熊鎣姿,趙振,成婧,李佳銀,羅磊,李跑,李脈泉,劉霞*
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128)(2.長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心,食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410004)
苧麻為蕁麻科苧麻屬生宿根性草本植物,主要分布在亞熱帶和熱帶地區(qū),在我國湖南、云南、四川等省份均有種植[1]。苧麻莖皮擁有優(yōu)質(zhì)植物纖維,是重要的紡織工業(yè)原料,其根和葉是我國傳統(tǒng)中藥,有活血、安胎等功效[2]。現(xiàn)代研究主要致力于苧麻根、葉中的功能成分分析,特別是黃酮類化合物具有多種生物活性,一直是其研究的熱點(diǎn)[3,4]。目前已經(jīng)從苧麻中分離鑒定出十余種黃酮化合物,苧麻葉中主要有蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、野漆樹苷等,苧麻根中主要有蘆丁、槲皮素、紫杉葉素、紫云英苷、表兒茶素等[5-7],且研究表明,苧麻屬黃酮類化合物具有一定抗氧化[4]、抗炎、抗菌[8]、抑制乙肝病毒活性[9]的能力。但是對(duì)于苧麻籽的研究較少,現(xiàn)有的報(bào)道也只限于關(guān)于苧麻籽油的研究,研究發(fā)現(xiàn)苧麻籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸[10,11]。
超高效液相色譜-離子阱-超高分辨率質(zhì)譜技術(shù)(Ultra Performance Liquid Chcromatography-Orbitrap-High Resolution Mass Spectrometer,UPLC-Orbitrap-HRMS)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的分離鑒定技術(shù),具有超高壓、超高靈敏度,超高分離度等諸多優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)在單個(gè)分析周期內(nèi)即可完成對(duì)樣品高通量、高精度的一級(jí)、二級(jí)掃描,并且對(duì)復(fù)雜的樣品也可提供靈敏和可重復(fù)的監(jiān)測(cè),獲得精確質(zhì)量數(shù),實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的定性、定量和確證分析[12,13]。毛祈萍等[14]基于超高效液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)紫蘇化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,總共鑒定出 51個(gè)成分。本研究首先通過 1,1-二苯基-2-吡啶并肼基-高效液相色譜( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl-High performance liquid chromatography,DPPH-HPLC)方法,發(fā)現(xiàn)苧麻籽乙醇提取物中,存在多種抗氧化活性成分。隨后,通過掃描相應(yīng)色譜峰的紫外吸收光譜,初步推斷其抗氧化活性成分多為黃酮類化合物。然后采用 UPLC-Orbitrap-HRMS對(duì)苧麻籽的乙醇提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分析,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)、相關(guān)文獻(xiàn)和MsBank、mzCloud質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,對(duì)樣品質(zhì)譜信息進(jìn)行解析,推斷其可能存在的化合物,并對(duì)其中部分化合物的質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行了分析,為苧麻籽的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。
苧麻籽(品種為湘苧三號(hào),湖南長(zhǎng)沙湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所“湘苧三號(hào)”原種基地)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所提供,于2019年1月初采收。經(jīng)清洗、干燥、粉碎、過60目篩后制成苧麻籽粉末。
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度 98%)、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.7%),成都曼斯特生物科技有限公司。
