冠突散囊菌抑菌產(chǎn)物培養(yǎng)基優(yōu)化及分離鑒定

張 雯， 王明鈺， 尤靜觀， 倪 莉

（福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所 福州350108）

冠突散囊菌（Eurotiumcristatum）是發(fā)菌科散囊菌屬的一種益生真菌，俗稱“金花”菌，是茯磚茶“發(fā)花”過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌。 目前報(bào)道的散囊菌屬真菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為有抑菌活性[1-5]。 冠突散囊菌在茯磚茶中生長(zhǎng)，該過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，抑制其它微生物的生長(zhǎng)， 并大量的繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌[6]。從黑茶中分離得到的冠突散囊菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物， 對(duì)枯草芽孢桿菌和白色鏈球菌具有抑菌性， 且有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[7]。Du 等[8]從冠突散囊菌EN-220 中分離得到多種芳香族糖苷，對(duì)大腸桿菌具有抑制活性。

本課題組在前期研究中分離得到1 株冠突散囊菌FS-10， 其發(fā)酵濾液對(duì)魚(yú)源腐敗菌具有明顯的抑制作用。為此，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化冠突散囊菌FS-10 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基；采用高效液相色譜（HPLC）、基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和傅里葉紅外光譜（FT-IR）對(duì)冠突散囊菌FS-10 發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用菌和培養(yǎng)

1.1.1 供試菌株 冠突散囊菌（E. cristatum）FS-10，保藏于福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所；食源性腐敗菌，包括嗜冷菌（Psychrophile）DHY-1，希瓦氏菌（Shewanella spp.）JC-20、HC-44、R3-2，假單胞菌（Pseudomonas spp.）LP-3、LP-6，分離自大黃魚(yú)魚(yú)肉與魚(yú)腸， 保藏于福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所。

1.1.2 菌體培養(yǎng) 抑菌活性測(cè)定用菌液體培養(yǎng)。用無(wú)菌接種環(huán)取1 環(huán)供測(cè)菌， 接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（牛肉膏0.5 g，氯化鈉0.5 g，蛋白胨1 g，蒸餾水定容100 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃、高壓滅菌30 min）， 于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，將菌液稀釋至1 000 倍，得到濃度約為1×105CFU/mL 的供測(cè)菌菌懸液，備用。

冠突散囊菌菌株FS-10 發(fā)酵無(wú)菌上清液的制備方法：采用菌塊接種法制備發(fā)酵上清液[9]。 將菌株FS-10 在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （PDA）（馬鈴薯200 g，無(wú)水葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然）平板上培養(yǎng)7 d，取1 個(gè)直徑為8 mm 的菌塊接入馬鈴薯葡萄糖液體 （PDL）培養(yǎng)基中， 在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以28 ℃，200 r/min條件培養(yǎng)7 d。 培養(yǎng)結(jié)束后，13 000 r/min 離心15 min，上清液用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，得到無(wú)菌發(fā)酵濾液，于4 ℃保存，備用。

1.2 發(fā)酵濾液抑菌活性的測(cè)定

采用濁度法測(cè)定抑菌活性[10-11]。 取1 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基注入微孔板中， 加入10 μL 1.1.2 節(jié)得到的指示菌菌懸液， 在試驗(yàn)組中加入100 μL 無(wú)菌發(fā)酵濾液或待測(cè)組分，在對(duì)照組中加入100 μL PDL 培養(yǎng)基， 將試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)置于30 ℃，200 r/min 的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定并記錄各組在波長(zhǎng)600 nm處的吸光值，抑菌率計(jì)算公式如下：

式（1） 中，A600nm’——對(duì)照組樣品的吸光值；A600nm——試驗(yàn)組樣品的吸光值。

1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)基成分

1.3.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以無(wú)菌發(fā)酵濾液的抑菌率為響應(yīng)值 （以嗜冷菌DHY-1 為供測(cè)菌）， 以葡萄糖為碳源、 硝酸鈉作為氮源， 采用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究碳源、 氮源以及微量元素（氯化鈉、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳）對(duì)抑菌活性的影響。采用Minitab 軟件對(duì)所選水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及模型的建立，設(shè)計(jì)六因素二水平試驗(yàn)優(yōu)化抑菌效果，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及編碼水平Table 1 The factor and code level of Plackett-Burman experimental design

