sRNA SaaS對(duì)沙門氏菌粘附響應(yīng)規(guī)律和胞外代謝物的影響效應(yīng)

何淑雯 胡海靜 陸許秋 王浩東 王虎虎 徐幸蓮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量 安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種重要的食源性致病菌，在全球范圍內(nèi)每年可造成大量的食品安全事件并造成食品行業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。在食品加工過(guò)程中的接觸表面形成生物菌膜是沙門氏菌實(shí)現(xiàn)傳播和污染的重要途徑。生物菌膜是細(xì)菌粘附于接觸表面后，通過(guò)增殖和分泌物胞外多聚物而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物群體[3]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，控制生物菌膜形成過(guò)程的分子網(wǎng)絡(luò)受到非編碼sRNA的調(diào)控。非編碼sRNA是一類在基因組中轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的RNA。目前，生物菌膜的形成在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制已成為食品安全的研究熱點(diǎn)，但現(xiàn)有調(diào)控通路仍不能完全解釋腸炎沙門氏菌的粘附過(guò)程。sRNA SaaS (Salmonellaadhesion associated sRNA) 是近期在肉品源腸炎沙門氏菌中篩選出的一種新型調(diào)控因子，結(jié)晶紫染色試驗(yàn)結(jié)果顯示該sRNA能夠顯著抑制生物菌膜的形成，但其具體功能和調(diào)控路徑尚不清楚[4]。

生物菌膜的形成離不開(kāi)物理接觸表面的存在，在食品生產(chǎn)和日常生活中，機(jī)械加工設(shè)備和不同材質(zhì)食品盛裝器具的表面均可成為細(xì)菌粘附的載體。了解細(xì)菌在接觸表面的粘附響應(yīng)規(guī)律對(duì)于理解粘附因子的具體功能具有指導(dǎo)意義。近年來(lái)，相關(guān)研究或多以不銹鋼作為接觸面材質(zhì)加以展開(kāi)[5-6]，或?qū)Νh(huán)境溫度的設(shè)置較為單一[7-8]，而同時(shí)使用多種材質(zhì)的接觸面并在多個(gè)溫度下進(jìn)行觀測(cè)的研究相對(duì)較少。

胞外代謝物是生物菌膜的重要組成部分，解析胞外代謝物有助于更直觀有效地了解生物菌膜的形成過(guò)程及其機(jī)理。代謝組學(xué)通過(guò)對(duì)所有代謝物進(jìn)行分析，提供代謝途徑中發(fā)生變化的關(guān)鍵信息，從而揭示生物體生命活動(dòng)發(fā)生和發(fā)展的本質(zhì)[9]。廣泛靶向代謝組學(xué)(widely-targeted metabolomics)結(jié)合了靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)兩種傳統(tǒng)分析方法的優(yōu)點(diǎn)，能夠利用基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)的四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法(QTRAP)，對(duì)代謝物實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的鑒定和檢測(cè)[10]。近年來(lái)，代謝組學(xué)已廣泛運(yùn)用到微生物領(lǐng)域[11-13]。

針對(duì)上述現(xiàn)象和問(wèn)題，本研究以分離自肉品加工接觸面的腸炎沙門氏菌為試驗(yàn)對(duì)象，使用前期成功構(gòu)建的sRNA SaaS基因缺失突變株為試驗(yàn)組，野生株為對(duì)照組，對(duì)浮游態(tài)和粘附態(tài)兩種生存形式的菌體展開(kāi)試驗(yàn)；通過(guò)研究細(xì)菌的粘附響應(yīng)規(guī)律初步判定SaaS的作用條件；進(jìn)一步利用廣泛靶向代謝組學(xué)方法對(duì)胞外代謝物進(jìn)行分析，以期揭示SaaS對(duì)生物菌膜形成的分子機(jī)制提供線索，完善生物菌膜的理論體系，為研發(fā)生物菌膜新型控制技術(shù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar, TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase/tryptic soy broth，TSB)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine deoxycholate agar，XLD)，青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、乙醇，德國(guó)Merck公司。

本試驗(yàn)所用腸炎沙門氏菌(S.Entertidis NCM 61，Accession：PRJNA492709)分離自冰鮮雞肉屠宰分割臺(tái)接觸面，sRNA SaaS缺失突變株由λ-Red 同源重組技術(shù)構(gòu)建得到[3]。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO Ⅱ Advance 4生物安全柜，美國(guó)BAKER公司；SQL 1010C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠；QTRAP 6500+質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX公司；UPLC 30A色譜儀，日本SHIMADZU公司；5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)離心機(jī)，德國(guó)艾本德Eppendorf股份公司；easySpiral Pro全自動(dòng)螺旋接種儀，法國(guó)Interscience有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌液準(zhǔn)備 取凍存于-80℃的腸炎沙門氏菌野生株和突變株，室溫溶解后，在XLD平板上劃線，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于TSB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h后，吸取菌懸液并接種至新鮮的TSB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)18 h，制成初始濃度為109CFU·mL-1的菌懸液，作為工作菌液。

