紫鴨跖草根組織應(yīng)答銅脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

彭國穎 胡亮 黃超 楊坤 萬瑋 黃長干

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 南昌市植物資源化學(xué)利用重點實驗室，南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校友辦，南昌 330045）

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬污染日益成為危害糧食作物生產(chǎn)的因素，重金屬污染的治理亦是當(dāng)前環(huán)境科學(xué)研究的一個重點領(lǐng)域，重金屬污染包含銅、汞和鎘等污染。植物修復(fù)技術(shù)是一種新興的、高效的生物修復(fù)途徑，已得到科學(xué)界和政府機(jī)構(gòu)的認(rèn)可和運用。植物修復(fù)技術(shù)是運用綠色植物來容納、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移污染物來修復(fù)環(huán)境。植物修復(fù)具有成本低、不破壞土壤和河流生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點。因此，具備生長周期短、生物產(chǎn)量高及富集能力強(qiáng)的超積累植物對于植物修復(fù)技術(shù)的重要因素［1］，自然界的超積累植物一般很難同時具備這3點條件，而利用基因工程技術(shù)對植物進(jìn)行基因改造可以有效的解決這一問題。重金屬耐受性是超積累植物的重要特性，目前對重金屬脅迫的分子生物學(xué)研究越來越受到重視，許多學(xué)者已經(jīng)從不同角度探討了植物對重金屬的耐受機(jī)制［2］。

目前對植物修復(fù)技術(shù)的研究主要集中在兩個方面，一方面是尋找、篩選、培育超積累植物，另一方面是研究超積累植物對重金屬的耐受機(jī)制和富集機(jī)制。許多研究人員提出了植物對重金屬的耐受性機(jī)制［3-7］，然而植物對重金屬的超積累機(jī)理尚未闡明。目前發(fā)現(xiàn)的超積累植物有700多種，有20多種是銅超積累植物，其中高山木薯（Ipomoca alpina）是最典型的銅超積累植物，其銅的富集量可高達(dá)12 300 mg/kg［8］；紫鴨跖草（Setcreasea purpurea）也是一種銅超積累植物，其根部銅累積量能達(dá)1 210 mg/kg［9］。

銅是植物重要的一種微量元素，是許多酶（包括細(xì)胞色素氧化酶、質(zhì)體藍(lán)蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶）所需的氧化還原輔助因子。由于銅的氧化還原反應(yīng)使其在高濃度下是一種強(qiáng)效毒素，因此植物會利用體內(nèi)平衡機(jī)制嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)銅的濃度和活性，從而避免植物細(xì)胞銅中毒［10］。銅的解毒方法包括金屬結(jié)合配體的合成和重金屬轉(zhuǎn)運蛋白的運輸，金屬結(jié)合配體的主要類型是金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）和植物螯合肽（Phytochelatins，PCs），金屬硫蛋白的氨基酸序列是由基因編碼的，而植物螯合肽則由植物螯合素酶合成的，這兩種金屬結(jié)合配體在重金屬解毒和平衡體內(nèi)重金屬濃度中具有重要作用［11-12］；重金屬轉(zhuǎn)運蛋白包含重金屬吸收蛋白和重金屬排出蛋白兩種蛋白，重金屬轉(zhuǎn)運蛋白通過將重金屬吸收或轉(zhuǎn)移至特定的細(xì)胞部位［13］，從而降低重金屬對細(xì)胞的毒害，重金屬轉(zhuǎn)運蛋白包含ABC轉(zhuǎn)運蛋白［14］、P1B-ATPase蛋白［15］、CDF蛋白［16］、COPT蛋白［17］和YSL蛋白［18］等蛋白。植物在重金屬脅迫下，金屬結(jié)合配體與重金屬轉(zhuǎn)運蛋白在抵御重金屬中具有重要的作用。

