釀酒酵母產(chǎn)脂肪酸乙酯代謝途徑改造

姜 慧，張利華，夏媛媛，陳獻(xiàn)忠

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

釀酒酵母是一種適合微生物大規(guī)模長(zhǎng)期培養(yǎng)的候選菌，被認(rèn)為是最具潛力的大規(guī)模生產(chǎn)菌種。釀酒酵母具有生長(zhǎng)周期短、發(fā)酵能力強(qiáng)，容易進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，一直是基礎(chǔ)及應(yīng)用研究的主要對(duì)象，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。釀酒酵母也被用于其他具有重要工業(yè)價(jià)值代謝產(chǎn)物的發(fā)酵，例如乙醇、脂肪酰輔酶A等。通過(guò)分子改造阻斷底物葡萄糖的分流從而累積FAEE形成的前體物質(zhì)乙醇和脂肪酰輔酶A[1-2]，再充分利用WS2的酯化作用[3-4]，有效生成生物柴油的前體物質(zhì)FAEE，這不僅促進(jìn)了工業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對(duì)環(huán)境的改善作用也不容小覷。

現(xiàn)階段對(duì)于通過(guò)細(xì)胞工廠(chǎng)生產(chǎn)FAEE的研究并不是很多，更多的研究集中在利用化學(xué)合成生產(chǎn)FAEE作為柴油的前體物質(zhì)，不過(guò)化學(xué)合成高效率的背后卻對(duì)環(huán)境和原料損耗方面有著極大的負(fù)擔(dān)，因此從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度考慮，利用細(xì)胞工廠(chǎng)生產(chǎn)FAEE更順應(yīng)時(shí)代潮流。目前已嘗試在大腸桿菌E.coli、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae[5-6]、產(chǎn)油酵母Yarrowia lipolytica等微生物體內(nèi)通過(guò)代謝途徑改造生產(chǎn)FAEE，其中在產(chǎn)油酵母Yarrowia lipolytica中通過(guò)代謝改造等手段使FAEE產(chǎn)量達(dá)到1.18 g/L，是目前報(bào)道中最高的[7]。在釀酒酵母中單純通過(guò)基因敲除阻斷分支途徑以及異源表達(dá)WS2等手段獲得的FAEE最高產(chǎn)量為34 mg/L[8]，本研究FAEE的代謝改造見(jiàn)圖1，F(xiàn)AEE搖瓶產(chǎn)量達(dá)到144.4 mg/L，發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到1.35 g/L，此結(jié)果在利用釀酒酵母生產(chǎn)FAEE中均處于較高水平。

圖1 代謝改造釀酒酵母產(chǎn)FAEE的策略Fig.1 Metabolic modification of S.cerevisiae for FAEE production

根據(jù)生成FAEE過(guò)程中前體物質(zhì)富集以及前體物質(zhì)酯化將代謝途徑改造分為Module I和Module II兩個(gè)模塊，Module I分子改造主要為基因敲除，Module II分子改造主要為基因整合。Module I通過(guò)對(duì)編碼甾醇酰基轉(zhuǎn)移酶的基因ARE1、ARE2敲除來(lái)阻斷甾醇酯途徑；對(duì)編碼甘油?；D(zhuǎn)移酶的基因LRO1、DGA1敲除來(lái)阻斷三酰基甘油途徑以及對(duì)編碼長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因PXA2的敲除來(lái)阻斷β氧化途徑；Module I中3條途徑阻斷最終富集FAEE前體物質(zhì)——脂肪酰輔酶A。Module II是在Module I基礎(chǔ)上再異源表達(dá)，釀酒酵母密碼子優(yōu)化的蠟酯合成酶基因WS2將乙醇和Module I中富集的脂肪酰輔酶A在WS2酯化作用下轉(zhuǎn)化成我們所需的目的產(chǎn)物FAEE[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株，質(zhì)粒和引物實(shí)驗(yàn)所用菌株見(jiàn)表1，BY4741是釀酒酵母組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶缺陷型菌株；質(zhì)粒pMRI-21：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏，見(jiàn)表2；pMD19-T Simple載體：購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物：由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，見(jiàn)表3。

