植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的作用

李宇軒， 王 琳

（北京食品科學(xué)研究院 中國肉類食品綜合研究中心 北京100068）

假單胞菌是冷卻肉中的關(guān)鍵腐敗菌[1-2]。 生物被膜是一種包裹細菌群落的外膜， 其成分十分復(fù)雜，含有細菌、細菌分泌的大分子多聚物（如蛋白質(zhì)、多糖、脫氧核糖核酸、核糖核酸、肽聚糖、磷脂等）、吸附的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物以及細菌裂解產(chǎn)物等[3-4]。 形成生物被膜后的假單胞菌對外界環(huán)境的耐性和抗性增加，難以被清除，在生產(chǎn)、加工以及流通經(jīng)營過程中，可附著于食品及原材料表面，對加工設(shè)備和操作人員造成二次污染[5-6]。

大量研究表明植物多酚具有抑菌[7-8]、抗炎[9-10]等作用。 例如：松毛菇多酚抑制金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母活性[11]，魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌生物被膜有清除作用[12]，金銀花中酚酸類成分對巨噬細胞經(jīng)LPS 刺激后產(chǎn)生的炎癥具有緩解作用[13]。然而， 植物活性成分對生物被膜的作用效果鮮有報道。植物多酚大多為多羥基結(jié)構(gòu)，與生物被膜中多糖成分具有結(jié)構(gòu)相似性， 能與之形成分子間作用力[14-15]。推斷植物多酚具有清除生物被膜的潛在能力[16-17]。然而，植物活性成分來源廣泛、分離難度大、成本較高，難以快速、準確篩選具有控制生物被膜的功能成分。 此外，植物活性成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，非單一性物質(zhì)參與生物活性反應(yīng)， 導(dǎo)致其對生物被膜的作用機制不明[18]。

蒲公英、金銀花、丁香、肉桂、薄荷、桑葉等已被我國列入“藥食同源食品”目錄，其植物提取物成本低，且在我國已實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。本研究將上述6 種比例提取物作用于淺黃假單胞菌及其生物被膜，探究其對生物被膜的抑制和清除效果，篩選出效果較好的植物提取物， 歸納總結(jié)提取物中的相似功效性成分。 從生物被膜的代謝活性和微觀結(jié)構(gòu)方面驗證該功效性成分對生物被膜的影響，旨在明確植物性功效成分與生物被膜的作用關(guān)系，初步探討植物性成分對生物被膜的作用機制，為調(diào)控生物被膜提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淺黃假單胞菌（Pse.luteola）8-4 為本實驗室保存菌株； 假單胞菌選擇性培養(yǎng)基， 法國科瑪嘉公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒， 天根生化科技有限公司； 引物由華大基因合成； 二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）；噻唑藍，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司； 異硫氰酸熒光素標記的刀豆蛋白A（FITC-conA）， 美國Sigma 公司；6 種植物提取物（10∶1 蒲公英提取物粉末、10∶1 金銀花提取物粉末、10∶1 丁香提取物粉末、10∶1 肉桂提取物粉末、10∶1 薄荷提取物粉末、10∶1 桑葉提取物粉末）、來源于金銀花的綠原酸粉末（純度98%），南京澤朗生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MULTISKAN GO 1510 酶標儀， 美國Thermo公司；BPC-150F 生化培養(yǎng)箱， 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)，生物梅里埃（中國）有限公司；BX 51 熒光顯微鏡，日本Olympus 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定 菌株進行革蘭氏染色、 形態(tài)觀察和氧化酶試驗，用16S rDNA 進行確證。 上游引物（27F）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物 （1492R）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′； 以細菌總DNA 為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）擴增[19]。PCR 擴增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，52℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)30 個循環(huán)，72 ℃保溫5 min[20-21]。PCR 產(chǎn)物送華大基因測序。測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站進行Blast 比對， 用MEGA5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22-23]。

1.3.2 碳源代謝指紋圖譜分析 用無菌棉簽收集30 ℃下營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)24 h 的菌株至生理鹽水中， 用濁度儀制備0.50～0.63 麥氏單位的菌懸液。 在GN 卡上， 每孔接種配制好的菌懸液100 μL。 將GN 卡置于載卡臺上，30 ℃孵育24 h。 用VITEK 2 Compact 微生物自動分析系統(tǒng)讀取GN卡板鑒定結(jié)果， 獲得菌株的碳源代謝指紋圖譜。GN 卡的碳源分布如表1 所示。

