基于蛋白質(zhì)組解析大球蓋菇多糖促進獼猴桃生長及抗高溫的分子機制

肖文斐 柴偉國 裘劼人 忻 雅 阮松林

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院， 浙江 杭州 310024)

植物免疫誘導劑是一類能誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性的免疫活性化合物，活性糖類物質(zhì)是其中重要的類型之一[1]。殼寡糖和海藻寡糖等低聚糖能增強多種作物的抗病能力，前人對其用途和功能也進行了大量研究[2-4]。研究表明，一些多糖類物質(zhì)也具有調(diào)節(jié)植物免疫及生長的作用，如殼聚糖可促進植物生長、誘導病原菌抗性及非生物抗逆性[5-6]；黃芪多糖能夠提高小葉楊的葉綠素含量及氧化酶活性[7]；靈芝[8]、云芝[9]、香菇[10-11]多糖等多種真菌多糖被證實具有誘導植物對病毒及真菌病害的抗性、促進植物生長的作用。杭州市農(nóng)科院植物免疫誘抗課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大球蓋菇等食用菌多糖能促進水稻幼苗發(fā)育，提高其葉綠素含量及抗氧化酶活性[12]。

紅陽獼猴桃(ActinidiachinensisHongyang)屬獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)，是我國選育的首個紅肉型獼猴桃品種。鮮果營養(yǎng)豐富、食用品質(zhì)優(yōu)異，但由于其在抗病性、生長勢、抗熱性、耐貯性等方面存在缺陷，致使該品種的種植難度較大[13]。中國科學院大連化學物理研究所在陜西地區(qū)獼猴桃上應(yīng)用的寡糖類植物疫苗與噻霉酮集成防治方案，對獼猴桃潰瘍病的防效達90%左右，同時使獼猴桃產(chǎn)量增加19%，抗逆性顯著增強[14]。但多糖類物質(zhì)在獼猴桃上的應(yīng)用效果及作用機制還鮮見報道。

蛋白質(zhì)組學能從整體水平研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)組成成分及其變化規(guī)律。作為一種重要的功能基因篩選方法，蛋白質(zhì)組學也被應(yīng)用到植物誘導抗性的機制研究之中。Lematre-Guillier等[15]通過雙向電泳法揭示硫酸化修飾的β-1,3葡聚糖(sulfated β-1,3 glucan, PS3)對葡萄抗霜霉病的誘導抗性與初級代謝激活有關(guān)。Possa等[16]利用蛋白質(zhì)組學方法發(fā)現(xiàn)，綠色力量-銅鈣鹽(Greenforce CuCa)和苯并噻二唑兩種激發(fā)子對咖啡葉銹病的誘導抗性均能引起代謝調(diào)節(jié)，誘導的蛋白質(zhì)與光合作用、蛋白質(zhì)代謝和脅迫反應(yīng)有關(guān)，但兩種激發(fā)子誘導的蛋白質(zhì)不完全相同。張青等[17]通過定量蛋白質(zhì)組學研究了免疫誘導劑保康靈1號誘導黑李葉片促生長作用的分子機制。

本研究以紅陽獼猴桃為試驗材料，通過檢測大球蓋菇噴施處理后獼猴桃葉片的大小、厚度、葉綠素、多酚氧化酶指標及蛋白質(zhì)組的變化，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和蛋白質(zhì)組學技術(shù)等層次探討多糖對獼猴桃生長及抗逆性的影響，挖掘相關(guān)的功能基因及關(guān)鍵途徑，探索其促進獼猴桃生長及抗高溫的分子機制，旨在為多糖類免疫誘導劑的開發(fā)利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本試驗于2018年在臨安市清涼峰鎮(zhèn)頰口村獼猴桃基地進行。試驗所用獼猴桃品種為紅陽，從四川省蒼溪縣引進，采用山地露天栽培，株齡3年。各試驗果樹生長勢相對一致，樹勢中庸，栽培管理水平較好。大球蓋菇子實體干制品購于福建縉云食用菌家庭農(nóng)場。