表1 本研究涉及菌株Table 1 Strains involved in this study

表2 本研究所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

表3 本研究所用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.2 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

YPD培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

MM培養(yǎng)基（組分g/L）：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10。

SM培養(yǎng)基（組分g/L）：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10，尿嘧啶0.06。

篩選培養(yǎng)基（組分g/L）：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10，尿嘧啶0.06，5-FOA 1。

發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖20，YNB 6.7，酵母粉6，蛋白胨3，K2HPO47.2，KH2PO49.3，醋酸3，尿嘧啶0.06。

BYD5W2發(fā)酵罐培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖60，YNB 6.7，酵母粉18，蛋白胨3，K2HPO47.2，KH2PO49.3，醋酸3，尿嘧啶0.06。

BYD5W2*發(fā)酵罐培養(yǎng)基（組分g/L）：葡萄糖60，YNB 6.7，酵母粉18，蛋 白胨3，K2HPO47.2，KH2PO49.3，醋酸3。

1.1.3 主要試劑與儀器正己烷（色譜級(jí)）、乙酸乙酯（色譜級(jí)）：阿拉丁試劑公司產(chǎn)品；酵母氮基（YNB）、5-氟乳清酸（5-FOA）：上海生物工程股份有限公司產(chǎn)品；月桂酸乙酯（Ethyl dodecanoate）、肉豆蔻酸乙酯（Ethyl myristate）、棕櫚酸乙酯（Ethyl palmitate）、硬脂酸乙酯（Ethyl Stearate）、二十酸乙酯（Ethyl arachidate）、順-9-十八稀酸乙酯（cis-9-Octadecenoic acid ethyl ester/Ethyl oleate）：Sigma公司產(chǎn)品；十七烷酸乙酯（Ethyl heptadecanoate）、順-9-十六稀酸乙酯（Ethyl cis-9-Hexadecenoate）：TCI公司產(chǎn)品；一步克隆試劑盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）：南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；酵母RNA提取試劑盒：Takara生物試劑公司（SYBR Premix Ex Taq ll（Tli RNaseH Plus））產(chǎn)品。

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司制造；PCR擴(kuò)增儀：上海東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司制造；控溫?fù)u床：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)制造；UV-2100可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼科有限公司制造；干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司制造；高速臺(tái)式離心機(jī)、ISQ單四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技有限公司制造；自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋電機(jī)公司制造；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)制造；電泳凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD公司制造；實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀：美國(guó)伯樂(lè)公司制造；全自動(dòng)制冰機(jī)：GRANT公司制造；生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所制造；pH計(jì)：梅特勒-托利多公司制造。

1.2 方法

1.2.1 敲除盒構(gòu)建過(guò)程對(duì)釀酒酵母BY4741基因組進(jìn)行分析，獲得5個(gè)基因，分別為ARE1、ARE2、DGA1、LRO1、PXA2基因，根據(jù)基因序列構(gòu)建敲除盒。以基因ARE1敲除盒構(gòu)建為例，設(shè)計(jì)引物ARE1-F和ARE1-R，以釀酒酵母BY4741基因組為模板，PCR擴(kuò)增ARE1基因，經(jīng)PCR試劑盒純化后，與pMD19-T Simple載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-ARE1；以質(zhì)粒Ts-ARE1為模板，設(shè)計(jì)引物ReARE1-F和ReARE1-R（分別添加X(jué)baⅠ酶切位點(diǎn)），反向PCR得到片段ARE1U-Ts-ARE1D，凝膠回收該片段，將該片段與質(zhì)粒Ts-HO-gda-URA3同時(shí)經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ消化，凝膠回收后將片段ARE1U-Ts-ARE1D與片段gda393-URA3連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-ARE1-gda393-URA3。以上述重組質(zhì)粒為模板，用引物ARE1-F和ARE1-R，PCR得到敲除盒ARE1U-gda393-URA3-ARE1D，見(jiàn)圖2。利用相似策略，構(gòu)建其他基因敲除盒。

圖2 重組質(zhì)粒TS-ARE1-gda-URA3構(gòu)建過(guò)程Fig.2 Construction process of recombinant plasmid TS-ARE1-gda-URA3