1.3.2 最陡爬坡試驗(yàn) 以Plackett-Burman 試驗(yàn)得出的回歸方程的系數(shù)（正、負(fù)）確定各因素的爬坡方向，以各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，從而快速逼近最大值響應(yīng)值。 最陡爬坡試驗(yàn)除去影響顯著因子，其它各因素均保持不變。

1.3.3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果確定培養(yǎng)基中對(duì)冠突散囊菌的抑菌物質(zhì)具有顯著影響的因子， 結(jié)合最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際情況， 選擇下一步試驗(yàn)水平的中心點(diǎn)和各水平的步長(zhǎng)。 設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)優(yōu)化抑菌效果，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及編碼水平Table 2 The factor and code level of Box-Behnken experimental design

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 用優(yōu)化得到的培養(yǎng)基成分、質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件做3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。 若所得試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值較接近， 則說(shuō)明該響應(yīng)面模型有參考價(jià)值。

1.4 抑菌活性物質(zhì)的分離純化和鑒定

1.4.1 超濾和透析 各組分抑菌活性比較采用截留分子質(zhì)量為10 ku 的超濾膜和7 ku 的透析袋分步收集。 首先采用截留分子質(zhì)量為10 ku 的超濾膜分離菌株FS-10 無(wú)菌發(fā)酵濾液， 得到分子質(zhì)量范圍大于10 u 的濃縮液和分子質(zhì)量小于10 ku 的濾液。凍干后復(fù)溶為質(zhì)量濃度為4 mg/mL 的溶液，分析2 個(gè)組分的抑菌活性。 將活性高的濾液采用截留分子質(zhì)量為7 ku 的透析袋， 將其置于10 倍于樣品溶液體積的去離子水中透析4 h，得到2 個(gè)組分（截留液、透過(guò)液），冷凍干燥后，將凍干粉末復(fù)溶為4 mg/mL 溶液，做抑菌試驗(yàn)。

1.4.2 凝膠色譜柱層析 以葡聚糖凝膠G-75 為填料，選用30 cm×Φ2.6 cm 的層析柱，將1.4.1 節(jié)所得抑菌活性組分的凍干粉加少許緩沖液稀釋?zhuān)?.22 μm 濾膜過(guò)濾后上樣， 用去離子水以0.3 mL/min 的流速洗脫， 在波長(zhǎng)280 nm 處檢測(cè)吸光度，收集各洗脫峰，冷凍干燥備用。 將凍干粉末復(fù)溶為4 mg/mL 的溶液，做抑菌試驗(yàn)，選出具有抑菌活性的洗脫峰。

1.4.3 反相高效液相色譜 將1.4.2 節(jié)所得具有抑菌活性的洗脫峰凍干粉加少許緩沖液稀釋?zhuān)?.22 μm 濾膜過(guò)濾后上樣， 采用C18 柱進(jìn)行液相色譜分離。 檢測(cè)波長(zhǎng)分別為280 nm 和220 nm；流動(dòng)相A 為0.01%三氟乙酸水溶液， 流動(dòng)性B 為0.01%三氟乙酸乙腈溶液；進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min。 梯度洗脫條件：0～10 min，80% A、20% B；10～40 min，A 變化為80%～20%，B 為20%～80%；40 ～50 min，20% A、80% B；50 ～60 min，A變化為20%～80%，B 為80%～20%。 富集各組分后，減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，取沉淀物質(zhì)用去離子水復(fù)溶為0.4 mg/mL 的樣品溶液，做抑菌試驗(yàn)。

1.4.4 結(jié)構(gòu)鑒定 活性組分委托福建中醫(yī)藥大學(xué)采用基質(zhì)輔助激光誘導(dǎo)解析飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分子質(zhì)量鑒定。 質(zhì)譜分析采用Autoflex speed MALDI-TOF 質(zhì)譜儀，電噴霧（ESI）正離子模式。采用Nicolet iS50 傅里葉紅外光譜儀對(duì)純化的抑菌組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 利用溴化鉀壓片法，在400～4 000 cm-1波段對(duì)樣品進(jìn)行掃描分析。

