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    代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸

    2022-03-09 00:41:32唐文秀王學(xué)明郭亮季立豪高聰陳修來(lái)劉立明
    化工進(jìn)展 2022年2期
    關(guān)鍵詞:胞內(nèi)滲透壓副產(chǎn)物

    唐文秀,王學(xué)明,郭亮,季立豪,高聰,陳修來(lái),劉立明

    (1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122;2 江南大學(xué)國(guó)際食品安全聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122)

    琥珀酸作為一種重要的四碳二羧酸,被廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)、制藥以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。由于其廣泛的應(yīng)用價(jià)值,2002 年被美國(guó)能源部列為12 種大宗化學(xué)品之首。由于化學(xué)合成法生產(chǎn)琥珀酸存在反應(yīng)條件苛刻、原料不可再生以及環(huán)境污染等弊端,近年來(lái)以微生物細(xì)胞工廠利用可再生資源生產(chǎn)琥珀酸受到了越來(lái)越多的關(guān)注。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌、釀酒酵母和大腸桿菌等都被經(jīng)過(guò)代謝工程改造生產(chǎn)琥珀酸。其中,由于大腸桿菌遺傳背景清晰、基因改造工具成熟以及營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),受到了廣泛關(guān)注。

    在大腸桿菌中,存在三種琥珀酸生物合成途徑:還原性三羧酸途徑(reductive tricarboxylic acid pathway,r-TCA)、三羧酸途徑(tricarboxylic acid pathway,TCA)和乙醛酸途徑。r-TCA是合成琥珀酸的主要途徑,由于受到胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的限制,琥珀酸的產(chǎn)率僅為1mol/mol葡萄糖。在乙醛酸循環(huán)中,由乙酰CoA和草酰乙酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸和蘋果酸,琥珀酸的產(chǎn)率為1.25mol/mol葡萄糖。有研究表明,在厭氧條件下,激活r-TCA途徑和乙醛酸途徑,并保持胞內(nèi)氧化還原電位平衡,琥珀酸的最大理論得率為1.12g/g 葡萄糖(1.71mol/mol葡萄糖);在有氧條件下,琥珀酸的最大理論得率為1.0mol/mol葡萄糖。

    目前,代謝工程改造大腸桿菌提高琥珀酸得率的策略主要包括以下四種。①阻斷冗余代謝支路。Jantama 等通過(guò)阻斷副產(chǎn)物路徑并結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化,獲得工程菌KJ134,可以產(chǎn)71.5g/L琥珀酸,得率為1.53mol/mol 葡萄糖。②強(qiáng)化C~C的羧化過(guò)程。在琥珀酸生物合成過(guò)程中,C中間體(磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸)通過(guò)固定一分子CO到C中間體(草酰乙酸或蘋果酸),是琥珀酸生物合成的關(guān)鍵步驟。加強(qiáng)羧化反應(yīng)主要包括過(guò)表達(dá)本源羧化酶(包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和蘋果酸酶)或過(guò)表達(dá)異源羧化酶(包括磷酸烯醇丙酮酸羧激酶或丙酮酸羧化酶)等。例如,通過(guò)在AFP111中過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶可使琥珀酸產(chǎn)量提高到99.2g/L。優(yōu)化和基因的表達(dá),Tang1683 的琥珀酸產(chǎn)量提高到92.7g/L。③提供充足的還原力和能量。增加還原力NADH的供給主要策略為:表達(dá)丙酮酸脫氫酶(FDH)和改造戊糖磷酸途徑,提高能量的供給策略主要為:過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶,將磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸的同時(shí)生成一分子ATP。④控制氧化還原的平衡。由于菌株NZN111(ΔA,ΔB)的NADH/NAD比例失衡,在厭氧條件不能有效利用葡萄糖,梁麗亞等過(guò)表達(dá)蘋果酸脫氫酶,降低胞內(nèi)NADH/NAD比例,提高了細(xì)胞在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力與琥珀酸的合成能力。

