乳香與醋乳香對2型糖尿病大鼠改善作用的對比研究?

宋志前， 劉振麗， 彭詩濤， 萬曉瑩， 王 淳， 寧張弛

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700)

近年來，我國糖尿病人數(shù)快速增長。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2050年我國糖尿病患者數(shù)量將居世界首位[1]。糖尿病的致死率和致殘率高[2]，對人類健康造成了重大威脅，開展糖尿病的防治工作至關(guān)重要。

乳香為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂具有活血定痛、消腫生肌的功效，是治療血瘀證的要藥之一[3]。中醫(yī)認(rèn)為，糖尿病屬于消渴范疇。據(jù)《靈樞·五變》記載：“血脈不行，轉(zhuǎn)而為熱，熱則消肌膚，故為消癉?！毖鲐灤┯谔悄虿“l(fā)展的整個過程，而乳香是治療血瘀證的重要中藥之一[4-6]。炮制是中醫(yī)臨床用藥的特色，中藥必須經(jīng)過炮制才能供臨床使用[7]。傳統(tǒng)中藥炮制理論認(rèn)為，乳香經(jīng)過醋炙后，可增強(qiáng)其活血行氣止痛功效，降低刺激性[8]。而醋乳香對2型糖尿病模型動物是否有作用，以及醋炙前后作用是否存在差異還未見研究報道。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)作為誘導(dǎo)劑，輔以高脂飼料喂養(yǎng)，構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，在給藥的過程中監(jiān)測體質(zhì)量和空腹血糖的變化，通過比較乳香、醋乳香給藥大鼠血液中的胰島素、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, GHb)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)水平和胰島病理切片，探究乳香醋炙前后對糖尿病大鼠的作用差異。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物倫理審查委員會批準(zhǔn)，倫理編號2018-066。

1 材料

1.1 動物

采用30只雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(280±10)g，購自中國食品藥品檢定研究所，實驗動物許可證號SYXK(京)2017-0005。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級動物房，環(huán)境溫度(25±2)℃，相對濕度50%～70%，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 飲片、藥品及試劑

乳香(批號805270216)，購自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定為橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.樹皮滲出的樹脂；鹽酸二甲雙胍片(0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023370)；STZ(Sigma-Aldrich，貨號101252400)；羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na，上海滬試，貨號20161025)；甲醛(天津福晨，貨號20180420)；一次性使用采血針(蘇州施萊，貨號C0944)；ACCU-CHEK血糖試紙(上海羅氏，貨號06656757)；大鼠胰島素ELISA試劑盒(上海滬峰，貨號20011649R)；糖化血紅蛋白試劑盒(上海滬峰，貨號20011650R)。

1.3 儀器

低溫離心機(jī)(型號5418R)Eppendorf；數(shù)字式超級恒溫浴槽(型號HSS-1B)上海安亭公司；酶標(biāo)儀(型號Multiskan MK3)Thermo Fisher；倒置顯微鏡(型號CKX41)Olympus；石蠟包埋機(jī)(型號OML-BMA)湖北歐美萊公司，手動旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(型號SLEE)Labsun。

2 方法

2.1 乳香及醋乳香混懸液的配制

根據(jù)前期研究篩選的實驗條件及2020版《中華人民共和國藥典》[3]制備醋乳香。稱取適量乳香采用中火加熱，電磁爐溫度達(dá)到130 ℃后投入乳香不斷翻炒，炒制約9 min后觀察到乳香表面微溶、冒煙，按照乳香與米醋10∶1的比例噴入米醋繼續(xù)翻炒，約11 min后觀察到表面呈油亮光澤時迅速取出，將炒制好的醋乳香轉(zhuǎn)移至托盤中攤放晾涼，備用。

取等量的乳香和醋乳香，相同條件下粉碎過100目篩。按照70 kg人體用藥劑量，用0.5%CMC-Na溶液制成濃度為86.4 g/L的乳香和醋乳香混懸液，4 ℃儲存?zhèn)溆?。用時室溫放置60 min，振搖使其混勻。

2.2 二甲雙胍混懸液的配制

稱取適量二甲雙胍片粉碎，過100目篩。按照70 kg人體用藥劑量，用0.5%CMC-Na溶液配成濃度為13.5 g/L的二甲雙胍混懸液，4 ℃儲存?zhèn)溆?，用時室溫放置60 min，振搖使其混勻。

2.3 STZ溶液配制

避光條件下稱取0.5 g STZ，加入50 mL 0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，充分震蕩使其溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.4 誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型