1.2.2 ARE1等基因敲除過(guò)程以尿嘧啶缺陷型菌株BY4741為出發(fā)菌株，以URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[10]將敲除盒依次轉(zhuǎn)入釀酒酵母BY4741中[14]。敲除盒轉(zhuǎn)入宿主后涂布到MM固體培養(yǎng)基挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR驗(yàn)證鑒定出正確轉(zhuǎn)化子；將上述步驟正確的轉(zhuǎn)化子涂布到5-FOA培養(yǎng)基上，再次挑選轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR初步驗(yàn)證彈出URA3基因后，將PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序，序列比對(duì)無(wú)誤后保藏正確菌株；此方法可以重復(fù)利用篩選標(biāo)記[15-16]。

1.2.3 WS2整合框構(gòu)建過(guò)程對(duì)釀酒酵母BY4741基因組進(jìn)行分析，選取整合位點(diǎn)HO[11]，根據(jù)基因序列構(gòu)建整合框。首先設(shè)計(jì)引物HO-F和HO-R，以釀酒酵母BY4741基因組為模板，PCR擴(kuò)增HO基因，經(jīng)PCR試劑盒純化后，與pMD19-T Simple載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-HO；以質(zhì)粒Ts-HO為模板，設(shè)計(jì)引物ReHO-F和ReHO-R（分別添加X(jué)baⅠ酶切位點(diǎn)），反向PCR得到片段HOU-Ts-HOD，凝膠回收后將片段HOU-Ts-HOD與片段gda393-URA3（兩端具有XbaⅠ酶切位點(diǎn)）連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-HO-gda393-URA3。以PMRI-21質(zhì)粒為載體骨架，將GAL10啟動(dòng)子替換成釀酒酵母強(qiáng)啟動(dòng)子TDH3[12-13]，蠟酯合成酶基因WS2是根據(jù)釀酒酵母密碼子優(yōu)化后的基因，兩端帶有酶切位點(diǎn)Bam H和Xho I，通過(guò)酶切連接可以將蠟酯合成酶基因WS2插入質(zhì)粒PMRI-21的啟動(dòng)子TDH3和終止子CYC1之間，形成WS2的表達(dá)框，質(zhì)粒命名為pMRI-21-TDH3-WS2-CYC1。用Sma I酶切Ts-HO-gda393-URA3將其線(xiàn)性化，最后通過(guò)一步連接將WS2表達(dá)框TDH3-WS2-CYC1連接到Ts-HO-gda393-URA3上形成重組質(zhì)粒Ts-HO-gda393-URA3-TDH3-WS2-CYC1。以上述重組質(zhì)粒為模板，用引物HO-F和HO-R，PCR得到WS2整合框HO-gda393-URA3-TDH3-WS2-CYC1，具體整合框構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖3。

圖3 WS2整合框的構(gòu)建Fig.3 Construction of WS2 integration box

1.2.4 WS2基因整合過(guò)程以BYD5為出發(fā)菌株，仍以URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將整合框轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株中[14]。整合框轉(zhuǎn)入宿主后涂布到MM固體培養(yǎng)基挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR驗(yàn)證鑒定出正確轉(zhuǎn)化子；將上述步驟正確的轉(zhuǎn)化子涂布到5-FOA培養(yǎng)基上，再次挑選轉(zhuǎn)化子，提取基因組，PCR初步驗(yàn)證彈出URA3基因后，將PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序，序列比對(duì)無(wú)誤后保藏正確菌株；此方法可以重復(fù)利用篩選標(biāo)記[14-15]。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化從-70℃超低溫冰箱中取出甘油管保藏的重組釀酒酵母菌株，挑取菌株于YPD固體平板上劃線(xiàn)活化，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h獲得單菌落。從平板上挑取單菌落接種至10 mL的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，以體積分?jǐn)?shù)2%接種體積分?jǐn)?shù)接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min搖床中發(fā)酵培養(yǎng)60 h[16]。在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)是否添加乙醇和菜籽油、發(fā)酵時(shí)間以及乙醇添加模式這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6 發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)從平板上分別挑取尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2的單菌落和尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的單菌落，接種至10 mL的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，以2%接種體積分?jǐn)?shù)接種于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD為2時(shí)以10%接種體積分?jǐn)?shù)接種于3 L的發(fā)酵罐。發(fā)酵過(guò)程中待初始葡萄糖低于5 g/L時(shí)開(kāi)始流加80 g/dL葡萄糖以維持發(fā)酵罐的糖質(zhì)量濃度為10 g/L，乙醇從36 h開(kāi)始保持流加量為8 mL/h，首次添加乙醇時(shí)一次性添加體積分?jǐn)?shù)2%菜籽油并通過(guò)手動(dòng)補(bǔ)加5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵罐pH保持在5.5左右。在發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中，從12 h開(kāi)始每4 h取樣檢測(cè)OD和葡萄糖質(zhì)量濃度，從48 h開(kāi)始每12 h取樣檢測(cè)FAEE產(chǎn)量。

