基于Methylovorus sp. J1-1基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化吡咯喹啉醌合成

寇航 王艷梅 李彤 薄明井 張惟材 熊向華 黎明

（1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京 100071）

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一種氧化還原輔助因子［1］。近年來，越來越多的研究證明PQQ在不同生物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，具有改善機(jī)體耐受性，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)以及抗氧化等多種功能［2-4］，因此PQQ在食品，農(nóng)業(yè)和制藥工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。PQQ的合成主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法具有步驟繁瑣和成本較高的缺點(diǎn)，且環(huán)境污染嚴(yán)重，所以微生物發(fā)酵法合成PQQ越來越受到重視。目前報(bào)道能夠合成PQQ的生物類群中，甲基營(yíng)養(yǎng)菌的合成水平最高［5］。研究表明，不同的甲基營(yíng)養(yǎng)菌合成PQQ的能力不同。比如乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）與草生歐文氏菌（Erwinia herbicola）等只能合成痕量或者微量的PQQ以滿足自身代謝活動(dòng)的需要，部分菌株卻能夠合成過量的PQQ并分泌到胞外，包括生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、食甲基菌屬（Methylovorus）與甲基桿菌屬（Methylobacterium）等。

目前，誘變育種是獲得PQQ高產(chǎn)菌株的主要方法且工業(yè)化生產(chǎn)的菌株均來源于生絲微菌屬。柯崇 榕［6］對(duì) 生 絲 微 菌Hyphomicrobium denitrificansFJNU-6采用UV和NTG誘變方法結(jié)合高濃度甲醇為拮抗因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性定向馴化，得到產(chǎn)量提高一倍的突變株FJNU-R8，利用5 L發(fā)酵罐對(duì)突變株進(jìn)行分批發(fā)酵，PQQ產(chǎn)量在143 h達(dá)到1 087 mg/L。Urakami等［7］在30 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)生絲微菌Hyphomicrobiumsp.TK0441，10 d后PQQ產(chǎn)量達(dá)1 000 mg/L。鄭玲輝等［8］通過NTG誘變獲得高產(chǎn)突變株Hyphomicrobiumsp.1112-NTG-2318 在80 T發(fā)酵罐中培養(yǎng)240 h，PQQ產(chǎn)量高達(dá)1 783 mg/L。但是傳統(tǒng)的誘變育種策略很大盲目性，因此構(gòu)建微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)模型從全局的角度去系統(tǒng)研究其代謝過程，對(duì)發(fā)酵優(yōu)化和代謝工程改造提高PQQ產(chǎn)量具有重要意義。

隨著基因組測(cè)序技術(shù)、基因組學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，幾乎所有工業(yè)微生物模式菌株的全基因組都已經(jīng)公布［9］。對(duì)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋后，按照功能將基因、酶、代謝反應(yīng)及代謝物進(jìn)行分類，其中與細(xì)胞內(nèi)部代謝反應(yīng)有關(guān)的組分構(gòu)成了縱橫交錯(cuò)的代謝網(wǎng)絡(luò)，即基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)［10］。目前，GSMM已經(jīng)成為高產(chǎn)菌種構(gòu)建不可或缺的研究工具，它包含了目的微生物胞內(nèi)大部分生化反應(yīng)，可以預(yù)測(cè)高通量實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)和基因敲除對(duì)表型的影響，為系統(tǒng)研究微生物的生理代謝提供高效平臺(tái)。Monk等［11］基于構(gòu)建的iML1515模型證實(shí)GSMM能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞代謝及生理狀態(tài)。Brochado等［12］在GSMM指導(dǎo)下得到調(diào)控釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）香草醛合成的基因hsOMT，通過上調(diào)該基因的表達(dá)水平提高了香草醛的產(chǎn)量。Huang等［13］建立了天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces tsukubaensis）的GSMM，并通過模擬得到潛在的敲除和過表達(dá)基因靶點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)改造菌株的FK506產(chǎn)量均比親本菌株D852高。