1.5 冠突散囊菌FS-10 抑菌活性物質(zhì)的特性

1.5.1 抑菌譜測(cè)定 按1.1.2 節(jié)所述制備嗜冷菌DHY-1、希瓦氏菌（JC-20、HC-44、R3-2）、假單胞菌（LP-3、LP-6）等6 株細(xì)菌的菌懸液，用1.4.3 節(jié)抑菌活性組分測(cè)定抑菌率。

1.5.2 抑菌濃度測(cè)定 采用兩倍連續(xù)稀釋方法將1.4.3 節(jié)純化得到的抑菌活性組分配成質(zhì)量濃度分 別 為2 000，1 000，500，250，25，62.5，31.25 μg/mL 的樣品溶液， 以0.25 μg/mL 氯霉素為陽(yáng)性對(duì)照，水為空白對(duì)照，PDL 培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，以嗜冷菌DHY-1 為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法[10]做抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5.3 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 取等量 （0.4 mg/mL）將1.4.3 節(jié)純化得到的抑菌活性組分分別置于-20，4，25，100，121 ℃環(huán)境中30 min， 在室溫放置10 min 后，以嗜冷菌DHY-1 為指示菌，做抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5.4 酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定 取等量 （0.4 mg/mL）1.4.3 節(jié)純化得到的抑菌活性組分， 調(diào)節(jié)pH 值分別為2.0，5.0，7.0，9.0，13.0， 室溫放置30 min 后，采用3 mol/L HCl 溶液和NaOH 溶液將樣品調(diào)回原始pH 5.0，加去離子水定容1.5 mL。 以嗜冷菌DHY-1 為指示菌，做抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌FS-10 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析 采用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以抑菌率為響應(yīng)值，對(duì)葡萄糖、硝酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鋅、硫酸錳6 個(gè)成分進(jìn)行考察。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，各因子效應(yīng)分析見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y （抑菌率）=0.36434+0.03191A+0.06667B+0.01972C+0.00416D-0.00214E+0.00556F。由表4 可知，系數(shù)項(xiàng)A（葡萄糖）、B（硝酸鈉）、C（氯化鉀）3 項(xiàng)因子是培養(yǎng)基中影響菌株FS-10 發(fā)酵液抑菌效果的關(guān)鍵因子（P＜0.05）。

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸各因子效應(yīng)分析Table 4 Regression factor analyses of Plackett-Burman experimental design

2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn) 通過(guò)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出關(guān)鍵因子，即葡萄糖、硝酸鈉、氯化鉀。最陡爬坡試驗(yàn)以這3 者為考察對(duì)象，固定其它條件不變。 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)梯度設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

由表5 可得，最陡爬坡試驗(yàn)5 組試驗(yàn)的抑菌率整體呈先上升后下降的趨勢(shì)。 在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.50%無(wú)水葡萄糖、0.65%硝酸鈉、4.00%氯化鉀時(shí)，所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液抑菌率最高，為三因素的最大響應(yīng)值區(qū)域。 選擇第4 組作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.1.3 響應(yīng)曲面與驗(yàn)證模型的建立 結(jié)合Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和最陡爬坡試驗(yàn)所得結(jié)果，利用Minitab 軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

由表7 可得，G（葡萄糖）和I（氯化鉀）顯著性較高，對(duì)于抑菌率的影響較大（P＜0.05）。 二次項(xiàng)中H2、G2、I2的P 值依次增大，H2的顯著性較高。交互項(xiàng)中3 項(xiàng)的P 均大于0.05， 因此GH、GI、HI 之間的交互作用不是很明顯。

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸系數(shù)和顯著性驗(yàn)證Table 7 Significance test and coefficient of Box-Behnken experimental design

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析， 得出冠突散囊菌FS-10 發(fā)酵液抑菌率對(duì)葡萄糖（碳源）、硝酸鈉（氮源）、氯化鉀的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y（抑菌率）=0.4904+0.03689G+0.01613H+0.02521I-0.0265G2-0.0319H2+0.0201I2+0.0193GH +0.0085GI -0.0114 HI。