無水乙醇,鄭州派尼化學(xué)試劑廠;石油醚(沸程30~60 ℃),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1,1-二苯基-2-吡啶并肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;乙腈(色譜級(jí)),美國TEDIA試劑有限公司;甲酸(色譜級(jí)),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
AUY220電子天平,日本島津公司;KQ250DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;BJ-100高速多功能粉碎機(jī),德清拜杰電器有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鞏義市予華儀器有限公司;SH-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器有限公司;FD-1B真空冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Agilent 1100高效液相色譜儀(配有UV-VIS檢測(cè)器,UV-VIS的型號(hào)為Agilent 1100/1200 VWD),美國Agilent公司;UPLC- Orbitrap fusion色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI)及離子阱質(zhì)量分析器(orbitrap)),美國Thermo Fisher公司。
1.3.1 苧麻籽乙醇提取物和樣品液的制備
根據(jù)文獻(xiàn)[15,16],采用70%的乙醇溶液(V/V)提取苧麻籽中的化學(xué)成分。取一定量苧麻籽粉末,按照液料比20:1(mL/g)加入70%的乙醇溶液(V/V),在功率250 W、溫度60 ℃的超聲清洗器中超聲提取90 min后抽濾。濾液在 50 ℃下減壓蒸發(fā),回收乙醇,獲得濃縮液。濃縮液經(jīng)石油醚多次萃取,除去脂溶性物質(zhì),再減壓蒸發(fā)除去石油醚,在-70 ℃下冷凍干燥得苧麻籽乙醇提取物。適量稱取獲得的苧麻籽乙醇提取物固體,以 70%乙醇溶液(V/V)為溶劑,適量溶劑使之溶解,獲得樣品液。
1.3.2 對(duì)照品溶液配置
精密稱取蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各20.0 mg,以70%乙醇溶液(V/V)為溶劑,配制成濃度均為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。
1.3.3 DPPH溶液配置
精密稱取25 mg DPPH,以無水乙醇為溶劑,使用25 mL的容量瓶定容至 25 mL,配置成濃度為1 mg/mL DPPH溶液。
1.3.4 苧麻籽乙醇提取物的抗氧化組分分析
采用DPPH-HPLC法,分析苧麻籽乙醇提取物中,是否存在抗氧化組分。取 0.2 mL樣品液與 1 mL 1 mg/mL DPPH溶液混合,避光放置30 min,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析,以1 mL無水乙醇代替DPPH溶液為反應(yīng)前對(duì)照。
HPLC條件:Agilent 5TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);在線脫氣單元、四元泵、UV檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器;柱溫30 ℃,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm[17],進(jìn)樣量10 μL,樣品液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。梯度洗脫條件[18]如表1。
表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 HPLC gradient elution conditions
1.3.5 苧麻籽乙醇提取物的 UPLC-Orbitrap-HRMS分析
采用 UPLC-Orbitrap-HRMS,對(duì)苧麻籽乙醇提取物進(jìn)行成分分析。
UPLC條件:Agilent 5TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、在線脫氣單元、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫40 ℃,流速0.5 mL/min,樣品液濾膜過濾后進(jìn)樣5 μL,梯度洗脫條件見表1。
HRMS條件:電噴霧離子源(ESI),離子阱質(zhì)量分析器(orbitrap),噴霧電壓3500 V(正離子模式),毛細(xì)管溫度320 ℃,鞘氣40 Arb,輔助氣5 Arb。