Methylovorussp.J1-1是本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離的一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，在搖瓶培養(yǎng)條件下PQQ產(chǎn)量可達(dá)125 mg/L，具有良好的應(yīng)用前景［14］。本研究基于Methylovorussp. J1-1全基因組注釋信息、生物信息數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)，構(gòu)建J1-1的代謝模型，利用COBRApy［15］通過通量平衡分析（flux balance analysis，F(xiàn)BA）［16］、最小代謝調(diào)節(jié)分析（minimization of metabolic adjustment，MOMA）［17］與FSEOF（flux scanning based on enforced objective flux）［18］等方法對(duì)PQQ產(chǎn)量最大化進(jìn)行預(yù)測(cè)，作為提高J1-1合成PQQ水平的理論依據(jù)和策略指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒Methylovorussp. J1-1、質(zhì)粒pCM66-Kan與pTIG-Amp為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、快速質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒與DNA回收純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司；pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊（南京）有限公司；引物合成及測(cè)序由擎科（北京）科技股份有限公司完成；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基配置［19］用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；用于培養(yǎng)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的培養(yǎng)基：增菌（HC）培養(yǎng)基、發(fā)酵（LC）培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 質(zhì)粒構(gòu)建及熒光定量PCR所使用引物如表1所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 粗模型構(gòu)建Methylovorussp. J1-1的全基因組序列數(shù)據(jù)由本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序完成并在NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫中公開［20］。對(duì)基因序列的生化注釋采用自動(dòng)法和手動(dòng)法相結(jié)合的方式，自動(dòng)法：將基因序列上傳到ModelSEED可完成自動(dòng)注釋，基因信息被轉(zhuǎn)化為生化信息；手動(dòng)法：首先將基因序列上傳至KAAS［21］服務(wù)器上，KAAS可將基因組信息與KEGG［22］基因庫中的某一組同源氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，完成對(duì)基因功能的注釋，注釋結(jié)果包含KO（KEGG orthology）信息和KEGG通路以及功能信息。其次，使用KEGG Orthology數(shù)據(jù)庫找出與KO條目相關(guān)聯(lián)的反應(yīng)編號(hào)，此編號(hào)是以反應(yīng)酶編碼的EC（enzyme nomenclature）號(hào)的形式呈現(xiàn)的。最后，收集4個(gè)數(shù)據(jù)庫的生化反應(yīng)信息：KEGG Orthology，BIGG［23］，Enzyme［24］，Uniprot［25］，根據(jù)EC號(hào)找出對(duì)應(yīng)的反應(yīng)，完成手動(dòng)注釋。進(jìn)一步對(duì)兩次注釋的結(jié)果進(jìn)行整合，得到GSMM粗模型。

1.2.3 模型精煉 首先采用同源菌比對(duì)法去除錯(cuò)誤的反應(yīng)信息，依據(jù)粗模型的構(gòu)建流程，針對(duì)J1-1的兩 種 同 源 菌Methylobacterium extorquensAM1［26］和Methylovorus glucosetrophusSIP3-4［27］同樣構(gòu)建出代謝模型，根據(jù)兩個(gè)同源菌的模型對(duì)目標(biāo)模型進(jìn)行調(diào)整，若目標(biāo)模型中的反應(yīng)至少存在于兩個(gè)參考模型中的某一個(gè)，則保留該反應(yīng)，否則刪除該反應(yīng)信息；其次，對(duì)代謝物名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以甲醛為例，在ModelSEED中是以代號(hào)”cpd00055”表示，而在BIGG等數(shù)據(jù)庫中是以”fald_c”表示，在本研究中甲醛代謝物統(tǒng)一以”FALD［c］”表示，即代謝物的縮寫名稱的大寫形式與蛋白質(zhì)作用區(qū)間（c：胞內(nèi)，e：胞外）相結(jié)合的方式。每個(gè)反應(yīng)的亞細(xì)胞位置均使用CELLO［28］進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用KAAS和TCDB［29］注釋運(yùn)輸反應(yīng)并平衡反應(yīng)質(zhì)量和電荷信息，填補(bǔ)新陳代謝的差距。此外，還包括生物量組成和PQQ生物合成反應(yīng)。由于沒有J1-1菌體組成的詳細(xì)信息，因此參考E.coli［30］數(shù)據(jù)，主要由蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂質(zhì)、肽聚糖、脂多糖、糖原和可溶性物質(zhì)組成；PQQ合成反應(yīng)包含了特定前體的合成和整個(gè)酶促反應(yīng)過程。使用COBRApy將網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)換為化學(xué)計(jì)量模型。通過與Gapfillling［31］方法鑒定代謝缺口，并從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和公開的文獻(xiàn)中獲得的適當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行填補(bǔ)。