兒茶酚、愈創(chuàng)木酚、巰基乙醇、苯甲基磺酰氟、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、乙二胺四乙酸，美國Sigma公司；胰蛋白酶，美國Promega公司；Amicon Ultra-0.5(10kD)超濾管，德國默克密理博公司；C18固相萃取柱，德國Qiagen公司；乙腈、甲酸、甲醇，美國Thermo Fisher公司；Tris飽和酚，上海生工公司；Bradford法蛋白定量試劑盒，上海碧云天公司；蔗糖、乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2550分光光度計，日本島津公司；調(diào)制葉綠素熒光成像系統(tǒng)IMAGING-PAM，德國WALZ公司；YMJ-B葉面積儀、YH-1厚度儀，浙江托普云公司；BX53熒光正置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；真空干燥儀5305，德國Eppendorf公司；EASY-nLC1000液相和Q-Exactive高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大球蓋菇多糖提取及田間噴施處理 參照文獻[12]方法，采用熱水浸提法提取大球蓋菇多糖并進行去蛋白處理，乙醇沉淀后真空冷凍干燥得到粗多糖。利用苯酚-硫酸法[18]測定多糖含量。

試驗設(shè)大球蓋菇多糖水劑和常規(guī)對照處理。每一處理選取兩行進行噴施。常規(guī)處理中對獼猴桃病害防治的方案如下：2月在植株萌芽前15～20 d，對獼猴桃整個園區(qū)噴施3～5波美度的石硫合劑1次；3月展葉期噴施20%噻菌銅500倍液1次；4月開花前噴施50%氯溴異氰尿酸1 500倍液1次，開花后噴施3%中生菌素800倍液、20%氰戊菊酯3 000倍液2次，間隔期10 d左右；5月噴施70%吡蟲啉15 000倍液1次，80%代森錳鋅500倍液1次；6月噴施70%甲基硫菌靈1 500倍、20%噻唑鋅600倍液、1.8%阿維菌素600倍液各1次；7月施用80%代森錳鋅500倍液、32.5%苯甲嘧菌酯1 500倍液1次、20%氰戊菊酯3 000倍液各1次；8月施用50%氯溴異氰尿酸1 500倍液1次，70%吡蟲啉15 000倍液1次。用藥間隔期一般在10～15 d。大球蓋菇多糖處理是在常規(guī)用藥的基礎(chǔ)上增設(shè)多糖水劑噴施。自2018年4月12日開始，每半個月左右，進行大球蓋菇多糖水劑與農(nóng)藥混配噴施(多糖終濃度為0.15 mg·L-1)，共噴施5次。

1.3.2 葉片參數(shù)測定及觀察 隨機選取10株獼猴桃果枝上完全成熟的葉片，每株3片，共分為3組，每組為1重復，測定面積和厚度。后續(xù)測定取樣方式與此一致。

各處理選取相同部位葉片，石蠟包埋后制作切片，番紅-固綠染色后封片，具體方法參照文獻[17]。顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus軟件測量葉片組織厚度。

1.3.3 葉綠素含量測定 稱取獼猴桃相同部位葉片0.25 g并重復3次，置于研缽中，加入5 mL 95%乙醇與少許石英砂，充分研磨至組織變白，再加入5 mL 95%乙醇，將研缽壁上的組織及液體充分洗滌后一并轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)，靜置3～5 min，用95%乙醇定容至15 mL，3 000×g離心15 min，取離心后的上清液1 mL，加95%乙醇4 mL，用分光光度計測定665、649 nm波長下的吸光度值，以95%乙醇為空白對照，葉綠素濃度(mg·L-1)=18.16×A649+6.63×A665。