1.3.2 粘附響應(yīng)規(guī)律 將標(biāo)準(zhǔn)尺寸(75 mm×25 mm×1 mm)的不銹鋼、玻璃、聚丙烯3種材質(zhì)的接觸表面薄片(以下簡(jiǎn)稱“薄片”)均勻地插入塑料支架，使薄片直立地分布于可密封玻璃容器中，高壓滅菌(121℃、15 min)后備用。使用TSB培養(yǎng)基將工作菌液稀釋至102CFU·mL-1，隨后注入上述玻璃容器中，菌懸液的用量能夠使薄片一半浸沒(méi)于液體，一半暴露于空氣中。密封后，于15、20、37℃分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，培養(yǎng)過(guò)程中避免液面晃動(dòng)。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后，使用0.85%生理鹽水洗去薄片表面的浮游菌體，控干液體后將薄片投入裝有40 mL 生理鹽水的均質(zhì)袋中，使用拍擊式均質(zhì)器以每分鐘360下的速度連續(xù)拍擊1 min。接著使用生理鹽水對(duì)均質(zhì)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，并選取2～3個(gè)稀釋度，用全自動(dòng)螺旋接種儀吸取100 μL稀釋液并均勻地涂布至TSA平板，于37℃培養(yǎng)20 h后計(jì)數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3.3 胞外代謝組學(xué)分析

1.3.3.1 胞外多聚物的采集 使用TSB培養(yǎng)基將工作菌液稀釋至102CFU·mL-1，并接種于48孔細(xì)胞板，每塊孔板接入同一株菌，每孔接入800 μL稀釋液。同時(shí)，接種無(wú)菌TSB作為陰性對(duì)照。將細(xì)胞板置于37℃培養(yǎng)48 h。輕輕倒出48孔板中的培養(yǎng)基，用0.85%生理鹽水清洗3次后吸除每孔中殘留的液體。向任意一孔加入200 μL生理鹽水，使用無(wú)菌棉簽蘸取液體后，依次對(duì)每一孔壁進(jìn)行擦拭，將擦得的粘附體收集到2 mL無(wú)菌離心管中。再次向任意一孔加入400 μL生理鹽水，用移液槍反復(fù)吹打收集殘留的菌膜，隨后將液體轉(zhuǎn)移至下一微孔，重復(fù)上述操作，直至每孔中的菌膜被完全收集，將孔板和棉簽上的菌液全部轉(zhuǎn)移至上述2 mL離心管。離心(5 000×g，10 min，4℃)后，上清液即為胞外多聚物溶液(extracellular polymeric substances，EPS)[14]。每組試驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 取50 μL的EPS，向其中加入150 μL預(yù)冷的純甲醇提取劑，渦旋1 min后，放入液氮中速凍3 min，取出，冰上解凍3 min，渦旋2 min，循環(huán)3次。離心(12 000 r·min-1，10 min，4℃)后，取上清液用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS-MS)分析。

液相條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm ×100 mm； 流動(dòng)相：A相為超純水(0.04%乙酸)，B相為乙腈(0.04%乙酸)；洗脫梯度: 0 min 水/乙腈(95∶5，v/v)，11.0 min 為 5∶95 v/v，12.0 min為 5∶ 95 v/v，12.1 min 為 95∶5 v/v，14.0 min 為 95∶5 v/v；流速 0.4 mL·min-1；柱溫 40℃；進(jìn)樣量 2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)溫度500℃，質(zhì)譜電壓 5 500 V(positive)，-4 500 V(negative)，離子源氣體Ⅰ(ion source gas Ⅰ, GS Ⅰ)55 psi，氣體Ⅱ(Gas Ⅱ, GS Ⅱ)60 psi，氣簾氣(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation, CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential, DP)和碰撞能(collision energy, CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.3.3.3 代謝物定性和定量 基于靶向標(biāo)品數(shù)據(jù)庫(kù)(metware database，MWDB)對(duì)信息進(jìn)行定性分析。代謝物定量利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)分析完成。差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：變異系數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥ 2 和 FC ≤ 0.5；變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)≥ 1。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粘附響應(yīng)規(guī)律