紫鴨跖草整個植株全年呈紫紅色，枝或蔓或垂，特色鮮明，具有較高的觀賞價值。課題組以在中國最大的銅礦——江西德興銅礦區(qū)篩選并報道的銅超積累植物紫鴨跖草為實驗材料。轉(zhuǎn)錄組測序是一種全面而準(zhǔn)確的工具，可以用于闡明植物應(yīng)對重金屬、堿和低溫［20-22］等環(huán)境脅迫的反應(yīng)，李小毛等［19］發(fā)現(xiàn)紫鴨跖草在銅脅迫下會誘導(dǎo)表達(dá)特異蛋白以增強(qiáng)對銅的耐受性。因此本課題組采用高通量測序技術(shù)獲取銅脅迫下紫鴨跖草中的轉(zhuǎn)錄本并進(jìn)行分析，然后對紫鴨跖草在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及各代謝通路中對差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行分析，以期揭示紫鴨跖草在應(yīng)對銅脅迫的響應(yīng)機(jī)制，同時為分子水平上為研究紫鴨跖草的耐銅機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

剪取紫鴨跖草4 cm-6 cm的嫩莖，置于培養(yǎng)箱中的Hoagland’s（霍格蘭氏）營養(yǎng)液中培養(yǎng)，光周期為光照14 h/黑暗10 h，晝夜溫度為（25±1）℃/（20±1）℃，光照的強(qiáng)度為300 μmol/（m2·s）。待培養(yǎng)長出1 cm-3 cm的嫩根，依次在0、10、50、100、200、300、500、1 000 μmol/L Cu2+的Hoagland’s營養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，對0 μmol/L（CK）、300 μmol/L（CT1）、1 000 μmol/L（CT2）Cu2+營養(yǎng)液培養(yǎng)紫鴨跖草的根進(jìn)行取樣，迅速用液氮進(jìn)行冷凍處理，并保存在-80℃冰箱中用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒灐?/p>

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序 利用RNeasy Plus Mini Kit試劑 盒（Qiagen）提 取CK、CT1和CT2根 組 織 的總RNA，每個實驗組進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，運用Bioanalyzer 2100儀器（Agilent）驗證RNA的質(zhì)量。3組總RNA分為兩部分，一部分用于轉(zhuǎn)錄組測序，另一部分用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證轉(zhuǎn)錄組測序獲得的DEGs數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。利用Truseq RNA試劑盒（Illumina）合成cDNA文庫，由上海派森諾生物科技有限公司運用Illumina NextSeq500平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)分析 獲取測序的圖像文件后，利用由Illumina測序平臺軟件生成原始數(shù)據(jù)。低質(zhì)量的Reads會對后續(xù)的信息分析造成很大的干擾，因此采用Cutadapt去除接頭，將長度小于50 bp、序列平均質(zhì)量在Q20以下的序列平均質(zhì)量在Q20以下的Reads進(jìn)行去除，將獲取的Clean Reads使用trinity軟件拼接到轉(zhuǎn)錄本中，unigene為每個基因下最長的轉(zhuǎn)錄本［23］。將篩選出的unigene在NR數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、eggNOG數(shù)據(jù)庫、SwissProt數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對（E value≤1E-5）及功能注釋。篩選銅脅迫下紫鴨跖草根組織的差異表達(dá)基因閥值為：表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|≥1，且P-value＜0.05。

1.2.3 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證 為了驗證紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取10個DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗證［24］，使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）試劑盒將CK、CT1和CT2的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（TaKaRa）為熒光染料。qRT-PCR實驗運用LightCycler?480 II實時熒光定量PCR儀（Roche）進(jìn)行，選用泛素連接酶基因（UBI）作為內(nèi)參基因。各個反應(yīng)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，利用2-△△Ct算法計算基因的相對表達(dá)量。利用Prime5軟件設(shè)計的特異性引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與unigene功能注釋