    盡管上述策略可以提高琥珀酸的得率,但是在琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中仍存在乙酸、乙醇、乳酸和丙酮酸等副產(chǎn)物積累,抑制細(xì)胞生長(zhǎng),降低琥珀酸的得率,同時(shí)增加了琥珀酸下游提取的成本。為此,本研究通過(guò)復(fù)合誘變篩選一株能夠耐受0.9mol/L NaCl 的突變菌株FMME-N-2,隨后采用基因敲除、輔因子調(diào)控、發(fā)酵優(yōu)化等策略降低了副產(chǎn)物的積累,最后在30L 發(fā)酵罐中菌株FMME-N-26 生產(chǎn)111.9g/L 琥珀酸,得率為1.11g/g葡萄糖(理論得率的99%),為琥珀酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種和質(zhì)粒

    本研究使用的大腸桿菌JM109 和FMME-N分別用于表達(dá)載體的構(gòu)建和生產(chǎn)菌株,F(xiàn)MME-N 從駱駝瘤胃中分離,經(jīng)4 輪ARTP 誘變所得,本實(shí)驗(yàn)室篩選與保藏,保藏編號(hào)CCTCC M2018568。其中本研究所使用的基因工程菌和重組質(zhì)粒如表1所示。

    表1 本研究所使用的菌種和質(zhì)粒

    1.1.2 主要儀器和試劑

    PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)儀、核酸電泳儀;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);M-100 生物傳感器;高效液相色譜儀;厭氧培養(yǎng)箱;滲透壓儀。

    限制性內(nèi)切酶、Prime Star高保真酶、Taq DNA聚合酶、TDNA連接酶、DNA marker,大連寶生物工程公司;一步同源重組酶,南京諾唯贊生物科技有限公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素、阿拉伯糖、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),生工生物工程(上海)公司;琥珀酸、乳酸、乙酸、甲酸,Sigma 公司;碘化丙啶(PI)、溴甲酚紫,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;其他試劑來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    本研究所用培養(yǎng)基及其抗生素如表2所示。

    表2 本研究所用的培養(yǎng)基及其抗生素

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 培養(yǎng)條件

    (1)平板培養(yǎng) 取保存于-80℃裝有菌液的甘油管三區(qū)劃線于LB 固體培養(yǎng)基中,在培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)16h,得到大小均勻的單菌落。

    (2)種子培養(yǎng)方法 一級(jí)種子培養(yǎng),挑取平板上大小均勻的單菌落,接種于25mL/100mL 的液體LB 培養(yǎng)基中,37℃、200r/min 培養(yǎng)9h;二級(jí)種子培養(yǎng),將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接100μL 至裝有50mL/500mL的LB培養(yǎng)基中,37℃、200r/min培養(yǎng)7h。

    (3)厭氧搖瓶發(fā)酵 按照1%(體積比)的接種量將一級(jí)種子培養(yǎng)液接種于裝有80mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中。有氧階段:37℃、200r/min培養(yǎng)12h,迅速倒入100mL無(wú)菌厭氧瓶中,同時(shí)加入10g/L KHCO和4g MgCO用于控制pH,發(fā)酵條件為38℃、200r/min。在厭氧階段發(fā)酵過(guò)程中,每隔12h添加800g/L的葡萄糖維持發(fā)酵液的葡萄糖濃度在10~20g/L,同時(shí)添加碳酸鎂維持發(fā)酵液的pH在6.2以上,發(fā)酵至72h結(jié)束。

    (4)兩階段發(fā)酵培養(yǎng)方法 采用3.6L發(fā)酵罐進(jìn)行兩階段補(bǔ)料分批發(fā)酵。發(fā)酵罐初始裝液量為2L。將二級(jí)種子液按總體積10%(體積比)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,開(kāi)始有氧發(fā)酵。有氧階段:初始轉(zhuǎn)速為400r/min,通氣量為1.5vvm(vvm 表示每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值),溫度37℃,pH 為7.0。發(fā)酵過(guò)程中流加氨水控制pH 至7.0;培養(yǎng)8h 左右,溶氧(dissolved oxygen,DO)上升,20g/L 的初始葡萄糖消耗完全,啟動(dòng)自動(dòng)補(bǔ)料模式;約8.5h,停止通氣,降低轉(zhuǎn)速至200r/min,補(bǔ)加10g/L KHCO使其短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量CO轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵,同時(shí)降低葡萄糖補(bǔ)料速率;厭氧階段發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度38℃,轉(zhuǎn)速200r/min,自動(dòng)控制優(yōu)化不同的補(bǔ)料速率,并利用2mol/L NaCO+0.5mol/L NaOH控制發(fā)酵pH=6.5,發(fā)酵至72h結(jié)束。