1.2.7 產(chǎn)物FAEE的提取取發(fā)酵液10 mL，加入終質(zhì)量濃度5 mg/mL的蝸牛酶振蕩混勻，置37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)12 h進(jìn)行初步破壁處理，然后再利用超聲波破碎儀在35 W冰上低溫破碎100 min破壁，使細(xì)胞徹底釋放出產(chǎn)物。在超聲破碎細(xì)胞后立即向細(xì)胞液中加入20 mL正己烷，上下顛倒使其充分混勻，在振蕩儀上振蕩15 s后于7 000 r/min離心10 min，分離并收集有機(jī)層。重復(fù)添加正己烷進(jìn)行二次萃取，在真空離心濃縮儀中利用正己烷的易揮發(fā)性對(duì)萃取的FAEE進(jìn)行濃縮[16]。

1.2.8 GC-MS分析將萃取濃縮后的樣品按比例復(fù)溶于正己烷中，過(guò)膜后取1 mL進(jìn)行氣質(zhì)檢測(cè)。氣質(zhì)分析條件為：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），進(jìn)樣器溫度和柱溫均為300℃。升溫程序：起始80℃，維持1 min；然后以2℃/min升溫至100℃；15℃/min升溫至280℃，保持2 min；最后以30℃/min升溫至300℃，保持3 min。質(zhì)譜：EI離子源，四級(jí)桿檢測(cè)器；電離能70 eV，離子源表面溫度為280℃[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Module I基因突變株的構(gòu)建

構(gòu)建了ARE1、ARE2、DGA1、LRO1和PXA2基因敲除盒質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶Xba I單酶切驗(yàn)證，條帶大小均與理論一致，測(cè)序結(jié)果表明ARE1、ARE2、DGA1、LRO1和PXA2基因敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功。

用上述重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的敲除盒，通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法依次轉(zhuǎn)入宿主中，挑取轉(zhuǎn)化子，并提取基因組；使用對(duì)應(yīng)同源臂外側(cè)上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后，將轉(zhuǎn)化子彈出URA3后再依次用上述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大小均與理論一致，最終測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建成功，將成功構(gòu)建的菌株分別命名為BYD1、BYD2、BYD3、BYD4、BYD5。

2.2 Module II蠟酯合成酶WS2基因的表達(dá)

HO位點(diǎn)的敲除不影響宿主細(xì)胞及其他生理功能，因此在釀酒酵母染色體整合表達(dá)操作中，HO位點(diǎn)成為首要選擇。根據(jù)PARTOW等人的研究篩選出TDH3、TEF1、PGK1、TPI等啟動(dòng)子均為釀酒酵母中的強(qiáng)啟動(dòng)子[12-13]，因此選擇其中較優(yōu)的TDH3啟動(dòng)子以及對(duì)應(yīng)終止子CYC1過(guò)表達(dá)目的基因WS2，以提高表達(dá)效率。

構(gòu)建了WS2基因整合框質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I單酶切驗(yàn)證，條帶大小與理論一致，測(cè)序結(jié)果表明WS2基因整合框質(zhì)粒構(gòu)建成功。