由表8 可以看出該模型的P=0.022，在一定程度上可看出該二次多項(xiàng)模型具有顯著性（P＜0.05），方差分析該模型的R2=92.79%，說(shuō)明模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的吻合性較好。 R2Adj=79.82%， 大于70%，存在相關(guān)性，而與R2值之間差距仍較大。

表8 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型分析Table 8 Variance analysis of Box-Behnken experimental design

根據(jù)上述回歸方程運(yùn)用Minitab 軟件繪制響應(yīng)曲面圖與等值線圖，見(jiàn)圖1。

由圖1a、1b 可知， 當(dāng)硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持不變時(shí)，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，抑菌率提高；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在7.0%～7.5%， 硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.65%～0.75%范圍時(shí)，抑菌率較高。該響應(yīng)曲面圖初具模型， 若將葡萄糖和硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，則出現(xiàn)響應(yīng)曲面完整的高位點(diǎn)。

由圖1c、1d 可知，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，抑菌率隨氯化鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大； 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于6.5%時(shí)，抑菌率增大。 抑菌率響應(yīng)面高點(diǎn)出現(xiàn)在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)葡萄糖和高質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鉀區(qū)域。

由圖1e、1f 可知，當(dāng)氯化鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，抑菌率隨著硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先升后降的趨勢(shì)， 抑菌率響應(yīng)面高點(diǎn)出現(xiàn)在硝酸鈉中質(zhì)量分?jǐn)?shù)區(qū)域。

圖1 各因子交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.1 Surface maps and contour maps for each factor interaction

2.1.4 回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn) 利用響應(yīng)優(yōu)化器證實(shí)預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的擬合程度， 得出培養(yǎng)基最優(yōu)條件為7.5%葡萄糖、0.65%硝酸鈉、4.5%氯化鉀，預(yù)測(cè)抑菌率為54.44%。 以此條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，其抑菌率為（51.0±4.4）%，說(shuō)明利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方條件有參考價(jià)值。

2.2 冠突散囊菌FS-10 抑菌活性物質(zhì)分離純化和鑒定

將發(fā)酵液經(jīng)10 ku 超濾膜過(guò)濾后， 活性較高的過(guò)濾液進(jìn)一步采用7 ku 的透析膜透析，各組分進(jìn)行活性測(cè)定，如表9 所示。該透過(guò)液凍干后經(jīng)凝膠色譜分離，得到1 個(gè)高純度的單峰，見(jiàn)圖2，經(jīng)抑菌活性測(cè)定，該峰（4 mg/mL）抑菌率為74.5%。進(jìn)一步利用反相高效液相色譜分離得到6 個(gè)組分（FS-I、FS-II、FS-III、FS-IV、FS-V、FS-VI），如圖3所示。 收集各組分峰，檢測(cè)各組分的抑菌活性，結(jié)果組分FS-IV 和FS-VI 具有明顯的抑菌效果，對(duì)嗜冷菌DHY-1 的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）分別為0.4 mg/mL 和0.3 mg/mL。 其余4 個(gè)組分均無(wú)明顯的抑菌作用。具有抑菌活性FS-IV 和FS-VI，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜 （MALDITOF-MS）分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，兩個(gè)目標(biāo)抑菌活性組分的分子質(zhì)量分別為1 630.8 u 和840.5 u。

表9 超濾和透析后各組分的抑菌活性Table 9 Antibacterial activity of each component after ultrafiltration and dialysis

圖2 凝膠過(guò)濾柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of gel filtration column chromatography

圖3 反相高效液相色譜圖Fig.3 RP-HPLC absorption of active compounds

圖4 組分FS-IV 和FS-VI 的MALDI-TOF-MS 圖Fig.4 MALDI-TOF-MS of components FS-IV and FS-VI