    1.2.2 ARTP(atmospheric and room temperature plasma)與Co-γ射線復(fù)合誘變及菌株篩選

    吸取10μL 菌懸液滴在無(wú)菌金屬載片中央,置于ARTP 育種機(jī),處理?xiàng)l件詳見(jiàn)表3。將誘變處理后的載片放入裝有990μL無(wú)菌生理鹽水的1.5mL離心管中,渦旋振蕩儀振蕩菌體2~3min,徹底洗脫菌體,轉(zhuǎn)接入裝有50mL 種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中,37℃、200r/min 培養(yǎng)9h,適當(dāng)稀釋后取100μL 涂布于固體篩選培養(yǎng)基,置于充滿CO氣體的厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24~36h。

    表3 ARTP處理?xiàng)l件

    將由ARTP誘變后篩選得到的突變株制備菌懸液分置于4 個(gè)10mL 離心管中,每管8mL,直接進(jìn)行γ 射線處理,輻照劑量分別為0、0.2kGy、0.4kGy 和0.6kGy,適當(dāng)稀釋輻照后的菌懸液,取100μL 涂布于固體篩選培養(yǎng)基,置于充滿CO氣體的厭氧培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24~36h。以值為指標(biāo)[值=變色圈直徑(mm)/菌落直徑(mm)×菌 落 培 養(yǎng) 時(shí) 間(h)], 從 含 有0.9mol/L NaCl(2191mOsmol/L)的高滲固體篩選平板上挑選具有較高值的單菌落于裝有80mL 種子培養(yǎng)基的100mL厭氧瓶中,搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證篩選出琥珀酸生產(chǎn)能力較出發(fā)菌株優(yōu)良的突變株重復(fù)進(jìn)行厭氧搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證3次,所得發(fā)酵液進(jìn)行琥珀酸產(chǎn)量的分析檢測(cè),生產(chǎn)能力最優(yōu)的菌株即為篩選得到的最佳突變株。將經(jīng)過(guò)復(fù)合誘變篩選得到的最優(yōu)突變株進(jìn)行4~20代傳代培養(yǎng),分析琥珀酸的產(chǎn)量變化。

    1.2.3 基因敲除與菌株構(gòu)建

    采用同源重組技術(shù)對(duì)FMME-N-2進(jìn)行基因敲除。采用酶切連接及同源重組方式構(gòu)建所有載體。為了構(gòu)建輔因子循環(huán)路徑,采用PCR 擴(kuò)增方式克隆PCK和PCK。本研究所用引物如表4所示。

    表4 本研究所使用的引物

    1.2.4 分析檢測(cè)方法

    (1)細(xì)胞濃度測(cè)定 取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋,使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm的條件下測(cè)定OD。大腸桿菌細(xì)胞干重(dry cell weight, DCW)=0.41×吸光值×(為樣品的稀釋倍數(shù)),最后計(jì)算細(xì)胞的生物量。

    (2)葡萄糖濃度測(cè)定 取發(fā)酵液12000r/min離心8min,收集上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使用M-100生物傳感器測(cè)定葡萄糖濃度(準(zhǔn)確測(cè)量范圍0~2g/L)。

    (3)滲透壓濃度測(cè)定 將發(fā)酵液12000r/min離心8min 收集上清液,利用SMC-30D 滲透壓儀進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量范圍0~3000mOsmol/L。

    (4)輔因子(ATP、NAD和NADH 總量)測(cè)定 取不同時(shí)間的發(fā)酵液,用PBS 溶液洗滌三次,都稀釋至OD=1.0 左右,使用ATP 檢測(cè)試劑盒S0027以及NADH檢測(cè)試劑盒(WST-8法)進(jìn)行測(cè)定(上海碧云天生物科技有限公司)。

    (5)細(xì)胞死亡率測(cè)定 取1mL發(fā)酵液用PBS溶液洗滌2次后,然后用1mL PBS溶液重懸并且稀釋至OD=0.6 左右,加入3μL/mL 的碘化丙啶溶液(PI),室溫下避光反應(yīng)15min,用流式細(xì)胞儀(BD FACS Aria Ⅲ)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)通道:PerCP-Cy5.5(488nm激發(fā)激光EL,695/40nm檢測(cè)濾波器EF)。