1.2.4 模擬方法 為了預(yù)測(cè)J1-1是否能夠利用其他單一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，將每種底物的吸收速率設(shè)置為10 mmol/gDCW/h。為了模擬在不同氮源下的生長(zhǎng)，將甲醇設(shè)置為發(fā)酵培養(yǎng)基中唯一的碳源，并將各種氮源吸收速率設(shè)置為10 mmol/gDCW/h。在模擬添加外源氨基酸對(duì)菌體生長(zhǎng)以及PQQ產(chǎn)量的影響實(shí)驗(yàn)中，將20種氨基酸的交換反應(yīng)的吸收速率分別設(shè)置為10 mmol/gDCW/h，再逐個(gè)進(jìn)行FBA分析以求得通量分布。為了考察基因敲除與過表達(dá)對(duì)模型生長(zhǎng)率以及PQQ產(chǎn)量的影響，MOMA算法應(yīng)用于基因敲除分析中，同時(shí)FSEOF算法應(yīng)用于基因過表達(dá)分析中。

1.2.5glyA和hps1過表達(dá)菌株的構(gòu)建 提取Methylovorussp. J1-1的基因組，以基因組為模板，分別以glyA-F/glyA-R、hps1-F/hps1-R引物對(duì)擴(kuò)增得到目的基因glyA和hps1。將質(zhì)粒pCM66-Kan用XbaI/KpnI雙酶切，回收后重組轉(zhuǎn)化。挑轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR與測(cè)序驗(yàn)證最終得到重組質(zhì)粒pCM66-glyA和pCM66-hps1，純化后電擊轉(zhuǎn)入J1-1感受態(tài)細(xì)胞得到過表達(dá)菌株。

1.2.6hps2敲除菌株的構(gòu)建 用引物對(duì)hps2-up-F/hps2-up-R及hps2-down-F/hps2-down-R以J1-1基因組為模板分別擴(kuò)增hps2的上、下游同源臂，同時(shí)選用引物hps2-kan-F/hps2-kan-R，以質(zhì)粒pCM66-Kan為模板擴(kuò)增Kan基因。將質(zhì)粒pTIG-Amp用EcoR I/BamH I雙酶切后回收，利用同源重組將上述片段與線性化載體進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化得到hps2敲除載體pTIG-hps2-up-kan-down。質(zhì)粒構(gòu)建成功后，擴(kuò)增打靶片段hps2-up-kan-down，純化后電擊轉(zhuǎn)入J1-1感受態(tài)細(xì)胞中利用同源雙交換原理敲除hps2，從抗性板上挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果為陽性且測(cè)序正確的即為敲除成功。