DPPH是一種較為穩(wěn)定的小分子自由基,常用于天然產(chǎn)物中抗氧化劑的篩選[19]??寡趸钚猿煞峙cDPPH中的單電子進(jìn)行配對(duì),使得抗氧化物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,在HPLC譜圖上表現(xiàn)為抗氧化物質(zhì)峰面積的減少或消失。因此比較樣品與 DPPH反應(yīng)前后的HPLC譜圖,可以初步判斷樣品中是否含有抗氧化活性組分[20]。圖1為苧麻籽乙醇提取物與DPPH反應(yīng)前后的HPLC譜圖。從圖1可以明顯看出,苧麻籽乙醇提取物中出現(xiàn)13個(gè)峰。當(dāng)苧麻籽乙醇提取物與DPPH反應(yīng)后,其中峰1、2、3、4、6的色譜峰峰面積明顯減小,峰9的色譜峰已消失,表明苧麻籽提取物中有多種抗氧化活性物質(zhì)。
黃酮類化合物的紫外吸收主要分布在 300~400 nm(帶Ⅰ)和220~280 nm(帶Ⅱ)兩個(gè)波段[21]。為了進(jìn)一步分析上述色譜所分離出的物質(zhì)(1、2、3、4、6、9)是否屬于黃酮類化合物;應(yīng)用Agilent 1100高相液相色譜儀,采用在線停泵掃描方式,掃描上述各種物質(zhì)的紫外吸收光譜。停泵時(shí)間為目標(biāo)色譜峰的出峰到峰頂保留時(shí)間的三分之一,掃描波長(zhǎng)范圍為190~400 nm。結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出,色譜峰1只在帶Ⅱ中存在紫外吸收,但是色譜峰2、3、4、6、9在帶Ⅰ和帶Ⅱ中都存在紫外吸收,且?guī)Б裰械淖畲笞贤馕詹ㄩL(zhǎng)分別為:347、350、245、352、291 nm,帶Ⅱ中的最大紫外吸收波長(zhǎng)分別為:258、260、259、260、242 nm。在兩個(gè)吸收帶中都存在紫外吸收的色譜峰2、3、4、6均符合黃酮類物質(zhì)的紫外吸收特征,因此推斷苧麻籽乙醇提取物含有多種抗氧化活性的黃酮類化合物。
表2 各色譜峰的紫外吸收帶Table 2 Ultraviolet absorption bands of various peaks
為進(jìn)一步明確苧麻籽乙醇提取物中的化合物,采用UPLC-Orbitrap-HRMS對(duì)其進(jìn)行分析。圖2為樣品的總離子流色譜圖,將其與對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)、MsBank、mzCloud質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比,初步鑒別出20種化合物(見表3),其中黃酮類化合物10種,分別為原花青素二聚體、蘆丁、異槲皮苷/金絲桃苷、山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷/山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮苷、槲皮素、山萘酚、阿福豆苷。B族維生素3種,分別為維生素B1、維生素B6、維生素B2。核苷類物質(zhì)2種(鳥苷和腺苷),氨基酸類物質(zhì) 2 種(N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸和酪氨酸),糖類物質(zhì)2種(麥芽四糖和D-氨基葡萄糖),酸類物質(zhì)1種(反式-3-吲哚丙烯酸)。
表3 質(zhì)譜分析結(jié)果Table 3 Mass spectrometry results
目前對(duì)于苧麻中化學(xué)成分的研究報(bào)道很多,但僅限于苧麻的根莖葉。研究人員發(fā)現(xiàn),苧麻根含有酚類、多糖類、黃酮、萜類及有機(jī)酸類物質(zhì),并且從根據(jù)其紫外吸收光譜,可初步鑒定出苧麻根中含有黃酮類化合物,同時(shí)發(fā)現(xiàn)起抗氧化作用的是其中的黃酮苷元[22]。苧麻葉中含有與根中所含的相同成分綠原酸,此外還含有原兒茶酸等有機(jī)酸和黃酮類化合物野漆樹昔,蘆丁等。鮮葉中還含α-及β-胡蘿卜素、葉黃素和含量較高的維生素A[13]。將苧麻根和苧麻葉中所含的化合物與本實(shí)驗(yàn)鑒定出來的化合物進(jìn)行對(duì)比,可以發(fā)現(xiàn)苧麻籽其中原花青素二聚體、蘆丁、異槲皮苷/金絲桃苷、山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷/山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮苷、槲皮素、山萘酚、阿福豆苷都是屬于黃酮苷元,與苧麻葉和苧麻根中的黃酮類化合物基本一致,并且具有較強(qiáng)的抗氧化活性。
從提取物中鑒定出來的20種化合物中,黃酮類化合物占絕大部分,進(jìn)一步表明黃酮類化合物可能是苧麻籽中的主要抗氧化成分。根據(jù)初步鑒定的各黃酮類化合物的結(jié)構(gòu),分析其可能的質(zhì)譜裂解途徑。
2.3.1 化合物9