    (6)有機(jī)酸濃度測(cè)定 取發(fā)酵液12000r/min離心8min,收集上清液,高效液相色譜(HPLC)測(cè)定琥珀酸、乳酸、甲酸和乙酸的含量。HPLC檢測(cè)條件為,色譜分離柱為Aminex HPX-87H(300×7.8mm),流動(dòng)相為5mmol/L 稀硫酸,柱溫52℃,檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器,進(jìn)樣量10μL,流速0.6mL/min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 耐高滲突變株的篩選

    為了研究出發(fā)菌株FMME-N的琥珀酸生產(chǎn)性能,在3.6L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)琥珀酸產(chǎn)量為35.6g/L,得率為0.62g/g葡萄糖。同時(shí),發(fā)酵液的滲透壓增加到1932mOsmol/L,琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度降低至0.56g/(L·h)(圖1)。為了評(píng)價(jià)滲透壓對(duì)菌株FMME-N生長(zhǎng)能力和生產(chǎn)能力的影響,不同滲透壓條件下,測(cè)試了細(xì)胞生長(zhǎng)和琥珀酸生產(chǎn)的情況[ 圖 2(a)]。 結(jié) 果 表 明, 在 0.9mol/L NaCl(2191mOsmol/L)下,細(xì)胞生長(zhǎng)受到了顯著抑制。在不添加NaCl 的情況下,琥珀酸的最高產(chǎn)量為22.7g/L,隨著培養(yǎng)基中滲透壓的增加,琥珀酸產(chǎn)量逐漸降低,當(dāng)添加滲透壓為2192mOsmol/L時(shí),琥珀酸產(chǎn)量降至3.1g/L。因此,高滲透壓會(huì)抑制FMMEN的生長(zhǎng)和琥珀酸的合成,提高菌株FMME-N對(duì)滲透壓的耐受性可能會(huì)提高琥珀酸的產(chǎn)量。

    圖1 E.coli FMME-N在3.6L發(fā)酵罐中的發(fā)酵曲線變化

    為了提高菌株FMME-N 對(duì)滲透壓的耐受性,選用ARTP 和Co-γ復(fù)合誘變策略進(jìn)行誘變處理并在含有0.9mol/L NaCl 的平板上篩選(滲透壓為2219mOsmol/L)。首先,經(jīng)過(guò)ARTP誘變,從400多個(gè)菌落中篩選出40 株值較高的菌株。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證,突變菌株FMME-N-1 的琥珀酸產(chǎn)量提高至27.3g/L。隨后,利用Co-γ 射線對(duì)FMME-N-1 處理,從300 多個(gè)菌落中選擇值較高的27 個(gè)菌落。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證,突變菌株FMME-N-2 可產(chǎn)生32.4g/L琥珀酸,較出發(fā)菌株FMME-N 提高了48.6%[圖2(b)]。最終,以琥珀酸產(chǎn)量為指標(biāo),對(duì)菌株FMME-N-2進(jìn)行4-20代遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)。搖瓶結(jié)果顯示:菌株FMME-N-2的琥珀酸產(chǎn)量不僅優(yōu)于出發(fā)菌株FMME-N,并且琥珀酸產(chǎn)量變化幅度小(表5),說(shuō)明菌株FMME-N-2具有良好的遺傳穩(wěn)定性,因此,被選作下一步基因操作的菌株。

    表5 FMME-N-2突變株的遺傳穩(wěn)定性

    為了驗(yàn)證突變菌株FMME-N-2 的耐高滲透壓能力是否提高,從生長(zhǎng)、菌體死亡率、細(xì)胞形態(tài)以及發(fā)酵性能4 個(gè)方面進(jìn)行了比較分析。①在不含NaCl時(shí),F(xiàn)MME-N-2的最終細(xì)胞濃度(OD=13.5)較 出 發(fā) 菌 株FMME-N (OD=12.2) 提 高10.7%[圖2(c)];在0.9mol/L NaCl 下,F(xiàn)MME-N 菌株的生物量(OD)下降至1.5,然而菌株FMME-N-2 的生長(zhǎng)情況基本保持不變[圖2(c)、(d)]。②菌株FMME-N在發(fā)酵結(jié)束時(shí)(滲透壓為2232mOsmol/L),約有79.3%的細(xì)胞死亡,然而FMME-N-2的死亡率為45.3%[圖2(e)]。③發(fā)酵結(jié)束時(shí),菌株FMME-N-2的細(xì)胞表面比FMME-N 更完整[圖2(f)]。④菌株FMME-N-2 的生物量、琥珀酸產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為40.5、51.8g/L、0.70g/g 葡萄糖和0.81g/(L·h),與 菌 株FMME-N 相 比 分 別 提 高 了14.7%、45.5%、12.9%和51.7%[圖2(g)]。上述結(jié)果表明,增強(qiáng)菌株FMME-N-2 的滲透壓耐受性,提高了琥珀酸的產(chǎn)量。