1.2.7 種子培養(yǎng) 取50 μL甘油管保存的J1-1，接種5 mL種子液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，取菌液稀釋涂布于種子固體培養(yǎng)基平板，30℃孵育60 h左右，挑單菌落，置于種子液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)36 h，用于下一步培養(yǎng)和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn) 按10%（V/V）接種量，將種子液接入初始裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的玻璃罐，30℃培養(yǎng)120 h。初始甲醇濃度為1%（V/V），然后利用甲醇電極檢測(cè)發(fā)酵液中的甲醇濃度，使發(fā)酵液中甲醇濃度控制為0.3%進(jìn)行發(fā)酵；通氣量：5 L/min；隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，pH值下降，待下降到6.0時(shí)，通過泵反饋流加氨水將pH控制在此水平。通過溶解氧與攪拌轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)將溶解氧控制在30%-35%的水平。利用分光光度法檢測(cè)生物量與PQQ含量［32］。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 通過Microsoft Office Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用STDEV函數(shù)根據(jù)樣本估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和TTEST函數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為*P＜0.05為顯著，**P＜0.01為極顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）形式表示。

2 結(jié)果

2.1 GSMM基本特征

構(gòu)建了Methylovorussp. J1-1基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)，其GSMM共有584個(gè)基因，779個(gè)生化反應(yīng)，121個(gè)交換反應(yīng)與765個(gè)代謝產(chǎn)物，依據(jù)命名規(guī)則將構(gòu)建完成的GSMM命名為iKH584?；蚋采w率達(dá)到21.3%，779個(gè)反應(yīng)中647個(gè)具有基因的注釋信息，而其余132個(gè)沒有基因關(guān)聯(lián)的反應(yīng)是根據(jù)在間隙填充過程中發(fā)現(xiàn)的生化證據(jù)或網(wǎng)絡(luò)連通性添加的。模型的生化反應(yīng)共分為12條途徑。氨基酸代謝途徑和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是最主要的兩條途徑，分別包含了138個(gè)反應(yīng)和136個(gè)反應(yīng)，占模型總反應(yīng)數(shù)量的17.72%和17.46%，詳情見圖1。

圖1 基因組代謝網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)分布Fig. 1 Distributions of reactions in GSMM

2.2 模型iKH584的評(píng)估

2.2.1 碳、氮源利用模擬與驗(yàn)證 為了對(duì)iKH584的代謝系統(tǒng)完整性進(jìn)行評(píng)估，在好氧條件下，對(duì)不同碳、氮源上的生長(zhǎng)能力進(jìn)行了預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)表明J1-1可使用甲醇、葡萄糖、果糖和乙醇作為唯一碳源，并可在硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素和氯化銨作為唯一氮源生長(zhǎng)。在9個(gè)模擬中，仿真結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室前期研究數(shù)據(jù)一致，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。表明GSMM中代謝途徑可靠，建立的模型基本正確，可以預(yù)測(cè)菌體的生長(zhǎng)。

表2 J1-1在不同碳源和氮源上的生長(zhǎng)模擬Table 2 Simulation of growing in carbon and nitrogen sources

2.2.2 外源添加氨基酸模擬與驗(yàn)證 PQQ的生物合成是以23個(gè)氨基酸組成的小肽為前體，通過一系列酶促催化反應(yīng)生成。為了模擬氨基酸代謝對(duì)菌體生長(zhǎng)以及PQQ產(chǎn)量的影響，將20種氨基酸的吸收速率分別設(shè)置為10 mmol/gDCW/h，再逐個(gè)進(jìn)行FBA分析，結(jié)果顯示添加谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）可以提高菌株的生長(zhǎng)速率和PQQ合成速率。與對(duì)照相比，添加Glu和Gln后，菌株的生長(zhǎng)速率分別提高了29.1%與14.7%，PQQ生產(chǎn)速率分別提高了11.3%和5.2%；而添加脯氨酸（Pro）并沒有明顯提高菌株的生長(zhǎng)速率，但PQQ生產(chǎn)速率提高了5.6%（圖2）。

圖2 模擬不同氨基酸添加對(duì)菌體生長(zhǎng)和PQQ合成的影響Fig. 2 Influence of simulated different amino acid additions on growth rate and PQQ synthesis