化合物9準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比為m/z579,推測(cè)分子質(zhì)量為 578,其二級(jí)質(zhì)譜(圖3)中觀察到關(guān)鍵碎片離子m/z409和m/z291,這與原花青素二聚體的裂解規(guī)律一致。有研究表明,原花青素二聚體的裂解方式主要包括黃烷醇之間連接鍵的斷裂和逆迪爾斯-阿德爾反應(yīng)(Retro-diels-alder,RDA)[28]。RDA反應(yīng)是失去了一個(gè)中性結(jié)構(gòu)C8H8O3后再失去一個(gè)H2O后產(chǎn)生碎片離子m/z409;黃烷醇間的連接鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生碎片離子m/z291,即[(表)兒茶素+H]+。[(表)兒茶素+H]+可以進(jìn)一步發(fā)生RDA裂解,C環(huán)1,4鍵(1,4 A)斷裂后產(chǎn)生包含A環(huán)但失去B環(huán)的碎片離子m/z127;C環(huán)的1,3鍵(1,3 A)斷裂后產(chǎn)生包含A環(huán)丟失B環(huán)的碎片離子m/z139以及C環(huán)的1,2鍵(1,2 A)斷裂后產(chǎn)生碎片m/z167[37]。由此推測(cè)化合物9為原花青素二聚體,分子式為C30H26O12,其可能的裂解途徑為圖4。
2.3.2 化合物12
化合物12的質(zhì)譜信息與蘆丁對(duì)照品一致,確定為蘆丁,分子式為C27H30O16,其MS圖為圖5。準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+、[M+Na]+的質(zhì)荷比分別為m/z611和m/z633,碎片離子m/z303為其脫去蕓香糖(C12H20O9)后的[槲皮素+H]+。在一級(jí)質(zhì)譜圖中觀察到碎片離子m/z465,推測(cè)為準(zhǔn)分子離子[M+H]+經(jīng)碰撞失去一分子的鼠李糖形成的[M+H-C6H10O4]+[29]。由此,推導(dǎo)出蘆丁可能的裂解途徑如圖6所示。
2.3.3 化合物13、15、17
化合物13、15、17的二級(jí)質(zhì)譜均為m/z303的碎片離子,推測(cè)為[槲皮素+H]+?;衔?13的準(zhǔn)分子離子[M+H]+質(zhì)荷比為m/z465,推測(cè)其分子質(zhì)量為464,在碰撞過程中失去一個(gè)分子質(zhì)量為162的葡萄糖或半乳糖中性片段[30],其可能為異槲皮苷或金絲桃苷;化合物 15的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+質(zhì)荷比為m/z435,推測(cè)其分子質(zhì)量為 434,在碰撞過程中失去了一個(gè)分子質(zhì)量為 132的中性片段[38],化合物 15可能為槲皮素-3-O-β-D-木糖苷;化合物17的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+質(zhì)荷比為m/z449,推測(cè)分子質(zhì)量為448[33],推測(cè)其為槲皮苷。化合物13、15、17可能的結(jié)構(gòu)和裂解途徑如圖7所示。
2.3.4 化合物18
化合物18的質(zhì)譜信息同槲皮素對(duì)照品一致,推測(cè)為槲皮素,分子式為C15H10O7,準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比為m/z303,其二級(jí)質(zhì)譜如圖8所示。苯環(huán)較穩(wěn)定,黃酮醇的裂解多為C環(huán)發(fā)生的RDA反應(yīng),槲皮素的 C 環(huán)0,2 鍵(0,2 A)與 1,3 鍵(1,3 A)發(fā)生斷裂,分別生成包含A環(huán)但失去B環(huán)的碎片離子m/z165和m/z153[34]。此外在裂解中,羰基由于其較強(qiáng)的電負(fù)性較容易失去[34],所以推測(cè)槲皮素在失去了一個(gè)C環(huán)上的羰基(CO)后得到碎片離子m/z275,該碎片再失去一分子H2O得m/z257,或者槲皮素先丟失一個(gè)H2O得m/z285再失去一個(gè)CO得m/z257。碎片離子m/z257經(jīng)重排后再失去一個(gè)CO得m/z229[39]。圖9為化合物18可能的分裂途徑。
2.3.5 化合物19
