照成苗率)×100%

1.2.2 甜高粱的EMS誘變處理 按照上述方法，于2015年3月26日取大小均勻一致、飽滿的甜94種子5 000粒，用篩選的適宜EMS濃度以及時間處理組合進行浸種處理。處理后的種子點播于育苗穴盤中，澆足水后置于溫室中(溫度15～28℃)，每天以噴灑形式適量澆水。出苗后將誘變后成活的M1代移栽至甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州細胞工程育種試驗地，大田覆膜，按行長6.4 m，行距和株距均為0.4 m移栽，每12行設(shè)2行對照，常規(guī)管理，開花前套袋自交，成熟后全部按單株收獲。M2～M5代按株行育苗移栽，大田覆膜，常規(guī)管理，參考何振富等[26]的方法觀察統(tǒng)計出苗率、中脈顏色、葉片大小、穗型等；并測定株高、單株鮮重等表型性狀；測定莖粗、含糖量。淘汰與對照無顯著差異的材料后按單株收獲。M2代時隨機選取200個誘變單株測定各性狀，計算誘變株各性狀的誘變系數(shù)(mutation index，MI)及分布頻率(distribution frequency，DF)。

誘變系數(shù)=誘變株性狀測定值/對照相應(yīng)性狀測定值

分布頻率=處于某性狀測定值區(qū)間內(nèi)誘變植株的個數(shù)/總誘變植株數(shù)×100%

1.2.3 部分誘變株系品質(zhì)檢測 通過逐代鑒定篩選，至M5代時部分誘變株系已基本穩(wěn)定，乳熟期取其中5份矮稈、早熟、高含糖量、白粒和散穗的代表性材料的地上部，用刀切至2～4 cm長后置于室內(nèi)陰干，粉碎后裝入自封袋，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)測試中心對樣品的部分品質(zhì)指標進行測定。其中水分采用直接干燥法[27]，粗蛋白含量用凱氏定氮法[28]，粗淀粉含量用酸水解法[29]，粗脂肪含量用殘余法[30]，鈣含量用原子吸收分光光譜法[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜的EMS處理濃度與時間組合

采用5個EMS濃度梯度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)和2個時間梯度(8 h和16 h)，共計10個組合，對甜高粱自交系甜94種子進行誘變處理。結(jié)果表明(表1)，濃度和時間對甜高粱種子發(fā)芽率、成苗率和致死率有明顯影響，表現(xiàn)出較強的濃度依賴性。1.0%/8 h、0.8%/16 h、1.0%/16 h 3種處理組合情況下成苗率均為0，致死率為100%；當(dāng)處理組合為0.2%/16 h時，甜94的致死率為51.04%，接近于半致死劑量，因此可確定0.2%/16 h為較適宜的甜高粱EMS誘變處理組合。

2.2 誘變甜高粱M1代的出苗、移栽和田間表現(xiàn)

EMS處理后共計出苗1 762株，出苗率35.24%，移栽后成活1 607株，成苗率32.14%，致死率為62.18%。受到藥物處理的原因，M1代誘變苗前期生長緩慢，出現(xiàn)許多畸形苗，生育期明顯延長，有部分誘變苗育性喪失，因此有588株未能獲得種子，10月下旬收獲時僅結(jié)實1 019株，結(jié)實率為63.41%。對照甜94呈紡錘形穗、穗型中緊、籽粒紅色、生育期140.00～155.00 d、株高280.00～315.00 cm、莖粗1.09～1.42 cm、葉面積482.00～520.00 cm2、千粒重7.50～11.30 g；與對照相比，誘變甜高粱M1代部分植株在生育期、株高、葉部、穗部、莖部、籽粒顏色和大小等性狀方面均發(fā)生明顯變異(表2)。

2.3 誘變甜高粱M2代的田間表現(xiàn)

M2代種子(M1代1 019株的籽粒)在溫室育苗后，按株行全部移栽于覆膜大田。隨機選取200份材料測定其生育期、株高、葉面積、莖粗、分蘗數(shù)、鮮重、含糖量等7個指標(表3)。結(jié)果表明，誘變甜高粱M2代生育期、株高和鮮重3個性狀的平均值分別為126.28 d、225.69 cm、0.25 kg，生育期較對照平均提前21.12 d，株高較對照平均降低66.71 cm，單株鮮重則降低0.10 kg。其他性狀方面則與對照差異較小。

表1 不同EMS濃度和處理時間對甜94種子發(fā)芽及成苗的影響Table 1 Effects of different EMS treatmenTCombinations on seed germination and plantlet survival of sweet sorghum Tian94

表2 誘變甜高粱M1代植株變異表型性狀Table 2 Phenotypic variation of some EMS induced sweet sorghum plants in M1 generation

表3 誘變甜高粱M2代性狀表現(xiàn)Table 3 Some traits of EMS induced sweet sorghum in M2 generation