用上述重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的整合框，將其通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入宿主BY4741和BYD5中，挑取轉(zhuǎn)化子，并提取基因組；使用對(duì)應(yīng)同源臂外側(cè)上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證，理論上應(yīng)擴(kuò)增出2 100 bp的條帶，將WS2整合表達(dá)在BYD5中且未彈出URA3的菌株命名為BYD5W2*；將轉(zhuǎn)化子彈出URA3后再依次用上述引物擴(kuò)增，理論上應(yīng)擴(kuò)增出2 100 bp的條帶，PCR結(jié)果與預(yù)期大小一致，C1為上述未彈出URA3的對(duì)照菌株，見(jiàn)圖4。將PCR產(chǎn)物純化并送公司測(cè)序，結(jié)果顯示構(gòu)建成功，將成功構(gòu)建的菌株分別命名為BYW2和BYD5W2。

圖4 WS2轉(zhuǎn)化BY4741，BYD5彈URA3驗(yàn)證Fig.4 WS2 transform BY4741 and BYD5 projectile URA3 for verification

蠟酯合成酶基因WS2表達(dá)后進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，如圖5所示，以ACT1為內(nèi)參基因，WS2基因表達(dá)量為內(nèi)參基因ACT1的1.42倍，證明WS2已成功表達(dá)。

圖5 WS2基因熒光定量PCRFig.5 Fluorescence quantitative PCR of WS2 gene

2.3 FAEE搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

FAEE搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，首先對(duì)菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行探索，見(jiàn)圖6（a）。原始出發(fā)菌株BY4741的菌體濃度OD600最大為20.3，BYW2在出發(fā)菌株BY4741的基礎(chǔ)上有些許提升，菌體濃度OD600達(dá)到21.7，而目的菌株BYD5W2相較于BY4741與BYW2生長(zhǎng)明顯受限，菌體濃度OD600只能達(dá)到5.1。由此可見(jiàn)，甾醇酯途徑、三?；视屯緩揭约唉卵趸緩降那贸龝?huì)阻礙菌株的生長(zhǎng)。

從菌株BY4741，BYW2和BYD5W2出發(fā)，對(duì)FAEE產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)圖6（b）。在只補(bǔ)加葡萄糖的發(fā)酵條件下，菌株BYD5W2的FAEE產(chǎn)量最高，為11.72 mg/L；FAEE不同碳鏈混標(biāo)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6（c），樣品BYD5W2中FAEE檢測(cè)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6（d）。

圖6 重組菌BY4741、BYW2、BYD5W2搖瓶水平的細(xì)胞生長(zhǎng)和FAEE生產(chǎn)Fig.6 Cell growth and FAEE shake-flask production by precom-binant strains of BY4741，BYW2 and BYD5W2

乙醇作為FAEE生產(chǎn)的兩大前體物質(zhì)之一，由于其價(jià)格低廉且易獲取，通過(guò)直接外源添加的方式滿(mǎn)足FAEE生產(chǎn)需求；釀酒酵母可以利用油性碳源，使其成為將廢油等油性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有用且廉價(jià)的酯化原料的合適宿主。另外，培養(yǎng)基中存在菜籽油等疏水底物，可以觸發(fā)細(xì)胞外脂肪酶的分泌，將植物油水解成甘油和脂肪酸，為FAEE生產(chǎn)提供充足碳源，從而提升FAEE產(chǎn)量。

因此后期對(duì)菌株BYD5W2進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，從添加乙醇和菜籽油、發(fā)酵時(shí)間以及乙醇添加模式3個(gè)因素考察。如圖7（a）所示，只補(bǔ)加葡萄糖發(fā)酵時(shí)，BYD5W2的FAEE產(chǎn)量為11.72 mg/L，在此基礎(chǔ)上補(bǔ)加乙醇，F(xiàn)AEE產(chǎn)量提升到36.1 mg/L，相對(duì)于只補(bǔ)加葡萄糖，F(xiàn)AEE產(chǎn)量提升了3.1倍；在此基礎(chǔ)上繼續(xù)補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)2%菜籽油，F(xiàn)AEE產(chǎn)量提升到59.3 mg/L，相對(duì)于僅補(bǔ)加葡萄糖時(shí)FAEE產(chǎn)量提升了5.1倍。結(jié)果表明，F(xiàn)AEE發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加乙醇和菜籽油會(huì)顯著提升FAEE產(chǎn)量。