1.3.4 酶活性測定 參照邱德文[19]的方法測定多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和過氧化物酶(peroxidase, POD)活性。稱取0.1 g葉片，加1.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1，pH值7.2)磨成勻漿，離心后取0.5 mL上清，加50 mmol·L-1兒茶酚溶液1.5 mL，2 mL磷酸緩沖液，40℃水浴1 h，于525 nm波長下測定吸光度值。以每克鮮重每小時的光密度(optical density, OD)大小表示PPO活性。

稱取0.1 g葉片，加1.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol·L-1， pH值6.0)磨成勻漿，離心后取0.1 mL上清，加4 mL反應(yīng)液(含0.038%愈創(chuàng)木酚和0.017% H2O2的50 mmol·L-1磷酸緩沖液，pH值6.0)，用動力學光度法測定470 nm波長下吸光度值變化。以每克鮮重每分鐘的OD值變化量表示POD活性。

1.3.5 獼猴桃葉片葉綠素熒光測定 為了明確大球蓋菇多糖處理對高溫脅迫下獼猴桃葉片的影響，在連續(xù)高溫(最高氣溫38℃～39℃)的第3日午后采集葉片，測定其Fv/Fm。參照王淑珍等[20]的方法。測定前葉片先暗適應(yīng)30 min，然后置于葉綠素熒光成像系統(tǒng)照射區(qū)，在超強的飽和脈沖光作用下測定葉片最小熒光產(chǎn)量(minimal fluorescence, Fo)和最大熒光產(chǎn)量(maximal fluorescence, Fm)以及暗適應(yīng)PSⅡ最大光合效率(Fv/Fm)。

1.3.6 獼猴桃葉片總蛋白的提取及定量 參照文獻[21]并加以改進。稱取新鮮獼猴桃葉片0.2 g，用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2 mL 離心管，迅速加入0.8 mL經(jīng)4℃預冷的蛋白提取液(0.7 mol·L-1蔗糖，0.1 mol·L-1KCl，0.5 mol·L-1Tris-HCl，50 mmol·L-1乙二胺四乙酸，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟和2%巰基乙醇，pH值7.5)混勻，再加入0.8 mL預冷的Tris飽和酚(pH值7.5)，置冰上放置30 min，期間取出振蕩3～5次，于4℃條件下5 000×g離心30 min。取上層酚液加入等量蛋白提取液，重復提取1次。取上述提取酚液，加入至少5倍體積的0.1 mol·L-1醋酸銨甲醇溶液，-20℃靜置過夜。再于4℃條件下5 000×g離心30 min，棄上清。用-20℃預冷的甲醇重復清洗2次，4℃條件下5 000×g離心30 min后取沉淀，經(jīng)真空干燥后得粗蛋白粉。用裂解液(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1Tris-HCl和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，pH值8.5)復溶粗蛋白干粉，室溫放置1 h，期間取出振蕩3～5次，然后在20℃條件下5 000×g離心15 min，取上清液用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.7 蛋白還原烷基化和酶解 參照方獻平等[22]的方法并加以改進。取150 μg蛋白樣品，用100 mmol·L-1NH4HCO3溶液定容至100 μL，按1∶10體積比加入100 mmol·L-1二硫代蘇糖醇至終濃度為10 mmol·L-1，在37℃條件下還原反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，按1∶10體積比加入500 mmol·L-1碘乙酰胺，室溫避光反應(yīng)30 min。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至Amicon Ultra-0.5(10 kD)超濾管中純化。先4℃條件下12 000×g離心15 min棄廢液，再用100 mmol·L-1NH4HCO3清洗2次，離心棄廢液。更換新的收集管，加入100 mmol·L-1NH4HCO3至總體積100 μL，按酶與蛋白質(zhì)量比1:50加入胰蛋白酶，37℃反應(yīng)12～16 h。4℃條件下12 000×g離心15 min，再向超濾管中加入100 μL的100 mmol·L-1NH4HCO3溶液，重復離心1次，合并2次離心得到的溶液即為酶解的肽段溶液。肽段經(jīng)C18固相萃取柱脫鹽處理并真空干燥。