進一步參照連續(xù)變數(shù)的次數(shù)分布統(tǒng)計方法，將各性狀誘變系數(shù)(即該性狀的測定值與對照平均值的比值)以不同組距分成組區(qū)間，制作成次數(shù)分布頻率表(表4)。結(jié)果表明，81%的誘變株生育期較對照提前，90%的誘變株株高較對照降低，88%的誘變株鮮重較對照降低，這與上述結(jié)果相吻合；同時也提示這些材料在控制生育期、株高、鮮重等方面的基因可能發(fā)生了突變；而莖粗、葉面積、分蘗數(shù)呈現(xiàn)近正態(tài)分布。

2.4 誘變甜高粱M3～M5代逐代鑒定篩選

在M3～M5代繼續(xù)進行了表型觀察及部分性狀鑒定，通過逐代篩選，在M5代獲得已經(jīng)基本穩(wěn)定的早熟品系2份、高含糖量品系4份、矮稈品系6份、白粒品系3份、散穗品系3份(表5)。從表中可以看出，早熟材料ZS1和ZS2分別較對照提早成熟38.14和44.14 d；高含糖量材料TG1、TG2、TG3、TG4的含糖量均在23.01%以上，較對照提高6.36個百分點(對照一般在16%～18%之間，平均16.65%)；矮稈材料AG1、AG2、AG3、AG4、AG5、AG6株高較對照降低59.02%～63.62%；白粒、散穗等材料除了粒色和穗型不同外，其余性狀與對照均無顯著區(qū)別。

從18份M5代誘變系中選擇具有代表性的早熟、高含糖量、矮稈、白粒及散穗各1份，對其品質(zhì)相關(guān)指標進行檢測(表6)。結(jié)果表明，水分含量均較對照有所降低，說明這些材料的相對干物質(zhì)量增加；1份材料的粗蛋白含量較對照有所增加，1份持平，其余略有降低；其中1份材料(TG1)的粗淀粉含量較對照提高；所有誘變系的粗脂肪含量均較對照增加；早熟材料ZS1中鈣含量達到640 mg·kg-1，較對照提高1.78倍，其余材料則較對照有所降低。尤其是TG1的水分含量、粗蛋白含量、粗淀粉含量、粗脂肪含量等4項指標均優(yōu)于對照，是一份具有開發(fā)利用潛力的材料。

表6 部分誘變甜高粱M5代性狀表現(xiàn)Table 6 Some traits of EMS induced sweet sorghum in M5 generation

3 討論

EMS誘變具有操作簡單易行、突變頻率高、誘變基因位點單一等優(yōu)點，是進行植物突變體庫構(gòu)建和種質(zhì)資源創(chuàng)制最常用的方法[32-35]。對于不同植物，甚至同一植物的不同基因型，適宜EMS誘變的處理條件并不一致[18-23, 32]。因此，在進行大規(guī)模誘變之前，需要研究誘變野生型材料的適宜EMS處理濃度和時間組合[36]。目前通常以EMS半致死率作為標準[32-34]。在高粱EMS誘變研究中，王春語等[19]、劉言龍等[20]和Xin等[37]以粒用高粱自交系BTx623種子為供體的研究結(jié)果顯示，適宜的EMS處理濃度時間組合在0.10%～0.25%/12～20 h之間；白鴻雁等[38]和范昕琦等[39]的結(jié)果則表明不同基因型高粱對EMS敏感度不同，半致死濃度也不一致，用于不同基因型以及突變體篩選的適宜EMS濃度時間處理組合在0.20%～0.35%/10～15 h之間。本研究結(jié)果為0.20%/16 h，與上述研究結(jié)果相似。

通過對EMS處理的誘變后代(M1～M5)進行連續(xù)的逐代表型觀察、鑒定和篩選，獲得基本穩(wěn)定的具有早熟、高含糖量等特性的甜高粱種質(zhì)材料18份(表5)。這些材料總體較原野生型對照的生育期提前、株高、葉面積與鮮重降低，這可能與早期誘變世代中若干材料因晚熟而未能結(jié)實而被自然淘汰、同時大部分株高較高的材料一般較晚熟等因素相關(guān)。在品質(zhì)方面，所有材料的含糖量均超過對照，測定的5份材料中水分含量低于對照，而粗脂肪含量超過對照(表6)。由此可見，這些誘變甜高粱材料在作為飼草和能源作物上，有產(chǎn)量(鮮重)降低的缺點，但在若干品質(zhì)指標上則有所提高。因此這些材料的特異性狀如早熟、矮稈、高含糖量、白粒、散穗等性狀可作為甜高粱相關(guān)性狀功能基因定位研究，而這些材料也可作為部分遺傳改良的種質(zhì)資源材料。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，適宜甜高粱自交系甜94號EMS誘變處理的干種子浸泡法濃度時間組合為0.20%/16h。與原野生型對照相比，本研究創(chuàng)制了在生育期、株高、含糖量等性狀方面具有明顯差異的突變種質(zhì)材料18份，其中早熟2份、高含糖量4份、矮稈6份、白粒3份、散穗3份。這些突變材料為甜高粱遺傳改良和功能基因研究提供了新種質(zhì)和基礎(chǔ)材料，相關(guān)誘變處理及誘變后代的逐代觀察、鑒定和篩選等方法可為甜高粱EMS誘變育種研究提供借鑒。