利用傅里葉紅外光譜分別掃描經(jīng)由高效液相色譜分離得到的兩個(gè)抑菌組分FS-IV 和FS-VI（圖5）。 組分FS-IV 和組分FS-VI 在3 550～3 200 cm-1范圍出現(xiàn)寬而散的吸收峰，存在締合型羥基；在1 600 cm-1附近顯示C=C 振動(dòng)；在1 300 cm-1附近顯示C-N 振動(dòng)。

如圖5a 所示， 標(biāo)志組分FS-IV 在2 934.163 cm-1處的弱吸收峰為C-H 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；1 150～1 060 cm-1范圍為醚或其它化合物中C-OC 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；900 cm-1附近為C-C 振動(dòng)；＜500 cm-1為C-C-C 振動(dòng)。 綜上，推測(cè)組分FS-Ⅳ是雜多糖衍生化合物。

如圖5b 所示， 標(biāo)志組分FS-Ⅵ在1 092.477 cm-1處的吸收峰和在905.4153，854.3109 m-1和781.9933 cm-1處的吸收峰為酯類(lèi)化合物中C-O鍵的兩個(gè)吸收峰； 在1 000～700 cm-1范圍明顯的吸收峰為烯烴C=C-H 振動(dòng)；614.2167 cm-1處為炔烴C≡C-H 的變形振動(dòng)。 綜上，推測(cè)組分FS-Ⅵ是酰胺類(lèi)衍生化合物。

圖5 組分FS-IV 和FS-VI 的傅里葉紅外吸收光譜Fig.5 FT-IR absorption of components FS-IV and FS-VI

多位學(xué)者從冠突散囊菌發(fā)酵液中分離得到多種吲哚生物堿[12-14]，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌有不同的抑制作用。 吲哚生物堿是一類(lèi)含氮的化合物， 由色氨酸衍生而來(lái)， 多為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 彭曉赟等[15]從冠突散囊菌中分離到多種苯甲醛類(lèi)化合物， 認(rèn)為冠突散囊菌中的主要代謝產(chǎn)物是苯甲醛類(lèi)化合物， 試驗(yàn)分離得到的灰綠曲霉黃色素、2-（2′， 3-環(huán)氧基-1′， 3′-庚二烯基）-6-羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基） 苯甲醛、2-（2′， 3-環(huán)氧基-1′， 3′ 5′-庚三烯基）-6-羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基） 苯甲醛、酪醇、對(duì)羥基苯甲酸、苔黑酚等對(duì)多種腸道致病菌有抑制作用。 李瑩[16]從冠突散囊菌中分離純化得到大黃素等多種蒽醌類(lèi)活性化合物，蒽醌是一類(lèi)具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物，顏色多為橙色和黃色，具有抑菌活性。前期研究分離自冠突散囊菌發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)分子質(zhì)量均小于500 u[14-15，17-21]，而本研究首次得到分子質(zhì)量大于800 u 的兩種抑菌活性組分，推測(cè)得活性物質(zhì)中含有雜多糖的衍生化合物、 帶有酰胺類(lèi)衍生化合物等多種物質(zhì)。

2.3 冠突散囊菌FS-10 抑菌活性物質(zhì)的特性

2.3.1 抑菌廣譜性和抑菌濃度 兩個(gè)活性組分（FS-IV、FS-VI）對(duì)嗜冷菌DHY-1、希瓦氏菌（JC-20、HC-44、R3-2）、假單胞菌（LP-3、LP-6）的抑制活性見(jiàn)圖6。 活性組分對(duì)這6 株細(xì)菌均有抑制作用，其中對(duì)嗜冷菌DHY-1 和希瓦氏菌R3-2 的抑菌率超過(guò)50%， 且組分FS-VI 抑菌活性略高于組分FS-IV。 圖7 所示，兩個(gè)抑菌活性組分（FS-IV、FS-VI）對(duì)嗜冷菌的抑制作用都隨活性組分質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，0.25 μg/mL 氯霉素對(duì)嗜冷菌的抑制活性與250～500 μg/mL 的FS-IV、FS-VI 相當(dāng)（抑菌圈17.3～18.8 mm）。

圖6 組分FS-IV（a）和FS-VI（b）對(duì)食源腐敗細(xì)菌的抑制Fig.6 Inhibition of components FS-IV （a） and FS-VI （b） on foodborne spoilage bacteria