    圖2 耐高滲琥珀酸生產(chǎn)菌株的篩選與表征

    2.2 阻斷冗余代謝支路提高琥珀酸得率

    在厭氧條件下,葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)是琥珀酸合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),PEP不僅能通過(guò)r-TCA路徑轉(zhuǎn)化為琥珀酸,同時(shí)也可以轉(zhuǎn)化為乳酸、甲酸、乙酸和乙醇等副產(chǎn)物[圖3(a)]。在研究中發(fā)現(xiàn),菌株FMME-N-2 經(jīng)72h發(fā)酵積累18.8g/L 乳酸、7.6g/L 甲酸和17.3g/L 乙酸[圖3(g)],導(dǎo)致琥珀酸得率為0.70g/g 葡萄糖(占琥珀酸理論得率的64.3%)。為了提高琥珀酸得率,單獨(dú)或組合敲除A、BA、、A基因,獲得10 株基因工程菌株[圖3(b)]。其中,菌株FMME-N-10(FMME-N-2ΔBAΔAΔ)的生物量降低了14.1%[圖3(c)],但琥珀酸產(chǎn)量提高至52.6g/L,得率提高到0.87g/g 葡萄糖。與此同時(shí),乳酸和甲酸的積累量分別降低至1.5g/L和3.4g/L[圖3(d)、(e)]。但是,副產(chǎn)物乙酸的濃度增加至18.2g/L[圖3(e)]。

    為了進(jìn)一步減少副產(chǎn)物乙酸的積累,敲除乙酸合成路徑的相關(guān)基因D(編碼丙酸激酶)和E(a-酮丁酸甲酸酯裂解酶),構(gòu)建了菌株FMME-N-13(FMME-N-10ΔDE)。在搖瓶條件下,琥珀酸產(chǎn)量為61.1g/L,乙酸降低了22.1%;在3.6L發(fā)酵罐中,發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物大大降低,僅有0.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸和12.3g/L乙酸積累[圖3(f)],而琥珀酸的產(chǎn)量、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了72.9% (89.6g/L),31.4%(0.92g/g 葡萄糖)和72.8%[1.40g/(L·h)]。上述結(jié)果表明,阻斷副產(chǎn)物的積累對(duì)提高琥珀酸的產(chǎn)量和得率至關(guān)重要。

    圖3 基因敲除菌株的構(gòu)建與評(píng)估

    2.3 輔因子工程提高琥珀酸的得率

    盡管通過(guò)阻斷冗余代謝支路提高了琥珀酸得率,但琥珀酸的實(shí)際得率(0.92g/g葡萄糖)與琥珀酸理論得率(1.12g/g葡萄糖)相比,仍有很大的提升空間。分析發(fā)現(xiàn),可能是由于:①胞內(nèi)NADH的缺乏,導(dǎo)致琥珀酸得率低;②胞內(nèi)能量供應(yīng)不足,乙酸合成途徑與ATP 合成途徑偶聯(lián),導(dǎo)致乙酸積累。為此,測(cè)定了菌株FMME-N-13在發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)ATP、NADH和NADH/NAD的變化情況。結(jié)果表明,胞內(nèi)的ATP、NADH和NADH/NAD含量分別降 低 至1.22μmol/gDCW、20.2μmol/gDCW 和0.23[圖4(a)]。