紫鴨跖草CK、CT1和CT2的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中，登錄號為SAMN-11265427。測序下機(jī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果如表2所示CK、CT1和CT2的raw reads數(shù)在40.67 Mb-50.21 Mb之間，堿基總數(shù)在6.14 Gb-7.58 Gb之間，過濾后的Clean Reads數(shù)在38.21 Mb-47.17 Mb之間，可以發(fā)現(xiàn)Q20＞90%、Q30＞85%、Clean Reads比例＞90%，說明9組樣品的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量均合格。通過Trinity軟件對raw reads進(jìn)行組裝，共獲得82 471條長度從200 bp到13 305 bp不等的高質(zhì)量unigene（圖1），其N50長度、N90長度和平均長度分別為2 299 bp、1 149 bp、1 946 bp，表明組裝的unigene質(zhì)量高。

表2 下機(jī)數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Data statistics of disembarkation

圖1 序列長度分布圖Fig. 1 Sequence length distribution

將82 471條unigene在6個生物數(shù)據(jù)庫（NR、GO、KEGG、Pfam、eggNOG和Swissprot）中 進(jìn) 行功能注釋（表3），有8 422條unigene在5個數(shù)據(jù)庫中均得到注釋，占總unigene的10.20%，unigene在NR數(shù)據(jù)庫中獲得注釋率最高，占總unigene的82.73%；其次注釋率較高是eggNOG數(shù)據(jù)庫（81.97%）；unigene在GO、KEGG、Pfam和Swissprot的4個數(shù)據(jù)庫注釋率依次為28.17%、42.59%、33.72%和64.26%。

表3 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果匯總Table 3 Summary of database annotation results

2.2 差異表達(dá)基因分析

差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P-Value＜0.05，CK、CT1和CT2中的DEGs統(tǒng)計結(jié)果如表4所示。CT1與CK相比，DEGs的數(shù)目為5 028條，占總unigene的7.37%，其中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因分別有3 138條和1 890條；CT1與CK相比，DEGs的數(shù)目為9 982條，占總unigene的14.63%，其中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因分別有5 061條和4 921條。運用R語言ggplots 2軟件繪制CT1與CK、CT2與CK差異表達(dá)基因的火山圖（圖2），火山圖可以展示基因的差異表達(dá)和顯著性結(jié)果。可以得出，CT1、CT2與CK的DEGs差異倍數(shù)大都集中在-5-5之間，說明紫鴨跖草在不同銅濃度脅迫下的DEGs具有相似的表達(dá)趨勢。

圖2 差異表達(dá)基因的火山圖Fig. 2 Volcano map of differentially expressed genes

表4 紫鴨跖草根組織的差異表達(dá)基因分析結(jié)果統(tǒng)計Table 4 Statistical analysis of differentially expressed genes in S. purpurea roots

2.3 GO功能分類

Unigene在GO數(shù)據(jù)庫注釋中的基因功能劃分為三大類：生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞的組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），注釋在GO功能項（GO term）上的unigene有23 236條（占總unigene的28.17%），如圖3所示。unigene注釋數(shù)量較大的有生物過程中的“細(xì)胞過程”“代謝過程”“單組織過程”；細(xì)胞組分中的“細(xì)胞”“細(xì)胞部分”“細(xì)胞器”“膜部分”；分子功能中的“催化活性”和“結(jié)合蛋白”。

圖3 GO注釋統(tǒng)計Fig. 3 GO annotation statistics.

有5 028條DEGs富集在GO的332類GO term中，CT1與CK、CT2與CT1在BP、CC和MF中DEGs數(shù)量最多的前10個GO term如圖4所示。在CT1 vs CK中（圖4-A），DEGs在生物學(xué)過程的“定位”“轉(zhuǎn)運”“氧化還原過程”、細(xì)胞組分的“細(xì)胞膜”“膜成分”和分子功能的“催化活性”“水解酶活性”“轉(zhuǎn)移酶活性”等方面顯著富集。在CT2 vs CT1中（圖4-B），增加的DEGs主要富集在生物學(xué)過程的“氧化還原過程”“小分子代謝過程”“應(yīng)激反應(yīng)”、細(xì)胞組分的“細(xì)胞膜”“膜成分”和分子功能的“碳環(huán)化合物結(jié)合”“雜環(huán)化合物結(jié)合”“氧化還原酶活性”“碳水化合物代謝”等方面。