由圖1可知，在本研究中，3種材質(zhì)的接觸表面在37℃下沙門氏菌菌體粘附數(shù)量最高，20℃次之，而15℃最低。由曲線的走勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌的粘附數(shù)量隨著時(shí)間的推移總體呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)并有緩慢下降的趨勢(shì)，這與生物菌膜形成過(guò)程中所經(jīng)歷的粘附、成熟、瓦解等關(guān)鍵階段吻合，生物菌膜生長(zhǎng)規(guī)律在其中有所體現(xiàn)。值得關(guān)注的是，在37℃下，ΔSaaS的菌膜形成能力顯著大于WT，該現(xiàn)象在3種接觸面上均有發(fā)生，并在聚丙烯表面尤為明顯；而在20和15℃下，除聚丙烯表面外并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

注：A：不銹鋼表面；B：玻璃表面；C：聚丙烯表面。內(nèi)嵌圖為37℃下粘附曲線的局部放大圖。 **代表WT與ΔSaaS在0.01水平有顯著性差異。Note：A: Stainless steel surface. B: Glass surface. C: Polypropylene surface. The inline images are a zoom of the adhesion curve at 37℃. ** indicates significant differences at 0.01 level between WT and ΔSaaS.圖1 粘附響應(yīng)規(guī)律Fig.1 Adhesion law in response to environmental conditions

2.2 胞外代謝組學(xué)

2.2.1 代謝物定量結(jié)果 腸炎沙門氏菌生物菌膜胞外代謝物的定量結(jié)果如表1所示。本研究檢測(cè)到ΔSaaS和WT的代謝物總數(shù)為275；差異代謝物總數(shù)為54，其中53個(gè)顯著上調(diào)。

2.2.2 主要差異代謝物 本研究根據(jù)差異倍數(shù)大小，對(duì)檢測(cè)到的差異代謝物進(jìn)行了排名，并將排名前20的代謝物展示如下(圖2)。在顯著上調(diào)的差異代謝物中，琥珀酸和氨基丙二酸的差異倍數(shù)最大；二乙醇胺為唯一顯著下調(diào)的差異代謝物。

2.2.3 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

2.2.3.1 差異代謝物KEGG分類 本研究對(duì)差異顯著代謝物的KEGG注釋結(jié)果按照通路類型進(jìn)行了分類，分類結(jié)果如圖3所示，縱坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名稱，橫坐標(biāo)為注釋到該通路的代謝物個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋的代謝物總數(shù)的比例。本試驗(yàn)差異代謝物的注釋結(jié)果主要集中于代謝途徑(92.5%)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(35%)、二級(jí)代謝物的生物合成(25%)、不同環(huán)境中的微生物代謝(20%)、嘧啶代謝(18%)、嘌呤代謝(15%)、氨基酸的生物合成(15%)和精氨酸和脯氨酸代謝(15%)等通路。

表1 差異代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of differential metabolites

圖2 差異代謝物條形圖Fig.2 Bar graph of differential metabolites

2.2.3.2 差異代謝物KEGG富集 本研究對(duì)差異代謝物進(jìn)行了KEGG通路富集(圖4)。本研究中的差異代謝物較為顯著地富集于代謝途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘧啶代謝、嘌呤代謝等通路。

3 討論

接觸表面材質(zhì)可能因?yàn)榇植诙取⒈砻媸杷缘忍匦缘牟煌绊懮锞さ男纬蒣15-17]。本研究以304不銹鋼、玻璃和聚丙烯塑料作為載體，并于不同環(huán)境溫度下對(duì)生物菌膜進(jìn)行培養(yǎng)，其中37℃為沙門氏菌生長(zhǎng)的最適溫度，20℃貼近大部分肉類加工車間的環(huán)境溫度，15℃用于模擬低溫。本研究發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門氏菌在不同材質(zhì)接觸表面的粘附量并無(wú)明顯差異。而De Oliveira等[18]研究禽肉源沙門氏菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌膜在玻璃、聚氯乙烯和不銹鋼上的長(zhǎng)勢(shì)不同，且玻璃最不利于其形成。該結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，可能是由于菌株的來(lái)源或種類不同。值得注意的是，在37℃下，ΔSaaS與WT的粘附差異在初始粘附和微菌落形成階段(24 h)相對(duì)較小，在菌膜成熟階段(72和96 h)明顯擴(kuò)大。說(shuō)明sRNA SaaS能夠在37℃下抑制生物菌膜的形成，且這種調(diào)控作用可能最早發(fā)生于粘附期，并在成熟期得到強(qiáng)化?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本研究進(jìn)一步對(duì)37℃下野生株與突變株生物菌膜的胞外代謝物進(jìn)行了分析。

圖3 差異代謝物KEGG分類圖Fig.3 KEGGClassification of differential metabolites

圖4 差異代謝物KEGG pathway富集結(jié)果Fig.4 Enrichment of KEGG pathways of differential metabolites