大鼠自適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。禁食12 h后，按照50 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ檸檬酸鈉緩沖液，并采用高脂飼料喂養(yǎng)，7 d后取尾尖靜脈血檢測空腹血糖，空腹血糖值大于16.0 mmol/L則為造模成功。

2.5 分組與給藥

除正常組外，將模型動物分為模型組、乳香組(0.90 g/kg)、醋乳香組(0.90 g/kg)、陽性藥組(0.135 g/kg)4組各6只。正常組與模型組給予0.5% CMC-Na溶液，陽性藥組給予鹽酸二甲雙胍混懸液，乳香組和醋乳香組分別給予臨床等效劑量的相應(yīng)藥物，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥2周。

2.6 取材

末次給藥后禁食8 h，測定各組大鼠空腹血糖。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量為0.3 mL/100 g。麻醉后固定于手術(shù)臺，打開腹腔暴露腹主動脈，以10 mL注射器收集全血分裝至血清管及EDTA抗凝管中。同時取大鼠胰腺，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，浸入10%中性甲醛緩沖液中固定。

2.7 指標(biāo)檢測

2.7.1 體質(zhì)量及空腹血糖檢測 采集大鼠的體質(zhì)量數(shù)據(jù)，每周1次，同時取尾尖靜脈血檢測空腹血糖值并記錄。

2.7.2 ELISA法檢測血中胰島素、GHb、NO及ET-1含量 參照ELISA試劑盒說明書方法，分別測定各組大鼠血清中的胰島素、NO、ET-1和EDTA抗凝全血中的GHb水平。

2.7.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosi，HE)染色法觀察胰腺病理切片 10%中性甲醛緩沖液固定24 h后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明處理，胰腺組織采用常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度約為5 μm，取石蠟切片，采用HE染色法，在光學(xué)顯微鏡下評估胰腺組織病理變化。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量和空腹血糖結(jié)果

圖1a示，體質(zhì)量結(jié)果顯示，在造模1周內(nèi)STZ誘導(dǎo)的模型組大鼠體質(zhì)量較正常組顯著下降(P<0.01)，在隨后2周的藥物干預(yù)作用下，二甲雙胍陽性藥組體質(zhì)量顯著增加(P<0.01)，乳香和醋乳香組大鼠的體質(zhì)量較模型組亦顯著增加(P<0.01)，且醋乳香對糖尿病大鼠的體質(zhì)量增加作用大于乳香(P<0.01)。

注：a.體質(zhì)量；b. 空腹血糖；與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01；與乳香組比較：&&P<0.01圖1 乳香醋炙前后對糖尿病模型大鼠體質(zhì)量及空腹血糖干預(yù)作用比較(n=6)

注：a. 胰島素；b. 糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin, GHb)；c. 一氧化氮(Nitric oxide, NO)；d. 內(nèi)皮素-1(Endothelin-1, ET-1)；與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01；與乳香組比較:&&P<0.01圖2 乳香醋炙前后對糖尿病模型大鼠血中胰島素、GHb、NO及ET-1的干預(yù)作用(n=6)

圖1b示，在造模后1周內(nèi)，各組STZ造模大鼠空腹血糖值相比于正常組顯著升高(P<0.01)，并逐漸趨于穩(wěn)定。在隨后2周的藥物干預(yù)中，乳香、醋乳香及二甲雙胍均能顯著降低大鼠空腹血糖值(P<0.05或P<0.01)，醋乳香改善血糖的作用優(yōu)于乳香(P<0.01)，且在第3周的改善作用最佳。

3.2 各組大鼠血中胰島素、GHb、NO及ET-1結(jié)果

圖2a示，與正常組比較，模型組大鼠的胰島素水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，乳香組、醋乳香組和二甲雙胍組胰島素水平均顯著提高(P<0.01)，且醋乳香組的升高作用優(yōu)于乳香組(P<0.01)。

圖2b、圖2c、圖2d示，與正常組比較，模型組大鼠GHb、NO、ET-1水平均顯著提升(P<0.01)；與模型組比較，乳香組、醋乳香組和二甲雙胍組血中GHb、NO、ET-1水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且醋乳香組的降低作用均優(yōu)于乳香組(P<0.01)。

3.3 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果

圖3示，正常組大鼠胰島分布于腺泡之間呈球形，邊緣整齊，胰泡細(xì)胞無變性、壞死等病變。而模型組大鼠細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)不規(guī)則，胰島萎縮。二甲雙胍組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)顯著改善，乳香組和醋乳香組較模型組大鼠均有所改善，且醋乳香的干預(yù)效果優(yōu)于乳香。