圖4 紫鴨跖草根組織在銅脅迫下差異基因的GO功能項注釋Fig. 4 GO function annotation of DEGS in S. purpurea root tissue under copper stress

2.4 eggNOG注釋分析

共有67 602條unigene在eggNOG獲得注釋，占總unigene的81.97%，將最佳比對結(jié)果的eggNOG編號賦值給相應(yīng)的基因，在以eggNOG上編號與分類目錄的對應(yīng)關(guān)系，將每一個基因歸類到eggNOG分類目錄上，獲得注釋的67 602條unigene被分為26類，注釋的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見圖5。在這26種分類中，“一般功能預(yù)測基因”的unigene數(shù)量最多（13 278條），其次是“未知功能”（10 357條）和“翻譯后修飾、蛋白翻轉(zhuǎn)、伴侶”（7 493條），數(shù)量最少的unigene分類為“細(xì)胞活性”類（4條）。其中與植物體防御機(jī)制相關(guān)的“復(fù)制、重組和修復(fù)”和“防御機(jī)制”的unigene分別有2 652條、643條。eggNOG注釋在GO注釋的基礎(chǔ)上互為補充，使得unigene功能注釋更為完善。

圖5 eggNOG注釋統(tǒng)計Fig. 5 eggNOG annotation statistics

2.5 KEGG富集分析

為進(jìn)一步獲得銅脅迫下紫鴨跖草根組織在各代謝路徑上的相關(guān)基因和基因的復(fù)雜生物學(xué)行為，將紫鴨跖草的unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋（圖6），共有35 123條unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，涉及35個路徑。紫鴨跖草unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的功能分為五類：代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和生物有機(jī)系統(tǒng)。在代謝中注釋的unigene的最多，有24 433條，其次是遺傳信息處理（7 197條）、生物系統(tǒng)（6 547條）、細(xì)胞過程（4 338條）和環(huán)境信息處理（3 346條）。

圖6 KEGG注釋統(tǒng)計Fig. 6 KEGG annotation statistics

為深入的了解DEGs的生物學(xué)功能，進(jìn)一步利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析銅脅迫下紫鴨跖草根組織的DEGs主要謝途徑。CT1 vs CK有922條DEGs注釋在31條代謝途徑，主要涉及的代謝通路有類苯丙酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；CT2 vs CT1有1 981條DEGs注釋在38條代謝通路，主要涉及的代謝通路有MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和過氧化物酶體。顯著KEGG富集通路前3的代謝通路如表5所示。DEGs在上述代謝通路具有顯著性差異，說明這些代謝通路在紫鴨跖草應(yīng)對銅脅迫上具有重要的作用。

表5 紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組顯著KEGG富集通路Table 5 The significant KEGG enrichment pathway in S. purpurea transcriptome

2.6 NR注釋分析

在NR庫上進(jìn)行注釋比對的結(jié)果匯總成比對的E-value分布圖、序列相似度分布圖和物種分布圖，如圖7所示。從E-value分布圖（圖7-A）可以看出，E-value＞1E-5的unigene是獲得注釋主要部分，共占NR數(shù)據(jù)庫注釋的71.17%；從序列相似度分布圖（圖7-B）可以得出序列相似度大于60%的有53 862條unigene，占NR數(shù)據(jù)庫注釋的78.95%。從的物種分布圖（圖7-C）可以得知，除去其它占比外，緣物種基因序列相似性最高的是芭蕉（Musa acuminatasubsp.malaccensis）（18 098條unigene，占NR數(shù)據(jù)庫注釋的26.53%），其次是油棕（Elaeis guineensis）和海棗（Phoenix dactylifera）。