1.3.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及分析 參照文獻[17]。真空干燥后的肽段用含0.1%甲酸的去離子水溶液復溶至1 μg·μL-1，每組分上樣2 μL。采用EASY-nLC1000液相系統(tǒng)對肽段進行分離。流動相A液為含0.1%甲酸的水溶液；B液為含0.1%甲酸的乙腈溶液。線性洗脫梯度(B液) 4%～7%，4 min；7%～14%，62 min；14%～19%，22 min；19%～34%，15 min；34%～84%，17 min；流速為200 nL·min-1。肽段經(jīng)超高效液相色譜系統(tǒng)分離、NSI離子源電離后進入Q-Exactive質(zhì)譜系統(tǒng)分析。

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用 Maxquant搜索引擎(v1.6.0.1)進行分析，檢索參數(shù)設(shè)置參照文獻[17]。檢索數(shù)據(jù)庫為獼猴桃基因組推測蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，包含39 040條蛋白序列(Hongyang_pep_v1.0.fa.gz，ftp://cucurbitgenomics.org/pub/kiwifruit/)。

1.3.9 差異蛋白篩選、功能注釋及分析 使用Perseus軟件(版本1.6.0.2)對蛋白譜峰強度進行非標記相對定量，以蛋白表達差異倍數(shù)(fold change)≥1.5倍或≤0.67倍且P<0.05為差異蛋白標準，對鑒定的蛋白進行篩選。

利用百邁客云平臺(http://www.biocloud.net)工具軟件對差異蛋白進行功能注釋及基因本體(gene ontology, GO)匹配及富集分析(P<0.05)；利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)網(wǎng)絡(luò)信號數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)進行KEGG代謝信號通路匹配及富集分析(P<0.05)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用DPSv7.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，同時采用Duncan氏法進行顯著性分析，采用WPS Office 2013制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇多糖與對照處理的獼猴桃葉片表型比較分析及葉綠素含量測定

葉片面積和厚度等性狀比較結(jié)果表明，施用大球蓋菇多糖后，獼猴桃葉片面積變大(圖1-A)，葉片厚度相比對照增加了28.9%，達極顯著差異(圖1-B)。進一步對葉片橫切面進行觀測，結(jié)果顯示處理后的葉片柵欄組織和海綿組織排列緊密，厚度增加(圖1-C)，表皮組織無明顯變化。葉綠素含量測定結(jié)果表明，處理后葉片的葉綠素含量比對照增加了57.4%，達極顯著差異(圖1-D)。

注：A：葉片表型；B：葉片厚度；C：葉片橫切面；D：葉綠素含量；直方柱上**表示差異達到 極顯著水平(P<0.01)，*表示差異為顯著水平(P<0.05)。下同。Note: A: Phenotype of leaf. B: Leaf thickness.C: Blade transverse section. D: Chlorophyll content. On the square column, ** indicates significant difference at P<0.01, while * indicates significant difference at P<0.05. The same as following.圖1 大球蓋菇多糖處理與對照的獼猴桃葉片表型及葉綠素含量比較Fig.1 Phenotype and chlorophyll content of kiwifruit leaves treated with SPS and control

2.2 大球蓋菇多糖處理對高溫脅迫下獼猴桃葉片光合特性的影響

注：A：正常溫度對照葉片；B：正常溫度處理葉片； C：高溫脅迫對照葉片； D：高溫脅迫處理葉片； E：最大光化學效率Fv/Fm。Note: A: Control leaf at normal temperature. B: Treated leaf at normal temperature. C: Control leaf at high temperature stress. D: Treated leaf at high temperature stress. E: Maximal photochemical efficiency Fv/Fm.圖2 大球蓋菇多糖處理與對照的獼猴桃葉片葉綠素熒光成像圖及最大光化學效率比較Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence images and maximal photochemical efficiency of kiwifruit leaves treated with S. rugosoannulata polysaccharides and control

葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm反映了光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ， PSII)反映了PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率以及環(huán)境因素對PSⅡ電子傳遞系統(tǒng)的影響效應(yīng)，已被廣泛用于植物的早期脅迫檢測[23]。結(jié)果如圖2所示，正常生長條件下對照和處理組葉片F(xiàn)v/Fm平均值分別為0.76和0.79；高溫脅迫后，對照葉片F(xiàn)v/Fm平均值顯著下降至0.64，而處理葉片F(xiàn)v/Fm與正常生長條件下的比值差異不顯著。說明處理組的光抑制程度較小，抗高溫性強于對照。通過后期的植株表型觀察發(fā)現(xiàn)(圖3)，對照植株在持續(xù)高溫脅迫下，葉片日灼傷害及脫落嚴重，果實數(shù)量減少；而處理植株的葉片傷害及脫落程度輕，果實數(shù)量多。

注：A：葉片表型；B：對照植株；C：處理植株。Note: A: Phenotype of leaves. B: Control plants. C: Treated plants.圖3 高溫脅迫下的大球蓋菇多糖處理與對照獼猴桃植株表型Fig.3 Phenotype of kiwifruit plants treated with S. rugosoannulata polysaccharides and control under high temperature stress

圖4 大球蓋菇多糖處理與對照的獼猴桃葉片POD和PPO活性比較Fig.4 Comparison of POD and PPO activities of leaves treated with S. rugosoannulata polysaccharide and control

2.3 大球蓋菇多糖處理對高溫脅迫下獼猴桃葉片抗氧化酶活性的影響

POD及PPO活性的高低是植物抗性的重要指標[24-26]。通過對高溫脅迫獼猴桃葉片POD和PPO活性的測定發(fā)現(xiàn)，與對照相比，大球蓋菇多糖處理后葉片POD(圖4-A)和PPO活性(圖4-B)均顯著增加，推測大球蓋菇多糖處理具有誘導抗逆性的潛在作用。

2.4 差異表達蛋白質(zhì)數(shù)量分析

通過采集高溫脅迫下的處理組及對照組獼猴桃葉片蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并進行多庫搜索分析，共鑒定到獼猴桃蛋白3 507個。利用Perseus軟件，并結(jié)合Welch’s t-test篩選出326個差異蛋白，其中大球蓋菇多糖處理相比對照上調(diào)表達蛋白166個(顯著上調(diào)1.5倍)，下調(diào)表達蛋白160個(顯著下調(diào)1.5倍)。

2.5 差異蛋白質(zhì)GO功能分類

對以上326個差異蛋白進行了GO功能注釋，按照生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)進行了分類，結(jié)果如圖5所示。在生物學進程中，差異蛋白主要參與代謝過程、細胞過程、單組織過程和刺激應(yīng)答；在分子功能分類中，差異蛋白主要為催化和連接活性類功能，還有部分轉(zhuǎn)運、抗氧化及電子載體活性類功能蛋白；而在細胞組分分類中，差異蛋白質(zhì)較多位于各種形式細胞器和細胞膜中，且往往參與了大分子復合體的組成。

2.6 差異表達蛋白的功能與代謝通路富集分析

為了進一步揭示蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，本研究對差異蛋白分別進行了GO富集和KEGG通路富集分析。GO富集分析結(jié)果表明，差異蛋白在葉綠體、葉綠體基質(zhì)、細胞質(zhì)、類囊體部分及光合膜等細胞組分子集的富集程度最高；在生物過程中，富集程度最高的5個子集的依次是光合作用、熱應(yīng)答、無機質(zhì)應(yīng)答、氧化還原過程及脅迫應(yīng)答；而催化活性、氧化還原酶活性、四吡咯結(jié)合、異構(gòu)酶活性及水解酶活性等子集的富集程度則位于分子功能的前列(圖6-A)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)(P<0.05，圖6-B)，大球蓋菇多糖參與了糖代謝、氨基酸代謝等初級代謝途徑的調(diào)節(jié)，顯著影響了α-亞麻酸代謝、維生素B6代謝、類胡蘿卜素生物合成及類黃酮生物合成途徑等次生代謝途徑。表1中列出了部分富集途徑重要差異表達蛋白的定量信息。