進(jìn)一步根據(jù)模擬結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在搖瓶中分別添加200 mg/L的谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸，檢測(cè)J1-1菌體生長(zhǎng)和PQQ合成，結(jié)果如表3所示。

表3 氨基酸添加對(duì)菌體生長(zhǎng)和PQQ合成的影響Table 3 Effects of amino acid addition on cell growth and PQQ synthesis

與對(duì)照組相比，添加谷氨酰胺對(duì)PQQ合成無明顯地促進(jìn)作用。但是添加谷氨酸與脯氨酸時(shí)可顯著提高PQQ的產(chǎn)量，分別提高10.4%與22.9%，且菌體量也有所提高。這一結(jié)果雖然與模型模擬結(jié)果并不完全一致，但還是基本吻合，表明該模型基本正確，可以指導(dǎo)菌株改造，提高PQQ產(chǎn)量；同時(shí)還需要在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)該模型進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，提高模型的準(zhǔn)確度。

2.3 模型iKH584的應(yīng)用與驗(yàn)證

2.3.1 基于模型iKH584模擬PQQ產(chǎn)量提高策略 將甲醇吸收速率設(shè)置為100 mmol/gDCW/h，而LC培養(yǎng)基中的其他代謝物不受限制條件下，通過MOMA與FSEOF算法鑒定提高PQQ產(chǎn)量的潛在過表達(dá)與敲除靶點(diǎn)，結(jié)果預(yù)測(cè)出8個(gè)過表達(dá)基因和11個(gè)需要敲除的基因。隨機(jī)選取2個(gè)過表達(dá)基因glyA和hps1以及1個(gè)敲除基因hps2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。glyA編碼甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（glycine hydroxymethyltransferase，［EC：2.1.2.1］），催化亞甲基四氫葉酸和甘氨酸生成絲氨酸，通過過表達(dá)glyA可改善絲氨酸的合成代謝。hps1編碼6-磷酸己酮糖 合 成 酶（3-hexulose-6-phosphate synthase，［EC：4.1.2.43］），能夠使甲醇氧化生成的甲醛與5-磷酸核酮糖（ribulose 5-phosphate，RL5P）發(fā)生縮合反應(yīng)生成6-磷酸己酮糖（hexulose 6-phosphate，HU6P），后者異構(gòu)化生成6-磷酸果糖（fructose 6-phosphate，F(xiàn)6P），隨后進(jìn)入合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的中心途徑和再生甲醛同化作用受體RL5P的重排反應(yīng)。hps1與hps2的氨基酸序列相似性達(dá)90%，推測(cè)可能是同工酶基因。GSMM模型預(yù)測(cè)過表達(dá)glyA和hps1基因和敲除hps2基因結(jié)果如圖3所示：過表達(dá)glyA和hps1基因可使PQQ生產(chǎn)速率分別提高8.3%和6.7%；敲除hps2基因可使PQQ生產(chǎn)速率提高7.4%。

圖3 單基因敲除和過表達(dá)靶基因預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of single gene knockout and overexpressed target genes

2.3.2hps1與glyA過表達(dá)菌株構(gòu)建及表型驗(yàn)證分析 將重組連接產(chǎn)物經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化于50 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取轉(zhuǎn)化子于5 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR與測(cè)序鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。分別在750 bp與1 563 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖4）。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證過表達(dá)質(zhì)粒pCM66-glyA與pCM66-hps1構(gòu)建成功。

圖4 pCM66-glyA與pCM66-hps1菌液PCR鑒定Fig. 4 Identification of pCM66-glyA and pCM66-hps1 strain culture liquid by PCR