表1 GN 板的碳源分布Table 1 Distribution of carbon source on GN plate

1.3.3 生物被膜的定量檢測 將凍存于-80 ℃的淺黃假單胞菌8-4 解凍，接種于新鮮的TSB 液體培養(yǎng)基中，在（36±1）℃下培養(yǎng)24 h 活化，將經(jīng)過2 次活化10 h 以上的重懸菌液在光密度 （OD）為600 nm 處稀釋至0.5，將96 孔酶標板中加入195 μL TSB 培養(yǎng)基， 然后用移液器吸取5 μL 菌懸液至酶標板孔中，設(shè)置6 個平行和1 個空白對照，在30 ℃條件下將上述酶標板培養(yǎng)24 h，將酶標板孔內(nèi)浮游菌用無菌生理鹽水清洗干凈，重復(fù)3 次。用移液器吸取200 μL 甲醇放入每孔中，靜置15 min固定，吸出甲醇并置于超凈工作臺晾干；吸取質(zhì)量濃度為1 g/mL 的結(jié)晶紫草酸銨溶液200 μL 加入每孔中，染色5 min。 隨后吸出染液并用流水反復(fù)沖洗酶標板，直至洗凈；將酶標板晾干后，每孔加入200 μL 33%乙酸，用酶標儀測定OD655nm值[24-25]。

1.3.4 植物提取物對生物被膜的抑制作用 參考Andreia 等[26]和劉永吉等[27]的方法，利用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。 將195 μL用TSB 培養(yǎng)基稀釋的不同質(zhì)量濃度（50，25，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39，0.20，0.10，0.05，0.00 mg/mL）的植物提取物依次加入到96 孔板各列。 第1～7 行分別接種5 μL OD600nm=0.5 的菌懸液，第8 行不接菌，作為空白對照。 在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，然后根據(jù)觀察判斷，選出板中明顯不長菌的孔， 其對應(yīng)加入植物提取物的質(zhì)量濃度作為MIC。同時，按照1.3.3 節(jié)方法測定生物被膜，并計算抑制率，隨后選取相關(guān)數(shù)據(jù)進行做圖分析。

1.3.5 植物提取物對生物被膜的清除作用 在96 孔板加入新鮮的TSB 培養(yǎng)基，將假單胞菌8-4轉(zhuǎn)入并培養(yǎng)24 h，隨后將板孔內(nèi)培養(yǎng)基吸出，孔板用無菌生理鹽水清洗， 重復(fù)3 次。 將195 μL 用TSB 培養(yǎng)基稀釋的不同質(zhì)量濃度（50，25，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39，0.20，0.10，0.05，0.00 mg/mL）植物提取物依次加入到96 孔板各列。 30 ℃培養(yǎng)24 h，按照1.3.3 節(jié)的方法測定生物被膜，并計算清除率，隨后選取相關(guān)數(shù)據(jù)進行做圖分析。

1.3.6 生物被膜代謝活力的測定 將上一步96孔板中的培養(yǎng)液棄去， 用無菌磷酸鹽緩沖溶液沖洗孔板3 次，避光進行試驗操作，將10% MTT 溶液與TSB 培養(yǎng)基以體積比1∶9 混合均勻。 每孔加入200 μL 混合液，37 ℃避光培養(yǎng)4 h 后取出，棄廢液。用無菌磷酸鹽緩沖液清洗孔板3 次后，加入200 μL 二甲基亞砜 （Dimethyl sulfoxide， DMSO）靜置10 min，使結(jié)晶物甲瓚充分溶解。用酶標儀測定波長490 nm 處的吸光度值。

1.3.7 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察 將菌液用吸紙緩慢吸出，用PBS 清洗3～5 min，重復(fù)3 次。 加入2.5%戊二醛靜置2 h 固定后，用PBS 反復(fù)清洗3 次。將玻片邊緣水分吸凈，用50 μg/mL 的FITCconA 滴加在玻片上覆蓋， 在4 ℃避光條件下染色30 min。 用PBS 清潔干凈后制成玻片，將玻片置于LeicaTCS SP5 激光共聚焦掃描電鏡中，在488 nm激發(fā)波長條件下形成圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 軟件進行數(shù)據(jù)處理。 對生物被膜使用IBM SPSS Statistics 20 軟件ANOVA 法進行定量、抑制率、清除率、代謝活性、泳動能力等單因素分析。 差異顯著水平P ＜0.05，數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷卻肉中淺黃假單胞菌的鑒定