在搖瓶中添加乙醇和菜籽油，對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別發(fā)酵48、60、72、84、96 h終止發(fā)酵，測(cè)定FAEE產(chǎn)量。如圖7（b）所示，發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)FAEE產(chǎn)量最高，為59.3 mg/L。

確定發(fā)酵時(shí)間為60 h后，對(duì)乙醇的添加模式進(jìn)行探索，由于一次性加入過(guò)量乙醇會(huì)影響菌體生長(zhǎng)[5]，所以采用分批等量的方式以相同間隔時(shí)間進(jìn)行乙醇的添加。如圖7（c）所示，首次補(bǔ)加乙醇時(shí)間 取12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h，發(fā)現(xiàn)在20 h開(kāi)始補(bǔ)加乙醇，每次補(bǔ)加量為體積分?jǐn)?shù)2%，間隔時(shí)間為6 h時(shí)，F(xiàn)AEE產(chǎn)量最高，為144.4 mg/L。

圖7 BYD5W2搖瓶發(fā)酵優(yōu)化Fig.7 BYD5W2 shake flask fermentation optimization

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵檢測(cè)FAEE

在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，BYD5W2生長(zhǎng)受到影響，菌體濃度OD600只能達(dá)到5.1，這也是限制FAEE產(chǎn)量的重要因素之一，因此采用發(fā)酵罐發(fā)酵，并對(duì)比了尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2與尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE產(chǎn)量的差別，如圖8（a）所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株最大菌體濃度OD600達(dá)到24.8，尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株最大菌體濃度OD600可以達(dá)到35.2；如圖8（b）所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株的FAEE最高產(chǎn)量為0.618 g/L，而尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株的FAEE最高產(chǎn)量達(dá)到了1.35 g/L。

圖8 5 L發(fā)酵罐水平優(yōu)化FAEE生產(chǎn)Fig.8 Optimization of FAEE production in 5 L bioreator

3 結(jié) 語(yǔ)

作者對(duì)釀酒酵母代謝途徑進(jìn)行改造，阻斷甾醇酯途徑、三?；视屯緩胶挺卵趸緩揭詼p少脂肪酰輔酶A的分流，成功構(gòu)建了不同突變株菌株；利用同源重組在HO位點(diǎn)整合表達(dá)了根據(jù)釀酒酵母密碼子優(yōu)化的外源蠟酯合成酶基因WS2，在WS2的酯化作用下乙醇和脂肪酰輔酶A形成FAEE.為了提升FAEE產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵階段對(duì)是否添加乙醇和菜籽油、發(fā)酵時(shí)間以及乙醇添加模式這3個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，與此同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵進(jìn)一步提升FAEE產(chǎn)量，獲得以下結(jié)論：

阻斷甾醇酯途徑、三酰基甘油途徑和β氧化途徑顯著提升了FAEE產(chǎn)量，相較于BYW2菌株FAEE產(chǎn)量提升了9倍。以BYD5W2為出發(fā)菌株，F(xiàn)AEE發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加乙醇和體積分?jǐn)?shù)2%菜籽油會(huì)顯著提升FAEE產(chǎn)量，達(dá)到59.3 mg/L，相對(duì)于只添加葡萄糖發(fā)酵的FAEE產(chǎn)量提升了5.1倍；最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h，從20 h開(kāi)始分批定量補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)2%的乙醇，間隔補(bǔ)加時(shí)間為6 h時(shí)，F(xiàn)AEE產(chǎn)量最高，達(dá)到144.4 mg/L，相對(duì)于只添加葡萄糖發(fā)酵菌株BYD5W2的FAEE產(chǎn)量提升了12.3倍。發(fā)酵罐發(fā)酵比較了尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2與尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE產(chǎn)量的差別，結(jié)果表明，尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE產(chǎn)量最高，達(dá)到1.35 g/L，是目前報(bào)道的釀酒酵母中產(chǎn)FAEE產(chǎn)量較高的水平。