圖7 組分FS-IV（a）和FS-VI（b）拮抗嗜冷菌DHY-1Fig.7 Inhibition effect of components FS-IV （a） and FS-VI （b） against Psychrophile DHY-1

乳酸鏈球菌素Nisin 是目前少數(shù)允許用作食品添加劑的生物保鮮劑，其對(duì)金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、溶血鏈球菌、李斯特菌等一些革蘭氏陽(yáng)性菌有較為明顯的抑制作用， 而對(duì)革蘭氏陰性菌抑制效果不明顯， 且存在單一保鮮劑效果有限，易受環(huán)境因素影響，抗菌時(shí)效短等不足[22]。有研究表明，冠突散囊菌PDA 發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌、 金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌和大腸桿菌有抑制作用[6]。有研究人員從冠突散囊菌中分離出次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌有不同程度的抑制作用[14-15]。本研究從發(fā)酵液中分離得到新的活性組分， 對(duì)多種食源性革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抑制活性。綜上，冠突散囊菌在生物保鮮劑領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景廣闊。

2.3.2 穩(wěn)定性 兩個(gè)活性組分 （FS-IV、FS-VI）在-20～100 ℃范圍穩(wěn)定，甚至在121 ℃高溫處理后抑菌活性幾乎未損失（圖8a）。 處理溫度-20～121℃對(duì)組分的抑菌活性穩(wěn)定性無(wú)顯著影響， 表明兩個(gè)抑菌活性組分的熱穩(wěn)定性較好。

兩個(gè)活性組分（FS-IV、FS-VI）在pH 2～13 對(duì)嗜冷菌DHY-1 有較好的抑制作用 （圖8b）。 在pH 5 時(shí)抑菌能力最佳，這可能與冠突散囊菌的自然生長(zhǎng)環(huán)境呈弱酸性相關(guān)， 此條件下其代謝產(chǎn)物的活性也較高。 在pH 2 的過(guò)酸條件或pH 13 的過(guò)堿條件下抑菌率稍有下降，不顯著，兩個(gè)抑菌活性組分具有較好的酸、堿穩(wěn)定性。

圖8 組分FS-IV 和FS-VI 的穩(wěn)定性Fig.8 The stability of components FS-IV and FS-VI

3 結(jié)論

3.1 冠突散囊菌FS-10 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基成分

碳源對(duì)活性物質(zhì)的產(chǎn)生影響最為顯著。 通過(guò)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法相結(jié)合優(yōu)化， 經(jīng)回歸模型驗(yàn)證得到的冠突散囊菌FS-10 產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為無(wú)水葡萄糖（碳源）7.5%、硝酸鈉（氮源）0.65%、氯化鉀4.5%，發(fā)酵液對(duì)濃度為1×105CFU/mL 嗜冷菌菌懸液抑菌率達(dá)54.4%。

3.2 冠突散囊菌FS-10 抑菌活性物質(zhì)的生物學(xué)及理化性質(zhì)

冠突散囊菌FS-10 發(fā)酵液經(jīng)超濾、透析、凝膠過(guò)濾層析、高效液相色譜等一系列分離純化，得到兩個(gè)尚未報(bào)道的抑菌活性組分（FS-IV、FS-VI）。采用MALDI-TOF-MS 和傅里葉紅外光譜對(duì)其進(jìn)行鑒定， 組分FS-IV 和FS-VI 的分子質(zhì)量分別為1 630.8 u 和840.5 u，推測(cè)組分FS-IV 是雜多糖的衍生化合物，組分FS-VI 是酰胺類(lèi)衍生化合物。兩個(gè)抑菌活性組分對(duì)嗜冷菌、希瓦氏菌、假單胞菌等革蘭氏陰性食源性腐敗細(xì)菌有不同的抑制作用，且均有良好的熱穩(wěn)定性和酸、堿穩(wěn)定性。冠突散囊菌及其發(fā)酵液中存在多種抑菌活性物質(zhì)， 它們之間可能存在協(xié)同作用。