陸地棉GhSDP1及其啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析

劉萌萌 韓立軍 劉寶玲 薛金愛 李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

棉花（Gossypium hirsutum）與油菜、大豆、花生、芝麻等一樣，是我國(guó)及全球重要油料作物。棉籽油作為棉花纖維生產(chǎn)的副產(chǎn)品既可以作食用油又可以制備生物柴油。棉籽的脂肪酸含量和組成是判定棉花油品質(zhì)的重要指標(biāo)，亦與棉籽儲(chǔ)存品質(zhì)和種子萌發(fā)等密切相關(guān)。因此，研究棉籽油脂合成和分解代謝及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于提高種子含油量、品質(zhì)改良、種子儲(chǔ)藏和種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等具有重要意義。

三酰甘油（triacylglycerol，TAG）是植物油脂的主要組成成分，也是真核生物中能量貯存的最主要形式，在多種酶的作用下由3分子長(zhǎng)鏈脂肪酸和1分子甘油酯化而成［1］。植物中貯存的三酰甘油是食品工業(yè)原料和人類重要營(yíng)養(yǎng)源，其大部分被用作食品制備和食用油［2］。種子貯藏油以三酰甘油（TAG）的形式存在，高等植物在種子萌發(fā)時(shí)期，儲(chǔ)存的三酰甘油作為能量來源為種子萌發(fā)提供所需物質(zhì)能量［3］。在種子萌發(fā)過程中，種子中儲(chǔ)存的TAG首先被TAG脂肪酶水解，釋放出游離脂肪酸，這些脂肪酸被運(yùn)輸?shù)竭^氧化物酶體中，并經(jīng)過多次β-氧化循環(huán)被氧化為乙酰輔酶A［4-5］。乙酰輔酶A為乙醛酸循環(huán)提供底物，以產(chǎn)生用于幼苗生長(zhǎng)的葡萄糖［6-7］。

三?；视椭久福═AG ligase）在生物體內(nèi)TAG的分解及利用中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，番茄脂 肪 酶LeLID1（lipase homologous to DAD1，LID1）和擬南芥脂肪酶AtSDP1（SUGAR-DEPENDENT 1，SDP1）是三?；视椭久?，在種子萌發(fā)過程中降解油脂為種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供碳源和能量［8-9］。擬南芥AtSDP1的突變導(dǎo)致種子萌發(fā)受阻［10］，通過RNAi技術(shù)抑制甘藍(lán)型油菜中BnSDP1的表達(dá)顯著增加種子中TAG的含量［11］。沉默煙草中NtSDP1導(dǎo)致葉、莖、根中的TAG含量增加，這些研究表明SDP1型的脂肪酶是植物中一種重要的三?；视椭久福?2］。SDP1編碼的酶蛋白擁有特異性的patatin結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含GXSXG保守基序，主要在種子中表達(dá)，SDP1與綠色熒光蛋白融合表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示其定位于油體表面［13］。利用RNAi技術(shù)敲除大豆中4個(gè)同源的GmSDP1，轉(zhuǎn)基因大豆植株中TAG的含量明顯提高［14］。這些研究表明脂肪酶SDP1參與植物油脂代謝，而有關(guān)其如何調(diào)控棉花油脂降解的研究未見報(bào)道。

本研究以棉花脂肪酶基因GhSDP1為切入點(diǎn)，進(jìn)行基因克隆和結(jié)構(gòu)分析，檢測(cè)時(shí)空表達(dá)，尤其是在逆境脅迫下的表達(dá)譜。進(jìn)一步克隆該基因的啟動(dòng)子和分析順式作用元件，構(gòu)建GhSDP1啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)在煙葉中瞬時(shí)表達(dá)，鑒定GhSDP1啟動(dòng)子活性，為深入解析棉籽油脂分解代謝調(diào)控機(jī)制，以及油脂代謝參與脅迫響應(yīng)機(jī)理和棉花種子萌發(fā)等生長(zhǎng)發(fā)育提供新知識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