將質(zhì)粒pCM66-glyA與pCM66-hps1以及空質(zhì)粒pCM66分別電擊入J1-1菌株進(jìn)行過表達(dá)分析，熒光定量PCR結(jié)果如圖5所示，過表達(dá)菌株的對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照菌pCM66/J1-1的2.24倍和1.95倍，表明glyA和hps1基因在自身啟動(dòng)子條件下實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)。搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表4所示，過表達(dá)菌株J1-1/pCM66-glyA與J1-1/pCM66-hps1相較于對(duì)照菌株J1-1/pCM66，PQQ產(chǎn)量分別提高20.6%與14.6%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明構(gòu)建的模型基本正確，可以用于預(yù)測(cè)過表達(dá)基因，以提高PQQ產(chǎn)量。

表4 過表達(dá)菌株表型分析Table 4 Phenotype analysis of each overexpression strain

圖5 各個(gè)菌株對(duì)數(shù)期基因表達(dá)比較Fig. 5 Comparison of gene expression in each strain during exponential phase

2.3.3hps2敲除菌株的構(gòu)建與表型驗(yàn)證分析 pTIG質(zhì)粒經(jīng)XbaI和NotI酶切成線性化載體后，與PCR擴(kuò)增hps2上游同源臂up片段、下游同源臂down片段以及卡那基因片段重組轉(zhuǎn)化，37℃培養(yǎng)至12 h以上，挑取單菌落于含有卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。陽性菌株在1 500 bp左右出現(xiàn)條帶，測(cè)序后表明成功構(gòu)建hps2基因敲除質(zhì)粒pTIGhps2-up-kan-down。利用同源雙交換原理，將構(gòu)建成功的hps2基因打靶片段電轉(zhuǎn)至J1-1感受態(tài)，以卡那作為抗性篩選標(biāo)記進(jìn)行平板篩選，30℃培養(yǎng)60 h以上，挑取單菌落，30℃ 200 r/min進(jìn)行恒溫恒速搖床培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，如圖6所示。在2 890 bp左右出現(xiàn)條帶，說明hps2基因敲除成功，成功獲得hps2敲除菌株。

圖6 J1-1△hps2菌株的PCR驗(yàn)證Fig.6 PCR verification of J1-1△hps2 strain

為了比較hps2基因敲除對(duì)菌株生長(zhǎng)及PQQ產(chǎn)量的影響，對(duì)突變株J1-1Δhps2和出發(fā)菌株J1-1在甲醇為碳源的條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，J1-1Δhps2在發(fā)酵結(jié)束時(shí)PQQ產(chǎn)量提高8.0%，達(dá)到（140.84±3.41）mg/L，與模型預(yù)測(cè)的敲除該基因可以提高PQQ產(chǎn)量的結(jié)果基本一致（表5）。

表5 hps2基因敲除菌株表型分析Table 5 Phenotype analysis of hps2 gene knockout strain

為了進(jìn)一步探究基因工程菌株J1-1Δhps2較J1-1菌株的PQQ生產(chǎn)能力，本研究通過分批補(bǔ)料發(fā)酵比較了兩株菌株的代謝特征。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，J1-1Δhps2的PQQ產(chǎn)量為812.64 mg/L，比親本菌株提高了11.1%。針對(duì)突變株甲醛代謝途徑之間的碳代謝流變化，進(jìn)一步通過熒光定量PCR分析在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期時(shí)各個(gè)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)差異情況（圖7）。敲除hps2后，甲醇脫氫酶的編碼基因mdh、ADHFDH途徑編碼甲醛脫氫酶的adhA基因與RuMP途徑的hps1基因轉(zhuǎn)錄水平均降低。H4MPT途徑編碼甲醛活化蛋白的fae基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增高（圖8）。

圖7 hps2敲除菌5 L發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Experimental results of hps2-knockout strain in 5 L fermenter

圖8 hps2敲除菌關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.8 Transcription level of key genes in hps2 - knockout strain