3 討論

柵欄組織和海綿組織是葉綠體的主要分布部位，這些組織的增厚可能是大球蓋菇多糖提高獼猴桃葉綠素含量及Fv/Fm比值的基礎(chǔ)。與此對應(yīng)的是，在本試驗的差異蛋白質(zhì)組學研究中，GO二級注釋結(jié)果顯示大球蓋菇多糖誘導的差異應(yīng)答蛋白質(zhì)在葉綠體尤其在PSⅡ中顯著富集，且11個差異蛋白均為上調(diào)表達。這些蛋白主要包括PSⅡ反應(yīng)中心核心蛋白D2，核心天線蛋白CP26、CP43和CP47，葉綠素結(jié)合蛋白及產(chǎn)氧增強蛋白等。其中產(chǎn)氧增強蛋白1(Achn091501)是所有差異蛋白中表達量上調(diào)最多的，高達222.56倍，其他蛋白的表達量分別為對照的1.51～3.76倍。光系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ, PSⅠ)的膜內(nèi)周蛋白PsaK也上調(diào)了1.85倍(表1)。PSⅠ和PSⅡ是生物光能轉(zhuǎn)換的重要場所，涉及水裂解放氧反應(yīng)和原初電荷分離等關(guān)鍵步驟，是決定光合作用效率的重要部位[27]。這些重要的光合作用相關(guān)蛋白的表達上調(diào)，為促進獼猴桃的生長發(fā)育及光合作用提供了分子基礎(chǔ)。

表1 部分富集途徑差異表達蛋白定量信息Table 1 Quantitation information of differentially expressed proteins in partial enrichment pathways

表1(續(xù))

圖6 差異表達蛋白質(zhì)的GO功能(A)和KEGG代謝通路富集(B)分析Fig.6 GO function (A) and KEGG pathway enrichment (B) analysis of differentially expressed proteins

圖5 差異表達蛋白質(zhì)的GO功能歸類分析Fig.5 GO functional category analysis of differentially expressed proteins

富集并指定參與熱應(yīng)答相關(guān)途徑的14個差異蛋白中，有13個蛋白的表達相對下調(diào)，其中大部分是熱休克蛋白類分子伴侶蛋白(表1)。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是植物在高溫等逆境環(huán)境下或發(fā)育特殊時期產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，并通過分子伴侶機制保護逆境中的細胞[28-29]。葉綠素熒光成像圖顯示，對照組葉片在高溫脅迫下受到了光抑制，而大球蓋菇處理葉片中Fv/Fm比值較為穩(wěn)定。由此可以推測對照組細胞在高溫脅迫下細胞受到傷害，啟動了熱脅迫應(yīng)答機制；而處理組細胞中蛋白相對穩(wěn)定，熱脅迫應(yīng)答還未被完全激活。此外，還有大量的差異蛋白富集在脅迫應(yīng)答相關(guān)途徑，只是基因及其表達程度不同，既有上升也有下降，說明大球蓋菇多糖對這些途徑的蛋白表達調(diào)節(jié)保持平衡。