本氏煙草（Nicotiana benthamiana），大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌 株，根 癌 農(nóng) 桿 菌（Agrobacterium tumefactions）GV3101菌種，植物表達(dá)載體pCAMBIA1301，供試材料陸地棉品種冀豐1271均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 陸地棉GhSDP1的克隆 根據(jù)模式植物擬南芥AtSDP1的蛋白序列，利用BlastP搜索棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CottonFGD（https://cottonfgd.org/），結(jié)合轉(zhuǎn)錄組中各種脅迫處理表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選鑒定獲得在非生物脅迫中上調(diào)表達(dá)的GhSDP1，依據(jù)參考基因組GhSDP1序列設(shè)計(jì)用于克隆該基因編碼序列的引物。使用Plant Total RNA Kit提取棉籽的總RNA，使用ABM公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒5×All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以棉籽cDNA為模板，采用天根公司的高保真酶Pfu DNA Polymerase進(jìn)行PCR反應(yīng)。20 μL反應(yīng)體系為10×Pfu Buffer 2 μL、dNTP Mix（2.5 mmol/L）1.6 μL、Pfu DNA Polymerase 0.5 μL、上 下游引物（表1）各0.5 μL、cDNA模板2 μL、RNasefree H2O 12.9 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè) 循 環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收目的條帶，然后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.2 陸地棉GhSDP1的表達(dá)特性分析 冀豐1271號(hào)脫絨種子直接播種于營(yíng)養(yǎng)土中，待幼苗長(zhǎng)至2片真葉且葉面完全展開時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的幼苗，將根部沖洗干凈，用吸水紙吸干根部多余的水，將幼苗的根部分別進(jìn)行200 mmol/L NaCl、15% PEG處理，處理的植株在（25±2）℃培養(yǎng)箱，連續(xù)光照條件下生長(zhǎng)，低溫處理的幼苗放于4℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0（未脅迫處理）、1、3、6、12、24和48 h采集真葉葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以棉花histone為內(nèi)參基因。使用TaKaRa公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系為TB Green Premix Ex Taq II 5 μL、上下游引物（表1）各0.4 μL、cDNA模 板0.8 μL、RNase-free H2O 3.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min；95℃ 15 s，61℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因的相對(duì)表達(dá)量分析。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。運(yùn)用LSD多重比較檢驗(yàn)（P＜0.05）進(jìn)行差異顯著性分析，通過SPSS 25.0軟件分析結(jié)果。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 煙草種植 將本氏煙草種子用70%的乙醇消毒后再經(jīng)無菌水沖洗，播種于1/2 MS營(yíng)養(yǎng)基中，置于25℃培養(yǎng)箱，18 h/8 h晝夜培養(yǎng)，待煙草幼苗剛長(zhǎng)出兩片葉子時(shí)移栽至營(yíng)養(yǎng)土（土∶蛭石=10∶1）的混合土中，取用本氏煙草（6周齡）葉片為材料。

1.2.4SDP1啟動(dòng)子序列分析 利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 及New PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace）在線網(wǎng)站分析所克隆的SDP1上游啟動(dòng)子區(qū)域上的順式作用元件，并確定啟動(dòng)子區(qū)域所包含基序的種類與數(shù)量。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)及SDP1啟動(dòng)子片段的克隆 根據(jù)NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上公布的棉花GhSDP1上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增引物pGhSDP1-F/pGhSDP1-R（表1），并在上下游引物的5′端分別加上PstI和NcoI酶切位點(diǎn)，以冀豐1271棉花基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段。