3 討論

GSMM提供了一種用于菌株優(yōu)化的高效方法，該方法可識(shí)別細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)的瓶頸和未知的關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)，從而可通過代謝工程手段提高PQQ的產(chǎn)量［33］。Methylovorussp. J1-1是一種典型的甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，可以將甲醇作為唯一碳源進(jìn)行PQQ生物合成。本研究構(gòu)建J1-1的基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型iKH584對(duì)J1-1的甲醇代謝和PQQ合成能力進(jìn)行模擬預(yù)測(cè)，根據(jù)模擬結(jié)果指導(dǎo)發(fā)酵條件優(yōu)化，并得到多個(gè)提高PQQ產(chǎn)量的核心代謝靶基因。

在GSMM的應(yīng)用中涉及到多種算法。這些算法通?；谝欢ǖ南拗菩詶l件和假設(shè)，比如擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)、已知的物質(zhì)流上下限、反應(yīng)計(jì)量系數(shù)約束等，再以目標(biāo)函數(shù)進(jìn)行線性規(guī)劃求得最優(yōu)值，預(yù)測(cè)不同培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)的最優(yōu)狀態(tài)［10］。特別指出的是，由于實(shí)驗(yàn)室的工程菌株并未經(jīng)過長(zhǎng)期自然選擇壓力，因此其胞內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制不會(huì)向最優(yōu)化轉(zhuǎn)變［16］。而且，在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)過程中，菌株都不能到達(dá)理想的限制條件。因此，GSMM雖然為全局理解和理性調(diào)控微生物生理代謝功能提供了最佳平臺(tái)，可以模擬菌株的生長(zhǎng)和代謝調(diào)控，但與菌株的實(shí)際生長(zhǎng)和代謝合成還是有一定差距，只要趨勢(shì)一致，基本認(rèn)為模型是一個(gè)正確的模型［10，16］。本研究通過利用該模型模擬不同碳、氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)、氨基酸添加與PQQ的生物合成、基因過表達(dá)和敲除對(duì)PQQ生物合成以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，除了添加谷氨酰胺的模擬數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致外，這可能是實(shí)驗(yàn)過程并沒有完全達(dá)到模擬算法的限制條件和假設(shè)。其它模擬數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明構(gòu)建的iKH584模型基本正確，可以用于指導(dǎo)Methylovorussp. J1-1菌株的改造和發(fā)酵優(yōu)化。當(dāng)然，隨著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不斷增加和完善，可以對(duì)模型進(jìn)行修正，讓模型更加精確。