POD可以催化許多重要酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)，參與木質(zhì)素的聚合過程，亦能催化產(chǎn)生對病原菌有毒性的酚類物質(zhì)，抑制病原菌的增殖和擴展，與植物抗病性有密切關(guān)系[24]，同時也是植物耐熱性鑒定的重要指標[26]。經(jīng)大球蓋菇多糖處理后，獼猴桃葉片中POD活性和PPO活性明顯增加。蛋白組學分析結(jié)果也表明，有9個過氧化物酶類蛋白呈現(xiàn)出差異表達，其中7個表達上調(diào)，2個下調(diào)，而過氧化物酶Achn175281的表達量上調(diào)最多，達到對照的49.10倍。差異蛋白中，還有6個與細菌應(yīng)答相關(guān)的蛋白被誘導上升表達(表1)。推測大球蓋菇多糖具有誘導抗病的潛在作用，但對病害的具體防治效果還需后續(xù)試驗進一步驗證。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)反應(yīng)是一種重要的高度保守的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，參與植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)、生物脅迫以及非生物脅迫的應(yīng)答響應(yīng)。植物在受到外界刺激后，可通過激發(fā)MAPK級聯(lián)反應(yīng)將信號傳導到細胞內(nèi)，進而啟動下游系列的防御反應(yīng)[30]。Harpin、鞭毛蛋白質(zhì)FLG22、殼寡糖等激發(fā)子都需通過MAPK應(yīng)答進行信號傳遞[31]。大球蓋菇多糖處理后誘導NTF6 和MAPK4 2個MAPK類蛋白上調(diào)表達，初步推測MAPK級聯(lián)反應(yīng)參與了其中的信號傳遞。

次生代謝產(chǎn)物是植物抵御病害和環(huán)境脅迫防御系統(tǒng)的重要組成部分，但較高的積累可能產(chǎn)生毒性并損害植物產(chǎn)品的質(zhì)量。次生代謝產(chǎn)物在植物生長與防御之間取得平衡的最佳積累量更有利于植物在逆境中健康生長[32]。與對照相比，經(jīng)大球蓋菇多糖處理后獼猴桃的α-亞麻酸代謝、維生素B6代謝、類胡蘿卜素生物合成及類黃酮生物合成途徑都受到了不同程度的調(diào)節(jié)，其中富集在α-亞麻酸代謝途徑中的差異蛋白均呈上調(diào)趨勢，而富集在其他3條代謝途徑的蛋白大多為下調(diào)表達(表1)。大球蓋菇多糖可能通過對次生產(chǎn)物代謝途徑的調(diào)節(jié)，來維持植物生長和抵抗逆境的平衡。

α-亞麻酸代謝是茉莉酸類化合物(jasmonates, JAs)生物合成的主要途徑，而JAs作為一種重要植物內(nèi)源激素廣泛參與植物生長發(fā)育和防御反應(yīng)等多種生物學過程[33]。JAs也被證實是調(diào)節(jié)植物誘導抗性的重要小分子信號物質(zhì)。如前人研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖誘導油菜抗菌核病由茉莉酸/乙烯信號途徑介導[34]；免疫誘導蛋白阿泰靈能誘導柑橘CsLOX2.1等JA合成關(guān)鍵基因的上調(diào)表達[35]；在β-1,3葡聚糖對葡萄抗霜霉病的誘導抗性中，12-氧-植物二烯酸還原酶(12-oxo-phytodienoiCAcid reductase, OPR)被建議作為誘導抗性的標記物[15]。從本研究JAs生物合成途徑蛋白被誘導上調(diào)表達的結(jié)果推測，JAs介導的信號傳導途徑可能也參與了大球蓋菇多糖對獼猴桃生長和抗逆的調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，施用大球蓋菇多糖可以使獼猴桃葉面積增加、葉片組織增厚、葉綠素含量提高。高溫脅迫條件下，經(jīng)大球蓋菇多糖處理的植株的Fv/Fm比值、過氧化物酶和多酚氧化酶活性均高于對照。蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，光合作用、脅迫應(yīng)答、氧化還原、次生代謝產(chǎn)物等相關(guān)蛋白呈現(xiàn)差異表達。綜上所述，大球蓋菇多糖具有促進獼猴桃生長發(fā)育和誘導抗性的功能，本結(jié)果為后續(xù)多糖類誘導劑研究提供了理論基礎(chǔ)。