用CTAB法［15］適當(dāng)改良后提取棉籽總DNA，以所提取的棉籽DNA為模板，通過高保真聚合酶（購(gòu)自全式金公司）用引物pGhSDP1-F/pGhSDP1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收目的片段并純化。將純化、回收后得到的目的片段與克隆載體經(jīng)T4連接酶連接，其摩爾比約為3∶1。PCR后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，電泳檢測(cè)為陽(yáng)性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.6 載體連接及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 用PstI和NcoI限制性內(nèi)切酶對(duì)目的片段和pCAMBIA1301載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，回收目的片段和目的載體。利用同源重組將GhSDP1啟動(dòng)子片段（pGhSDP1）連接至去除了CaMV35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1301載體的相應(yīng)位點(diǎn)。使GhSDP1啟動(dòng)子片段代替 pCAMBIA1301載體中的CaMV35S啟動(dòng)子，并與GUS報(bào)告基因融合，載體構(gòu)建簡(jiǎn)圖如圖1所示。通過熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，平板培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。提取測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒通過液氮凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，進(jìn)行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒PCR驗(yàn)證。

圖1 構(gòu)建的pCAMBIA1301-proGhSDP1植物表達(dá)載體簡(jiǎn)圖Fig.1 Diagram of constructing pCAMBIA1301-proGhSDP1 plant expression vector

1.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)與GUS染色 挑選經(jīng)驗(yàn)證已轉(zhuǎn)入重組載體的農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌株和轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載的農(nóng)桿菌，接種于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）和50 μg/mL利福平（Rif）的LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)以未轉(zhuǎn)入任何載體的GV3101菌株作為陰性對(duì)照，28℃，100 r/min過夜培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。在4℃，5 000 r/min條件下，離心8-10 min收集菌體沉淀。用現(xiàn)配的侵染液（表2）重懸菌體沉淀，將菌液濃度調(diào)至OD600約為0.2，室溫孵育2-4 h后侵染煙草葉片。選取長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)健壯、顏色鮮綠的本氏煙草幼苗（6周齡）作為試驗(yàn)材料，用現(xiàn)配的侵染液注射侵染［16］，浸染后的煙草繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

表2 煙草農(nóng)桿菌侵染液配置Table 2 Preparation of tobacco infecting solution

按照張麗華等［17］方法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。取侵染后的新鮮組織，置于GUS染液中完全浸泡，37℃染色過夜，染色后去除GUS染液，用75%無水乙醇脫色處理至對(duì)照組葉片為無色，體視顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 陸地棉GhSDP1的克隆

根據(jù)已報(bào)道的擬南芥AtSDP1的蛋白序列，利用BlastP搜索棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CottonFGD，篩選棉花SDP1同源基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在A亞組（Gohir.A13G002700，A13）、D亞 組（Gohir.D13G00 2600，D13）各有一個(gè)拷貝，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組中各種脅迫處理表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)D亞組GhSDP1差異表達(dá)顯著，最終鑒定獲得在非生物脅迫中上調(diào)表達(dá)的GhSDP1。以冀豐1271陸地棉棉籽的cDNA為模板，克隆獲得GhSDP1編碼序列（CDS）為2 541 bp（圖2），與基因組所注釋的該基因編碼序列存在部分堿基差異，但蛋白序列一致。

圖2 GhSDP1的CDS及編碼的氨基酸序列Fig. 2 CDS of GhSDP1 gene and its encoded amino acid sequence

2.2 GhSDP1在不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析

分別用不同脅迫（200 mmol/L NaCl、4℃、15%PEG）處理棉花幼苗，觀察幼苗在不同時(shí)間點(diǎn)的表型（圖3）。各脅迫處理以0 h（未脅迫，錐形瓶中加等量營(yíng)養(yǎng)液）作為對(duì)照。鹽脅迫處理12 h后，棉花葉片仍飽滿挺拔，而脅迫24 h后，葉片開始皺縮（圖3-A）。在4℃冷脅迫處理下，脅迫24 h時(shí)，棉花葉片卷曲下垂，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片下垂程度加?。▓D3-B）。在15% PEG模擬干旱脅迫處理下，脅迫6 h時(shí)，棉花葉片卷曲下垂，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，處理24 h后葉片嚴(yán)重萎蔫（圖3-C）。