    為了增強(qiáng)ATP和NADH的供給,構(gòu)建了輔因子再生系統(tǒng),以提高胞內(nèi)ATP 和NADH 的濃度。在FMME-N-13菌株中單獨(dú)或組合過(guò)表達(dá)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的ADP 依賴型PEP 羧激酶(PCK)和博伊丁假絲酵母的NAD依賴型的甲酸脫氫酶(FDH)[圖4(b)]。在搖瓶條件下:①過(guò)表達(dá)PCK,使菌株FMME-N-14 的琥珀酸產(chǎn)量和得率分別提高到67.9g/L 和1.01g/g 葡萄糖,同時(shí)胞內(nèi)ATP的濃度提高至1.53μmol/gDCW,乙酸濃度降低至9.6g/L;②過(guò)表達(dá)FDH,使菌株FMME-N-15的琥珀酸產(chǎn)量和得率也有所提高,同時(shí)胞內(nèi)NADH的濃度提高了27.0%,且?guī)缀鯖](méi)有甲酸積累;③同時(shí)過(guò)表達(dá)PCK和FDH,使胞內(nèi)的ATP和NADH濃度均有所提高,但是琥珀酸的產(chǎn)量和得率都沒(méi)有明顯提高,可能是菌株FMME-N-16 中NADH/NAD過(guò)高(0.47),導(dǎo)致氧化還原失衡限制了菌株代謝和琥珀酸生產(chǎn)[圖4(d)、(e)、(f)]。

    為了進(jìn)一步提高琥珀酸的產(chǎn)量和得率,以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因,將RBS10、RBS09和RBS03分為高、中和低三個(gè)水平。借助不同的RBS 將PCK 和FDH 表達(dá)水平控制在高(H)、中(M)和低(L)三個(gè)水平,構(gòu)建了9 株基因工程菌[圖4(c)]。經(jīng)發(fā)酵測(cè)試,當(dāng)PCK 和FDH 都低水平表達(dá) 時(shí),菌 株FMME-N-24 (L-PCK-L-FDH)能獲得最高的琥珀酸產(chǎn)量(74.2g/L),得率為1.04g/g葡萄糖,較出發(fā)菌株FMME-N-13分別提高了21.4%和13.0%[圖4(d)]。同時(shí),胞內(nèi)的ATP、NADH 和NADH/NAD分別提高了26.4%、49.2%和47.8%[圖4(f)]。此外,乙酸濃度降低至8.4g/L,且?guī)缀鯖](méi)有乳酸和甲酸積累[圖4(e)]。為了提高重組菌株在工業(yè)發(fā)酵中的穩(wěn)定性,通過(guò)同源重組將片段L-PCK-L-FDH 整 合 至 菌 株FMME-N-13 基 因組的PCK 基因處,構(gòu)建菌株FMME-N-26。最終,菌株FMME-N-26的琥珀酸產(chǎn)量為73.9g/L,得率為1.04g/g 葡萄糖。上述結(jié)果表明,優(yōu)化PCK和FDH 的表達(dá)能提高胞內(nèi)輔因子的供應(yīng)量,進(jìn)而提高琥珀酸產(chǎn)量。

    圖4 調(diào)控AsPCK與CbFDH的表達(dá)優(yōu)化輔因子含量

    2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化提高琥珀酸的產(chǎn)量

    為了驗(yàn)證最優(yōu)菌株FMME-N-26 的生產(chǎn)潛力,在3.6L發(fā)酵罐中發(fā)酵72h,琥珀酸產(chǎn)量為101.4g/L,得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為1.05g/g葡萄糖和1.58g/(L·h)。與菌株FMME-N-13 相比分別提高了13.2%、14.1%和12.9%。但是,仍然有5.5g/L 乙酸積累[圖5(a)、(e)]。

    為了進(jìn)一步降低乙酸的濃度,利用限制性補(bǔ)糖策略對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖濃度進(jìn)行了控制與優(yōu)化。結(jié)果表明:①副產(chǎn)物乙酸濃度隨著葡萄糖濃度的增加而增加,當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度從10~15g/L 增加到20g/L時(shí),乙酸濃度從5.5g/L增加到9.7g/L,琥珀酸得率降低至0.98g/g 葡萄糖[圖5(b)、(d)、(e)];②通過(guò)恒pH策略控制發(fā)酵液的葡萄糖濃度處于0,雖然乙酸濃度降低至2.4g/L,但是琥珀酸產(chǎn)量也降低至92.1g/L[圖5(b)、(d)、(e)],說(shuō)明較低的葡萄糖濃度不能滿足細(xì)胞的代謝需求;③通過(guò)自動(dòng)補(bǔ)料將厭氧階段發(fā)酵液葡萄糖濃度維持在0~5g/L,使琥珀酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到112.5g/L、1.11g/g葡萄糖和1.76g/(L·h),相較于控制發(fā)酵液葡萄糖濃度10~15g/L 分別提高了10.9%、5.7%和11.4%。同時(shí),副產(chǎn)物乙酸濃度降低至2.8g/L[圖5(b)、(d)、(e)]。最后,在最優(yōu)發(fā)酵條件下,放大至30L發(fā)酵罐進(jìn)行琥珀酸生產(chǎn),最終琥珀酸的濃度、得率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別為111.9g/L、1.11g/g葡萄糖和1.75g/(L·h),副產(chǎn)物乙酸降低至1.6g/L,同時(shí)幾乎沒(méi)有甲酸或乳酸積累[圖5(c)、(e)]。上述結(jié)果表明,通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化,有助于降低乙酸的積累,進(jìn)而提高琥珀酸的產(chǎn)量和得率,同時(shí)減少琥珀酸下游分離提取成本,具有良好的工業(yè)化潛力。