基于構(gòu)建的iKH584模型，建立了Methylovorussp. J1-1菌株利用甲醇的核心代謝途徑（圖9）；同時(shí)，為了提高PQQ產(chǎn)量，還預(yù)測(cè)出8個(gè)過表達(dá)基因和11敲除基因，它們都是參與PQQ合成的關(guān)鍵基因。選擇其中的glyA和hps1進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)、hps2進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)，PQQ的產(chǎn)量比各自的對(duì)照產(chǎn)量分別提高了20.6%、14.6%和8.0%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。過表達(dá)glyA促進(jìn)了絲氨酸的合成，從而可轉(zhuǎn)化為通用代謝物丙酮酸，提高TCA循環(huán)代謝通量改善氨基酸代謝，因而可以明顯促進(jìn)PQQ的合成。過表達(dá)hps1促進(jìn)甲醇氧化生成的甲醛與5-磷酸核酮糖發(fā)生縮合反應(yīng)生成6-磷酸己酮糖，從而使進(jìn)入RuMP途徑中的碳代謝流量增加，為生物合成提供更多的NADPH。這說明RuMP途徑可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)還原力水平來直接影響菌株生產(chǎn)PQQ的能力。結(jié)合甲醇的核心代謝網(wǎng)絡(luò)（圖9）可以發(fā)現(xiàn)，敲除hps2基因后，mdh、hps1和adhA基因的轉(zhuǎn)錄水平都降低，而fae基因的轉(zhuǎn)錄水平提高，表明H4MPT途徑的碳代謝流升高。該途徑是甲醇完全氧化的替代機(jī)制，通過該途徑可以產(chǎn)生合成PQQ的NADPH［34］，同時(shí)可以形成絲氨酸合成的前體物質(zhì)亞甲基四氫葉酸（MethyleneH4F）并進(jìn)入絲氨酸循環(huán)［35］，從而將C1同化途徑（能夠形成多碳化合物）和TCA循環(huán)聯(lián)系起來［36］。在iKH584模型中，甲醇可轉(zhuǎn)化為12種關(guān)鍵碳前體（包括C1（Me-THF），C2（乙?；?CoA，甘氨酸），C3（絲氨酸，丙酮酸，PEP，3-磷酸甘油醛），C4（OAA，D-赤蘚糖-4-磷酸酯（E4P）），C5（α-酮戊二酸，D-核糖-5-磷酸（R5P））和C6（D-葡萄糖-6-磷酸（G6P））。H4MPT途徑和絲氨酸循環(huán)參與上述每一種前體轉(zhuǎn)換的過程，因此H4MPT途徑的碳代謝流量的增加，可通過促進(jìn)菌體整體代謝提高PQQ的產(chǎn)量，與其在甲醇同化中的關(guān)鍵作用一致。然而，該途徑在節(jié)能方面效率不高，從能量的觀點(diǎn)來看，在純甲醇營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)條件下可能被下調(diào)［37］。表明食甲基營(yíng)養(yǎng)菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了獨(dú)特的復(fù)雜的調(diào)控方式。充分解析這些基因調(diào)控方式，實(shí)現(xiàn)代謝流之間的平衡，是今后提高PQQ產(chǎn)量的主要研究思路之一。

圖9 J1-1菌株甲醇核心代謝途徑Fig. 9 Methanol core metabolic pathways of J1-1 strain

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌株導(dǎo)入外源質(zhì)粒后，含有質(zhì)粒的J1-1菌株較沒有攜帶質(zhì)粒的J1-1菌株生長(zhǎng)速度和PQQ產(chǎn)量都明顯下降（圖10），表明外源質(zhì)粒對(duì)菌株的生長(zhǎng)有很大的影響，可能是外源質(zhì)粒的復(fù)制需要菌體提供能量和材料，打破了原有的菌體生長(zhǎng)平衡，提示在今后的菌株改造過程中，過表達(dá)基因最好整合到宿主細(xì)胞基因組中，而不是用質(zhì)粒進(jìn)行游離表達(dá)。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，在以抗生素進(jìn)行重組菌株篩選時(shí)，無論是過表達(dá)還是基因敲除都會(huì)殘留抗性，導(dǎo)致本研究不能進(jìn)行3個(gè)驗(yàn)證基因的過表達(dá)和敲除的組合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。這可能是由于J1-1是從土壤中篩選出的野生型菌株，其基因操作手段不夠成熟，因此需要加強(qiáng)基因操作工具的研究，以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的組合改造。

圖10 導(dǎo)入外源質(zhì)粒對(duì)J1-1生長(zhǎng)及PQQ合成的影響Fig. 10 Influence of foreign plasmid on the cell growth of J1-1 strain and PQQ synthesis

4 結(jié)論

基于已公布的Methylovorussp.J1-1全基因組序列及參考文獻(xiàn)，利用自動(dòng)法與手動(dòng)法對(duì)基因組進(jìn)行注釋，在添加生物量方程及PQQ生物合成反應(yīng)并人工精煉后，構(gòu)建基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型iKH584。模型預(yù)測(cè)外源添加谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸、過表達(dá)glyA與hps1以及敲除hps2基因都具有PQQ合成促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模擬結(jié)果基本一致，表明構(gòu)建的模型基本正確，為優(yōu)化PQQ生物合成提供了一個(gè)有效的理論平臺(tái)。