圖3 棉花幼苗在不同脅迫處理下的表型觀察Fig.3 Phenotype observation of cotton seedlings under different stress treatments

為了探究GhSDP1在非生物脅迫下的表達(dá)特性，利用qRT-PCR進(jìn)一步分析GhSDP1基因在棉花幼苗不同脅迫處理下的表達(dá)譜。用200 mmol/L NaCl、4℃、15% PEG脅迫分別處理兩片真葉的棉花幼苗，探究不同脅迫時(shí)間處理時(shí)GhSDP1的差異表達(dá)。如圖4所示，在鹽脅迫處理下，GhSDP1的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，12 h的表達(dá)量最高，約為對(duì)照（0 h，未脅迫處理）的2倍（圖4-A）。在4℃低溫處理?xiàng)l件下，處理0-6 h，GhSDP1表達(dá)量先上升后下降，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量又開始上調(diào)，24 h時(shí)的表達(dá)量約為對(duì)照的2.6倍，且二者間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）（圖4-B）。在15% PEG模擬干旱脅迫處理下，處理0-3 h，GhSDP1表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)，在6-12 h內(nèi)持續(xù)上調(diào)表達(dá)，隨著脅迫時(shí)間的增加，其表達(dá)量下降（圖4-C）。

圖4 GhSDP1在不同脅迫處理下的表達(dá)情況Fig.4 Relative expressions of GhSDP1 gene under different stress treatments

2.3 GhSDP1啟動(dòng)子克隆及順式作用元件分析

以棉籽DNA為模板，采用上游引物pGhSDP1-F和下游引物pGhSDP1-R，擴(kuò)增GhSDP1基因啟動(dòng)子片段獲得1 884 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與目的片段實(shí)際大小一致（圖5）。將其與克隆載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、測(cè)序。結(jié)果顯示，獲得的啟動(dòng)子片段與棉花參考基因組測(cè)序結(jié)果相似性達(dá)97%。

圖5 陸地棉GhSDP1啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.5 PCR amplified product of GhSDP1 promoter in G.hirsutum

利用PlantCARE對(duì)所克隆的GhSDP1上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）顯示，GhSDP1上游啟動(dòng)子除了包含大量核心啟動(dòng)子元件TATA-box以及在啟動(dòng)子和增強(qiáng)區(qū)域常見的順式作用元件CAATbox外，還包含了與光響應(yīng)有關(guān)的元件GATABOX以及一些植物激素響應(yīng)元件，如赤霉素應(yīng)答元件GAREAT等。結(jié)果表明，GhSDP1的表達(dá)可能受光、赤霉素和脫落酸等多種環(huán)境條件的影響。另外，該啟動(dòng)子區(qū)還含有一些與植物的抗逆性有關(guān)的元件，如干旱響應(yīng)相關(guān)元件MYB1AT和MYBCORE，干旱及低溫響應(yīng)元件MYCCONSENSUSAT，鹽、水楊酸及光響應(yīng)元件GT1CONSENSUS，抗病響應(yīng)相關(guān)元件BIHD1OS和損傷修復(fù)元件WBOXNTERF3等。此外，GhSDP1上游啟動(dòng)子還包含了花粉特異表達(dá)的順式作用元件 POLLEN1LELAT52。這表明GhSDP1在植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)中可能行使重要功能。

表3 棉花GhSDP1基因啟動(dòng)子部分順式作用元件Table 3 Part of putative cis-acting elements and their positions in the GhSDP1 promoter

2.4 GhSDP1啟動(dòng)子的GUS報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建

為了進(jìn)一步確定棉花GhSDP1啟動(dòng)子的活性，擴(kuò)增GhSDP1的ATG上游啟動(dòng)子區(qū)域序列1 884 bp（圖5），經(jīng)割膠回收，與去除CaMV35S啟動(dòng)子片段的pCAMBIA1301載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，并提取質(zhì)粒，經(jīng)PstI和NcoI雙酶切后，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，可獲得一條1 884 bp的DNA片段（圖6），表明GhSDP1啟動(dòng)子片段已成功連接pCAMBIA1301載體。將構(gòu)建好的pGhSDP1∷GUS表達(dá)載體通過液氮凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 mg/L Kana和50 mg/L Rif的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 表達(dá)載體重組子雙酶切電泳圖Fig.6 Electrophoresis of double-digested expression vector