差異代謝物大量富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于膜結(jié)合蛋白，對(duì)生物菌膜的形成起到重要作用[19-20]。Vanderlinde等[20]發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的缺失會(huì)造成胞外多糖分泌減少，并使生物菌膜的形成受到嚴(yán)重?fù)p害。在本研究中，該途經(jīng)下的無(wú)機(jī)與有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的亞精胺、腐胺、甘氨酸甜菜堿等代謝物在突變株組發(fā)生了上調(diào)。sRNASaaS的缺失可能通過(guò)促進(jìn)亞精胺/腐胺結(jié)合周質(zhì)蛋白(spermidine/putrescine-binding periplasmic protein, PotD) 的合成，從而改變多胺的合成速率，并刺激生物菌膜的形成[21]；與此同時(shí)，甘氨酸甜菜堿也具有恢復(fù)和促進(jìn)生物菌膜形成的作用[22-23]。

嘌呤/嘧啶代謝途徑也富集了大量差異代謝物，腺嘌呤、尿嘧啶、肌苷等代謝物在突變株組發(fā)生上調(diào)。研究表明，核苷酸生物合成途徑與卷曲菌毛和纖維素的產(chǎn)生緊密相關(guān)，且嘧啶核苷酸的可用性能夠強(qiáng)烈影響卷曲蛋白操縱子的轉(zhuǎn)錄[24]。卷曲菌毛和纖維素是生物菌膜胞外多聚物的重要組分。前者與細(xì)菌在非生物表面的粘附和菌膜形成相關(guān)[25]，后者有助于成熟菌膜三維結(jié)構(gòu)的形成并對(duì)菌體細(xì)胞起保護(hù)作用[26]。而嘌呤生物合成途徑能刺激多糖的合成，外源尿嘧啶能觸發(fā)纖維素的合成，外源添加肌苷能使生物菌膜的形成量顯著增加[27-28]。sRNA SaaS的缺失可能通過(guò)刺激核苷酸的合成，加強(qiáng)EPS的分泌，從而促進(jìn)細(xì)胞間的粘附和生物菌膜的成熟。另一方面，嘌呤/嘧啶代謝涉及ATP、DNA與RNA的合成。胞外DNA(eDNA)作為胞外多聚物，起到維持菌膜三維立體結(jié)構(gòu)、為細(xì)胞提供底物和增強(qiáng)遺傳物質(zhì)交流的作用[29]。sRNA SaaS的缺失也可能通過(guò)促進(jìn)核甘酸的合成代謝，增加eDNA的合成與分泌，進(jìn)而促進(jìn)成熟菌膜的形成。

氨基酸代謝途徑也有較多差異代謝物富集，且N-乙酰天冬氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸等氨基酸在突變組發(fā)生上調(diào)。Rajendran等[30]在針對(duì)白色念珠菌(Candidaalbicans)的研究中也觀察到類似現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝在生物菌膜形成能力較強(qiáng)的分離株組中上調(diào)。氨基酸代謝是細(xì)菌正常生長(zhǎng)的重要條件，在生物菌膜形成早期，氨基酸水平的增加有助于菌膜成熟階段細(xì)菌生物量的增加[31]。此外，與能量代謝相關(guān)的琥珀酸[32]在本試驗(yàn)突變組也發(fā)生大幅上調(diào)，為變化最顯著的代謝物。這說(shuō)明sRNA SaaS缺失突變株可能具有更強(qiáng)的碳代謝率，能夠更快地進(jìn)行增殖，進(jìn)而能夠在生物量的維度上更快地形成生物菌膜。

綜上，sRNA SaaS可能通過(guò)抑制氨基酸代謝和碳代謝減緩細(xì)菌的增殖，同時(shí)通過(guò)抑制嘌呤/嘧啶代謝，減少卷曲菌毛、纖維素、多糖等胞外多聚物的合成與分泌，分別從菌體細(xì)胞的數(shù)量和胞外多聚物的產(chǎn)量?jī)煞矫嬉种颇c炎沙門氏菌生物菌膜的形成，并阻礙菌膜三維立體結(jié)構(gòu)的維持(圖5)。

圖5 sRNA SaaS對(duì)生物菌膜形成的作用機(jī)制Fig.5 Mechanism of sRNA SaaS on biofilm formation

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)sRNA SaaS對(duì)腸炎沙門氏菌粘附能力的影響具有溫度依賴性。在37℃下，SaaS 能夠抑制該菌在304不銹鋼、玻璃和聚丙烯塑料表面形成生物菌膜，且抑制作用在聚丙烯表面尤為明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，sRNA SaaS可能一方面通過(guò)減緩細(xì)菌的增殖，另一方面通過(guò)減少卷曲菌毛、纖維素、多糖等胞外多聚物的合成與分泌，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物菌膜形成的抑制作用。本研究成果有助于完善生物菌膜的理論體系，為揭示sRNA SaaS對(duì)生物菌膜形成的分子作用機(jī)制提供線索，為研發(fā)生物菌膜新型控制技術(shù)提供新思路。