    圖5 菌株FMME-N-26的兩階段發(fā)酵結(jié)果

    3 結(jié)論

    (1)篩選具有耐高滲的工程菌株有助于增強(qiáng)微生物細(xì)胞工廠的魯棒性,提高琥珀酸的產(chǎn)量。在有機(jī)酸發(fā)酵過(guò)程中,需要添加堿性物質(zhì)維持發(fā)酵液的pH 在最適范圍內(nèi)。但是,添加的堿性物質(zhì)以及積累的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的滲透壓不斷升高,導(dǎo)致大腸桿菌活力下降甚至死亡,影響琥珀酸生產(chǎn)效率。為了獲得能耐受高滲透壓的菌株,發(fā)展了多種代謝工程策略:①反向代謝工程結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化;②添加滲透壓保護(hù)劑,如甜菜堿、海藻糖和含硫氨基酸;③對(duì)全局轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行突變;④誘變策略等。例如,在初始高葡萄糖濃度(120g/L)所引起的高滲透條件下,外源添加滲透壓保護(hù)劑半胱氨酸可使細(xì)胞生長(zhǎng)速度提高56%,琥珀酸產(chǎn)量提高了102%。本文采用ARTP和Co-γ 射線復(fù)合誘變策略篩選得到一株耐0.9mol/L NaCl 菌株,琥珀酸產(chǎn)量提高了45.5%達(dá)到51.8g/L,該策略改變了菌體的基因特性不需要外源添加抗生素等物質(zhì)降低了生產(chǎn)成本。

    (2)副產(chǎn)物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸合成路徑的碳流,降低琥珀酸得率。阻斷副產(chǎn)物積累的方法主要是敲除副產(chǎn)物路徑的基因,這一方法已成功用于大腸桿菌()、釀 酒 酵 母()、谷 氨 酸棒桿菌()和產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌()等。然而,基因敲除可能會(huì)降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速率或改變胞內(nèi)的NADH/NAD值。例如,敲除A 和B 基因后,胞內(nèi)NADH/NAD比率升高,造成氧化還原失衡,菌株NZN111(A、B)失去了厭氧條件下代謝葡萄糖的能力。為此,常常要結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化提高菌株生長(zhǎng)速度,例如,KJ060 結(jié)合代謝進(jìn)化,使菌體濃度升高(OD值從0 提高到5),琥珀酸產(chǎn)量提高至86.5g/L。在本研究中,通過(guò)調(diào)控PCK 和FDH 的表達(dá)水平使NADH/NAD比率維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),與其他單獨(dú)調(diào)節(jié)氧化還原電位或能量平衡的策略相比,具有兩點(diǎn)優(yōu)勢(shì):①能同時(shí)提高胞內(nèi)ATP和NADH的含量;②通過(guò)優(yōu)化PCK 和FDH 的表達(dá),有助于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)(ATP 供應(yīng)的增加)和琥珀酸的合成(NADH 供應(yīng)的增加)。

    (3)通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件,進(jìn)一步提高了琥珀酸的生產(chǎn)性能。經(jīng)30L 發(fā)酵罐的生產(chǎn),最優(yōu)菌株FMME-N-26 能產(chǎn)生111.9g/L 琥珀酸,得率為1.11g/g 葡萄糖。本研究為琥珀酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ),對(duì)開(kāi)發(fā)用于生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品的高性能大腸桿菌系細(xì)胞工廠具有重要的借鑒意義。

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