化合物19的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比為m/z287,二級(jí)質(zhì)譜(圖10)中出現(xiàn)與槲皮素質(zhì)譜中部分相同碎片離子峰m/z153和m/z165,猜測(cè)化合物19與槲皮素具有類似的結(jié)構(gòu),且其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比以及部分二級(jí)碎片離子的質(zhì)荷比均比槲皮素少16(如m/z287與m/z303、m/z213與m/z229、m/z241與m/z257、m/z259與m/z275、m/z269與m/z285),即一個(gè)O原子的相對(duì)質(zhì)量,從而推測(cè)化合物19的分子式為C15H10O6,從而推測(cè)可能是與槲皮素裂解相似的山萘酚[35]。山萘酚的C環(huán)0,2鍵(0,4 A)與C環(huán)1,3鍵(1,3 A)發(fā)生斷裂,分別生成包含A環(huán)但失去B環(huán)的碎片離子m/z165和m/z153。此外,山萘酚在失去了一個(gè)C環(huán)上的羰基(CO)后得到碎片離子m/z259,該碎片再失去一分子H2O得m/z241,或者山萘酚先丟失一個(gè)H2O得m/z269再失去C環(huán)羰基得m/z241。碎片離子m/z259與m/z241可再失去一分子CO分別得到m/z231和m/z213。圖11為化合物19可能的分裂途徑。
2.3.6 化合物14、16、20
化合物14、16、20的二級(jí)質(zhì)譜均為m/z287碎片離子,推測(cè)為[山萘酚+H]+。化合物 14準(zhǔn)分子離子[M+H]+質(zhì)荷比為m/z595,推測(cè)其分子質(zhì)量為594,與蘆丁的裂解相似,在二級(jí)質(zhì)譜中失去了一個(gè)相對(duì)質(zhì)量為308的分子片段[31],推測(cè)其為山萘酚-3-O-β-D-蕓香糖苷?;衔?16的準(zhǔn)分子離子[M+H]+質(zhì)荷比為m/z449,推測(cè)其分子質(zhì)量為448,二級(jí)質(zhì)譜中失去一個(gè)分子質(zhì)量為162的分子片段,猜測(cè)該片段為葡萄糖或半乳糖[32],其可能為山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷。化合物20的準(zhǔn)分子離子[M+H]+質(zhì)荷比為m/z433,推測(cè)其在二級(jí)質(zhì)譜中失去一分子鼠李糖[36],可能為為山萘酚-3-O-β-D-鼠李糖苷,即阿福豆苷。圖12為化合物14、16、20可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)及裂解途徑。
2.3.7 非黃酮類化合物
除黃酮類化合物外,還從苧麻籽提取物中鑒定出糖類、核苷類、氨基酸類和B族維生素等化合物?;衔?準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+的質(zhì)荷比為m/z689,其二級(jí)碎片與文獻(xiàn)[23]中麥芽四糖的質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致,推測(cè)化合物2為麥芽四糖,推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為666。參考文獻(xiàn)[24],推測(cè)出化合物4和7分別為鳥苷和腺苷,二級(jí)碎片中的m/z152與m/z136分別為二者脫去一分子核糖后所得?;衔?與文獻(xiàn)[37]中酪氨酸的質(zhì)譜信息一致,推測(cè)其為酪氨酸?;衔?、8、11分別與文獻(xiàn)[26,27]中所描述的維生素 B1、維生素 B6、維生素 B2的質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致,推測(cè)化合物6為維生素B1,化合物8為維生素B6,化合物11為維生素B2。
本研究首先基于DPPH-HPLC技術(shù),發(fā)現(xiàn)苧麻籽乙醇提取物存在多種抗氧化成分。應(yīng)用 UPLC-Orbitrap-HRMS技術(shù),對(duì)其主要化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)合 MsBank、mzCloud質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,相關(guān)文獻(xiàn)和相關(guān)對(duì)照品對(duì)樣品主要化學(xué)成分質(zhì)譜圖進(jìn)行分析。初步鑒定苧麻籽乙醇提取物含有黃酮類化合物10種,分別為原花青素二聚體、蘆丁、異槲皮苷/金絲桃苷、山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-木糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖苷/山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮苷、槲皮素、山萘酚、阿福豆苷。其他物質(zhì)為維生素B1、維生素 B6、維生素 B2、鳥苷、腺苷、N6,N6,N6-三甲基-L-賴氨酸、酪氨酸、麥芽四糖、D-氨基葡萄糖和反式-3-吲哚丙烯酸。苧麻籽乙醇提取物中主要是黃酮類化合物,上述黃酮類化合物是已被證明過有較強(qiáng)抗氧化活性的黃酮糖苷類,說明苧麻籽具有潛在的抗氧化活性,這為后續(xù)苧麻籽的開發(fā)和利用提供了良好的理論基礎(chǔ)。