圖7 NR注釋統(tǒng)計Fig. 7 Statistics of NR annotation

2.7 銅脅迫相關(guān)基因的篩選與分析

本研究為找到紫鴨跖草在銅脅迫下潛在的銅脅迫應(yīng)答基因，在GO富集和KEGG通路分析中，通過基因的注釋和閥值P-value ≤ 0.001的過濾，且篩選銅脅迫下在CT1和CT2中均有顯著性上調(diào)表達(dá)的基因，對這些基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和文獻(xiàn)查閱，獲得5條與銅脅迫相關(guān)的基因（c76816_g1、c34452_g1、c14543_g1、c11849_g1、c44409_g1）（表6），其 分別注釋為P1B型ATP酶5（HMA5）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、金屬硫蛋白基因（MT）、植物絡(luò)合素合酶（PCS）。c34452_g1、c11849_g1和c44409_g1的表達(dá)量均隨著Cu2+濃度的升高而升高，而c76816_g1和c14543_g1在CT2中表達(dá)的差異倍數(shù)略低于CT1。

表6 銅脅迫相關(guān)基因的分析Table 6 Analysis of genes related to copper stress

2.8 qRT-PCR驗證差異表達(dá)基因

為驗證銅脅迫下紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，隨機(jī)選取10個基因進(jìn)行qRT-PCR分析（圖8），其中5個是上調(diào)的基因（MTAP1、MT、IPF1、PCS、PP2C）和5個下調(diào)的基因（GSTF2、ABP1、NRP1、AQP-TIP3、α-Amylase）。通 過 將qRT-PCR數(shù)據(jù)分析所得的基因相對表達(dá)量值轉(zhuǎn)化為log2FC值與RNA-Seq數(shù)據(jù)的log2FC值進(jìn)行比較，盡管兩組數(shù)值的變化值存在差異，但兩者上下調(diào)表達(dá)趨勢與數(shù)值大致相同，表明RNA-seq所得數(shù)據(jù)具有真實性和可靠性。

圖8 差異表達(dá)基因 qRT-PCR 驗證Fig. 8 qRT-PCR verification of differential expressed genes

3 討論

高通量測序技術(shù)相對于第一代測序技術(shù)的主要優(yōu)勢是測序的速度和準(zhǔn)確性，以及大量數(shù)據(jù)的可用性。高通量測序可以同時測量大量的序列，是研究未知物種轉(zhuǎn)錄組和基因組的有力工具［25］。轉(zhuǎn)錄組測序是利用高通量測序技術(shù)將mRNA從總RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，從而快速、全面地獲取特定樣本中幾乎所有cDNAs的序列信息和含量［26］。通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序獲得的信息可用于研究基因組功能元件的差異表達(dá)、轉(zhuǎn)錄分類和應(yīng)激條件。因此，高通量轉(zhuǎn)錄組測序已成為研究基因表達(dá)的重要手段。高通量測序技術(shù)（NGS）被廣泛應(yīng)用于模型和非模型生物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究以及全基因組水平的基因表達(dá)［27-28］。例如，Koenig等［29］運用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了人工栽培與野生番茄的基因表達(dá)差異，Li等［30］利用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組分析篩選出參與茶樹耐鋁的候選響應(yīng)基因，Rathi等［31］通過轉(zhuǎn)錄組分析闡明了豌豆幼苗發(fā)育過程中脫水耐性的表達(dá)特征。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展，使得越來越多的有研發(fā)潛力的植物走進(jìn)了測序的大門，豐富的資源也使得人類進(jìn)一步邁進(jìn)進(jìn)基因的寶庫［32］。