2.5 GhSDP1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)分析

將攜帶有GhSDP1啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌通過注射法侵染煙草葉片，同時(shí)以轉(zhuǎn)pCAMBIA1301空載的農(nóng)桿菌侵染的煙草作陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)入任何載體的GV3101菌株侵染的煙草作為陰性對(duì)照。共培養(yǎng)后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)，通過體視顯微鏡觀察染色結(jié)果。結(jié)果顯示，攜帶有GhSDP1啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒及pCAMBIA1301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片GUS報(bào)告基因表達(dá)，葉片被染成明顯的藍(lán)色（圖7-A-B）。而未轉(zhuǎn)入任何載體的GV3101菌株侵染的煙草葉片未被染上藍(lán)色，表明沒有GUS報(bào)告基因表達(dá)（圖7-C），說明所克隆的GhSDP1啟動(dòng)子片段具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。

圖7 攜帶有pGhSDP1∷GUS載體的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片GUS染色Fig.7 GUS staining of the tobacco leaves infected by agrobacterium containing the pGhSDP1∷GUS vector

3 討論

植物種子中貯存的油脂是食用油的主要來源，同時(shí)也是重要的工業(yè)原料。油料作物育種的首要目標(biāo)是提高種子的含油量。目前，關(guān)于油脂代謝的研究主要聚焦于油脂合成積累，而對(duì)參與油脂降解過程中相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理的研究相對(duì)較少。啟動(dòng)子作為啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要，其通過RNA聚合酶進(jìn)行識(shí)別與結(jié)合，進(jìn)而來控制基因表達(dá)的起始和表達(dá)強(qiáng)度［18］。為了解陸地棉油脂降解重要基因GhSDP1表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，本研究對(duì)陸地棉油脂降解基因GhSDP1在不同脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，在非生物脅迫處理下，棉花幼苗葉片的表型發(fā)生明顯變化，其生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，結(jié)果表明，GhSDP1對(duì)鹽、干旱、低溫脅迫均有不同程度的響應(yīng)，推測(cè)可能與其啟動(dòng)子區(qū)所含有的相關(guān)參與逆境調(diào)控的應(yīng)答元件有關(guān)。

啟動(dòng)子是一種重要的順式作用元件，其在基因轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮重要作用，從而調(diào)控基因的表達(dá)水平。因此，為了進(jìn)一步探究GhSDP1的表達(dá)特性，本研究克隆了GhSDP1的啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行序列分析。分析結(jié)果顯示，GhSDP1啟動(dòng)子區(qū)除了包含了大量核心啟動(dòng)子元件TATA-box以及在啟動(dòng)子和增強(qiáng)區(qū)域常見的順式作用元件CAAT-box外，主要還包括一些與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件（MYB1AT、MYCCONSENSUSAT、GT1CONSENSUS等）。MYB1AT元件與白樺BpbHLH112啟動(dòng)子的干旱誘導(dǎo)有關(guān)［19］。玉米ZmCBF3啟動(dòng)子活性分析表明，MYCCONSENSUSAT元件參與ZmCBF3啟動(dòng)子對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)［20］。已有研究表明，GT1CONSENSUS在植物的鹽脅迫響應(yīng)中起重要作用，在鹽脅迫條件下甜瓜CmLOX08啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)［21］。同樣，白樺BpZFP4啟動(dòng)子區(qū)的GT1CONSENSUS元件也參與白樺的鹽滲透響應(yīng)［22］。以上分析表明，GhSDP1啟動(dòng)子可能對(duì)GhSDP1在不同脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)起一定的調(diào)控作用。