在前期研究中已證明， 假單胞菌8-4 具有較強生物被膜形成能力[28]。 將該假單胞菌進行16S rDNA 測序， 將測序結(jié)果序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 檢索，經(jīng)比對后從檢索結(jié)果中選取基因序列相似性99%以上的典型菌株， 采取Neighbour-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖1 所示。 從檢索結(jié)果和構(gòu)建的進化樹綜合分析，該假單胞菌與假單胞菌PP103 等假單胞菌屬（Pseudomonas pp.）的菌株親源性較近。為進一步對該菌進行生理生化鑒定，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行分析， 該系統(tǒng)是根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果與庫中標準菌株進行聚類分析， 從而有效反映不同菌株在代謝上的關(guān)系[29]。 經(jīng)系統(tǒng)鑒定分析，判定假單胞菌8-4 為淺黃假單胞菌（結(jié)果如表2 所示）。

表2 冷卻肉中淺黃假單胞菌的碳源代謝指紋圖譜分析Table 2 Analysis of carbon source metabolism fingerprint of Pseudomonas luteus in chilled meat

圖1 假單胞菌8-4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree made by Pseudomonas sp. 8-4 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的抑制作用

圖2 是不同質(zhì)量濃度的6 種植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜測定數(shù)值的影響。 植物提取物質(zhì)量濃度在50～3.13 mg/mL 范圍時， 生物被膜數(shù)值與蒲公英、金銀花提取物質(zhì)量濃度成正相關(guān)。在3.13～0.20 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍為生物被膜數(shù)值最低區(qū)間。 植物提取物質(zhì)量濃度小于0.20 mg/mL 時，生物被膜數(shù)值與蒲公英、金銀花提取物質(zhì)量濃度成負相關(guān)，其余植物提取物則規(guī)律不顯著。綜上， 蒲公英、 金銀花提取物僅在小于等于3.13 mg/mL 時對淺黃假單胞菌生物被膜具有抑制作用，抑制作用隨質(zhì)量濃度降低而減弱。表3 為6 種提取物對淺黃假單胞菌的MIC 測定結(jié)果， 丁香、肉桂、薄荷、桑葉提取物對淺黃假單胞菌不具有抑制作用。 蒲公英提取物對淺黃假單胞菌的MIC 為25 mg/mL， 金銀花提取物對淺黃假單胞菌的MIC為12.5 mg/mL。 蒲公英、 金銀花提取物大于等于MIC 時， 主要通過抑制菌體生長而抑制生物被膜形成。 然而，生物被膜測定結(jié)果表明（圖2），在高于最小抑菌濃度（蒲公英：25 mg/mL、金銀花：12.5 mg/mL）時，提取物對生物被膜反而具有促進作用。這可能是由于在培養(yǎng)過程中植物提取物少量析出，在測定時被固定，被結(jié)晶紫染色，造成測定結(jié)果偏高。

表3 植物提取物對淺黃假單胞菌MIC 的測定結(jié)果Table 3 Determination results of MIC of plant extracts against Pseudomonas luteola

圖2 植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of plant extracts on Pseudomonas luteola biofilm

通過分析植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜抑制率（圖2b）的影響可知，蒲公英和金銀花提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的抑制效果較好。這兩種提取物中的抑菌成分均為綠原酸[30-31]，推測綠原酸對生物被膜具有抑制作用。

2.3 植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的清除作用

圖3 是探究不同質(zhì)量濃度的6 種植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的清除作用。 通過分析植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜清除率的影響（圖3b）可知，蒲公英和金銀花提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的清除率較高。 由此推測這兩種提取物中的綠原酸是通過抑制生物被膜的形成來實現(xiàn)有效清除，而具體過程還需進一步研究。

圖3 植物提取物對淺黃假單胞菌生物被膜的清除作用Fig.3 Scavenging effect of plant extracts on Pseudomonas luteola biofilm

2.4 綠原酸對淺黃假單胞菌生物被膜的抑制和清除作用

圖4 為不同質(zhì)量濃度綠原酸對淺黃假單胞菌生物被膜的抑制作用和清除作用。 綠原酸在低于0.39 mg/mL 時抑制菌體生長的能力逐漸降低，推測因植物提取物中綠原酸含量存在差異， 是造成金銀花提取物和蒲公英提取物對淺黃假單胞菌生物被膜抑制效果不同的主要原因。

圖4 綠原酸對淺黃假單胞菌生物被膜的抑制和清除作用Fig.4 Inhibitory and scavenging effects of chlorogenic acid on Pseudomonas luteola biofilms