注：a.正常組； b.模型組；c.乳香組； d.醋乳香組；e.二甲雙胍組圖3 乳香醋炙前后對糖尿病模型大鼠胰腺組織的干預(yù)作用(HE×200)

4 討論

目前國外臨床研究顯示，乳香可以有效治療糖尿病，糖尿病患者以250 mg日服用劑量連續(xù)服用8周后，其空腹血糖、GHb和甘油三酯均顯著降低[9]。另有報道，以900 mg/d劑量的乳香干預(yù)2型糖尿病患者6周后，患者血清中的高密度脂蛋白、膽固醇和果糖胺水平均顯著下降；谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均極顯著降低[10，11]。Azadmehr等[12]通過臨床研究證實，乳香可以顯著降低空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)、GHb、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，具有抗氧化、降糖、降脂的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，乳香在降低糖尿病模型大鼠血糖的同時，還能降低炎性因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的分泌[13]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，元氣虛衰、氣血津液留滯導(dǎo)致的血瘀是2型糖尿病的病因病機(jī)之一[14，15]。現(xiàn)代臨床和實驗研究證實，在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中，瘀血作為致病因素貫穿始終。祝諶予最先提出糖尿病“瘀血為患”的觀點[16]，并發(fā)現(xiàn)臨床大多數(shù)糖尿病患者具有舌質(zhì)紫暗、舌上有瘀點或瘀斑、舌下青紫或見面部瘀斑等血瘀證表現(xiàn)，行活血化瘀法治療后病情有較大改善，故將血瘀列為糖尿病的重要病機(jī)[17]。而林蘭認(rèn)為血瘀是糖尿病的重要病理產(chǎn)物，也是重要的致病因素，影響糖尿病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后[18]。在糖尿病病理狀態(tài)下，氣、血、津液運(yùn)化失調(diào)產(chǎn)生的痰、瘀、濁、毒在血脈形成蓄積[19]，臟腑之中玄府運(yùn)化失調(diào)產(chǎn)生“糖毒”與諸邪滋生“濁毒”，日久損傷絡(luò)脈，氣虛無力推動血脈中的濁毒，又可導(dǎo)致“流滯”的發(fā)生[14]。乳香氣香能香竄調(diào)氣，味辛能散瘀活血，性溫能通經(jīng)絡(luò)，內(nèi)能宣通臟腑氣血，外能透達(dá)經(jīng)絡(luò)，可用于一切氣滯血瘀諸證，包括2型糖尿病的防治。

乳香醋炙一直是中醫(yī)藥臨床的用藥特色，研究顯示炮制可以增強(qiáng)中藥療效。本研究結(jié)果表明，乳香醋炙后可以顯著提升2型糖尿病大鼠的胰島素水平，降低空腹血糖及GHb含量，抑制NO及ET-1水平，可見醋炙確實提升了乳香對2型糖尿病的改善作用。

醋炙對乳香化學(xué)成分的影響是改變其藥效作用的基礎(chǔ)，乳香最主要的活性成分是三萜類的乳香酸成分[19-21]，主要包括11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid，KBA)和3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)、β-乳香酸(β-boswellic acid，β-BA)等[22-24]。課題組前期研究結(jié)果表明，乳香醋炙前后乳香酸類成分變化明顯，其中AKBA與β-BA的含量大大提升[25，26]，同時還發(fā)現(xiàn)具有9,11-去氫結(jié)構(gòu)的乳香酸成分在醋炙后含量增加了10.8倍之多。此外，乳香醋炙過程的炮制輔料醋也同樣對乳香活血作用的改善發(fā)揮了積極作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，醋中含有豐富的具有活血止痛作用的川芎嗪、四氫哈爾滿堿、麥角胺等活性成分，因此輔料醋中的成分也是乳香醋炙后活血止痛作用增強(qiáng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。盡管針對乳香及其主要乳香酸成分干預(yù)2型糖尿病的機(jī)制研究有限，但有報道顯示乳香酸類成分的抗炎機(jī)制與糖尿病等慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可通過系統(tǒng)調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)基因變化而發(fā)揮作用，如基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-10(matrix metalloproteinase-10，MMP-10)和基質(zhì)金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)[27]。另有研究表明，乳香還可介導(dǎo)磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，抑制血管舒張因子NO和一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的分泌[13]。本研究的實驗結(jié)果表明，乳香醋炙后降低NO及ET-1作用更加顯著，可見醋乳香能夠通過調(diào)節(jié)血管的炎癥環(huán)節(jié)改善2型糖尿病，但何種成分對2型糖尿病產(chǎn)生確切療效以及其介導(dǎo)血管炎癥的生物學(xué)機(jī)制還需進(jìn)一步研究加以論證。