脫落酸、赤霉素等植物激素不僅能夠調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，其作為一種調(diào)節(jié)因子還提高了植物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性［23-26］。脫落酸是一種重要的內(nèi)源激素，噴施脫落酸能增加油菜種子含油量［27］。赤霉素的功能不同于脫落酸，其能促進(jìn)種子萌發(fā)，由于種子在萌發(fā)過程中需要消耗油脂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來滿足種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成所需的能量，因此，赤霉素有利于種子油脂消耗而不利于油脂的積累。據(jù)報(bào)道，DELLA蛋白是一種能夠限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的抑制因子，赤霉素信號(hào)能夠抑制DELLA蛋白的表達(dá)，從而上調(diào)與種子脂肪分解相關(guān)的SFARs類GDSL脂酶基因的表達(dá)，最終抑制種子中油脂的積累［28］。與脫落酸響應(yīng)元件相比，GhSDP1啟動(dòng)子區(qū)具有較多拷貝的赤霉素響應(yīng)元件。一方面，赤霉素可以促進(jìn)種子中油脂的降解；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的數(shù)目可能會(huì)影響基因表達(dá)的強(qiáng)度和誘導(dǎo)特性［29］。目前還不清楚赤霉素響應(yīng)元件GAREAT如何調(diào)控下游基因GhSDP1的表達(dá)和強(qiáng)度，以及赤霉素信號(hào)途徑在陸地棉種子油脂降解中的作用。

啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，從而檢測(cè)其活性，已被廣泛應(yīng)用于多種植物基因功能的研究。CaMV35S啟動(dòng)子在菊花中驅(qū)動(dòng)GUS外源基因的表達(dá)分析表明，2×35S啟動(dòng)子比35S啟動(dòng)子可以更加高效地促進(jìn)GUS的表達(dá)［30］。轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，魔芋AaHSFB1啟動(dòng)子主要在葉中進(jìn)行表達(dá)［31］。本研究以GUS為報(bào)告基因，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-pGhSDP1并進(jìn)行煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，所克隆的GhSDP1啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS有效表達(dá)。

目前，關(guān)于SDP1的研究已有較多報(bào)道。作為一種三?；视椭久福渲饕獏⑴c油脂降解。擬南芥sdp1缺失突變體導(dǎo)致其幼苗在與純化油體相關(guān)的脂肪酶活性方面缺陷，其發(fā)芽后生長(zhǎng)表現(xiàn)出停滯，外源提供葡萄糖可以恢復(fù)突變體正常生長(zhǎng)［8］。例如，擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)調(diào)控油脂降解的轉(zhuǎn)錄因子AtAHL4，在種子萌發(fā)過程中抑制編碼TAG脂酶SDP1的表達(dá)，從而調(diào)控植物體內(nèi)TAG的降解［32］。馬鈴薯塊莖中同時(shí)干擾StAGPase和StSDP1的表達(dá)，使得用于淀粉合成的碳流轉(zhuǎn)向脂質(zhì)生物合成，提高了其營(yíng)養(yǎng)組織中的含油量［33］。研究表明，基因的表達(dá)模式主要受上游啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控，為了探究GhSDP1的表達(dá)模式是否由于其上游啟動(dòng)子的調(diào)控，進(jìn)一步通過煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化來探究陸地棉GhSDP1啟動(dòng)子的功能。本研究中構(gòu)建的載體，目的是使SDP1啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS的表達(dá)，GUS染色的結(jié)果顯示所克隆的GhSDP1啟動(dòng)子活性較強(qiáng)。進(jìn)一步需通過啟動(dòng)子功能區(qū)的缺失分析等來確定核心順式作用元件及對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度的影響。

4 結(jié)論

成功克隆了陸地棉SDP1編碼序列（2 541 bp）和啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為1 884 bp，含有多種與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件。GhSDP1參與棉花對(duì)鹽、干旱、低溫脅迫的響應(yīng)。SDP1啟動(dòng)子有效驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，顯示啟動(dòng)子活性強(qiáng)。