2.5 綠原酸對淺黃假單胞菌生物被膜的作用機制

2.5.1 綠原酸對生物被膜活力的影響分析 在淺黃假單胞菌生物被膜形成之前， 使用不同質(zhì)量濃度綠原酸處理淺黃假單胞菌，結(jié)果如圖5 所示。隨著綠原酸質(zhì)量濃度加大， 對生物被膜活力的抑制作用越明顯。 綠原酸的最小抑菌濃度為3.13 mg/mL，且質(zhì)量濃度降低，抑制率明顯降低。 為進一步研究綠原酸對生物被膜的清除作用， 在形成成熟生物被膜之后加入綠原酸， 檢測生物被膜活力的數(shù)值。隨著綠原酸質(zhì)量濃度升高，生物被膜活力明顯降低。當?shù)陀谧钚∫志鷿舛?.13 mg/mL 時，其對生物被膜的清除效果呈現(xiàn)逐漸降低趨勢， 這說明植物提取物對生物被膜代謝活力不具有清除作用， 且對生物被膜的清除機制是通過抑制菌體生長從而清除生物被膜。

圖5 綠原酸對淺黃假單胞菌生物被膜活力的抑制和清除作用Fig.5 Effect of chlorogenic acid on the biofilm activity of Pseudomonas luteol

2.5.2 綠原酸作用下生物被膜表觀呈像分析 熒光染料FITC 標記的ConA 與細菌的胞外多糖特異結(jié)合并發(fā)出綠色熒光， 熒光信號的強弱與多糖黏附量有關(guān)， 多糖黏附量增加， 熒光信號積累增強。 用FITC-ConA 染色生物被膜后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察綠原酸對生物被膜的抑制效果，如圖6 所示。由圖6a 和6b 可知，在高于最小抑菌濃度3.13 mg/mL 條件下，綠原酸通過抑制菌體生長從抑制生物被膜產(chǎn)生， 其胞外多糖和菌體呈散落狀分布。圖6c 和6d 可見熒光信號增強，菌體明顯聚集，生物被膜厚度增加，且周圍布滿孔隙。 在圖6d 中可見少量褶皺，這表明在6.25 mg/mL 已經(jīng)開始呈立體結(jié)構(gòu)。 圖6e 和6f 褶皺、 溝壑明顯增多，生物被膜立體結(jié)構(gòu)呈堆狀連結(jié)。 圖6m 為TSB培養(yǎng)基對照，為多層的成熟生物被膜。綠原酸能夠抑制假單胞菌生物被膜，當高于最小抑菌濃度時，通過初期抑制菌體生長來抑制菌體形成生物被膜；當?shù)陀谧钚∫志鷿舛葧r，通過抑制生物被膜形成立體結(jié)構(gòu)來抑制形成生物被膜。

圖6 綠原酸作用下對淺黃假單胞菌生物被膜的激光共聚焦圖像（20×）Fig.6 Confocal laser imaging of Pseudomonas luteol biofilm under chlorogenic acid（20×）

在培養(yǎng)24 h 的成熟生物被膜中加入不同質(zhì)量濃度綠原酸，隨著綠原酸質(zhì)量濃度的逐漸降低，對生物被膜的清除效果逐漸減弱。 用FITC-ConA染色生物被膜后， 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果對生物被膜的清除效果，見圖6g～m。 隨著綠原酸質(zhì)量濃度降低，生物被膜褶皺明顯增多，生物被膜立體結(jié)構(gòu)增強。 綠原酸對生物被膜的清除作用是通過破壞生物被膜的立體結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本研究證明綠原酸能夠抑制生物被膜的形成，對成熟生物被膜具有清除作用。綠原酸對生物被膜的抑制和清除效果與質(zhì)量濃度有關(guān)。 綠原酸作用下的成熟生物被膜活力與質(zhì)量濃度呈負相關(guān)，這說明綠原酸能夠滲透到生物被膜內(nèi)部，對活菌具有殺滅效果。表觀成像研究結(jié)果表明，綠原酸通過抑制淺黃假單胞菌菌體生長而抑制生物被膜形成。 對成熟生物被膜的作用體現(xiàn)在弱化了生物被膜的緊實結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物被膜斷裂成塊狀，且質(zhì)量濃度越高，這種破壞被膜結(jié)構(gòu)的作用效果越強，推測綠源酸清除生物被膜的機制主要是通過弱化生物被膜分子間作用力， 使生物被膜的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)疏松的孔狀，從而深入到生物被膜內(nèi)部，對菌體活力產(chǎn)生影響。 本研究為植物資源應(yīng)用于肉制品保鮮提供新思路。