本研究對不同Cu2+濃度處理的紫鴨跖草根組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝拼接得到82 471條紫鴨跖草unigene，為紫鴨跖草挖掘銅脅迫下重要的功能基因提供了基礎(chǔ)。由紫鴨跖草DEGs的GO term可知紫鴨跖草受到Cu2+脅迫時的防御機(jī)制。在300 μmol/L Cu2+脅迫時，一方面，膜結(jié)構(gòu)組成被激活，膜上的轉(zhuǎn)運蛋白將銅離子直接跨膜轉(zhuǎn)運至細(xì)胞的不同拓?fù)淇臻g，從而降低了銅離子的毒性作用，另一方面紫鴨跖草受到銅離子刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激，激活轉(zhuǎn)移酶功能和機(jī)體轉(zhuǎn)運功能，以此維持機(jī)體的離子平衡；在1 000 μmol/L Cu2+脅迫時，與Rai等［33］利用高通量測序技術(shù)組裝鎘脅迫下獐牙菜（Swertia japonicato）代謝路徑中涉及的DEGs富集GO term結(jié)果相近，表明這些功能項中可能存在與抵抗外界脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因。相比于CT1，紫鴨跖草根組織在CT2的應(yīng)答機(jī)制有所改變，可能是高濃度的Cu2+嚴(yán)重?fù)p傷紫鴨跖草的細(xì)胞壁與膜結(jié)構(gòu)，一方面，大量的膜結(jié)構(gòu)成分的破壞激活膜結(jié)構(gòu)修復(fù)功能，細(xì)胞內(nèi)部代謝路徑激活產(chǎn)生一系列氧化還原反應(yīng)還原Cu2+，并產(chǎn)生大量的環(huán)狀化合物來結(jié)合Cu2+和Cu2+脅迫產(chǎn)生的有機(jī)酸；另一方面，由于脅迫下糖代謝和三羧酸循環(huán)等能量供應(yīng)系統(tǒng)受阻導(dǎo)致機(jī)體通過小分子代謝過程來補充需求的能量。在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析中，紫鴨跖草的根組織在應(yīng)對Cu2+脅迫時，涉及許多重要的代謝過程，有類苯丙酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和過氧化物酶體等代謝途徑。在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了5個和響應(yīng)重金屬誘導(dǎo)有關(guān)且顯著上調(diào)的基因，注釋分別為HMA5、GPX、Cu/Zn-SOD、MT和PCS的基因，這5類基因具有應(yīng)對銅脅迫的相關(guān)依據(jù)。銅脅迫下擬南芥根系的HMA5能將Cu2+逆電化學(xué)勢差排出細(xì)胞［34］；Wang等［35］首次報道了植物AtGPX6與銅離子在分子水平上的直接結(jié)合方式和相互作用機(jī)理；Cu/Zn-SOD能夠?qū)⒅参镌阢~脅迫產(chǎn)生的活性氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫和分子氧［36］；過度表達(dá)的金屬硫蛋白能夠顯著降低銅脅迫下水稻細(xì)胞的死亡率［37］；Imahara等［38］發(fā)現(xiàn)植物的PCS對植物細(xì)胞的銅具有抗性。表明紫鴨跖草在銅脅迫下應(yīng)對Cu2+脅迫是一個復(fù)雜的生理過程，不僅僅是單一的基因響應(yīng)的，而是需要植物功能的整體運作和協(xié)調(diào)來維持植物的正常生長。本文基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探索了紫鴨跖草根組織與重金屬銅脅迫和耐銅機(jī)制的相關(guān)信息，為研究銅超積累植物紫鴨跖草應(yīng)對銅脅迫的解毒機(jī)制提供了初步的基因資源和參考依據(jù)。

4 結(jié)論

GO分析表明，DEGs在CT2、CT1富集的GO term有所異同，其中在氧化還原過程、細(xì)胞膜、膜成分等GO term均顯著富集；KEGG分析表明，類苯丙酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝通路參與紫鴨跖草應(yīng)對銅脅迫；NR分析了紫鴨跖草與芭蕉、油棕和海棗等物種的基因序列相似性；在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出了5個潛在響應(yīng)重金屬誘導(dǎo)有關(guān)且顯著上調(diào)的基因，通過分析比較基因的qRT-PCR表達(dá)譜與轉(zhuǎn)錄組測序的表達(dá)變化，驗證了銅脅迫下紫鴨跖草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有準(zhǔn)確性和可靠性。