菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲氧化脅迫抗性的影響

張 菊， 賈東升， 趙士豪， 謝曉亮， 陳 宏， 李海峰*

（1 河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 石家莊050072 2 河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 石家莊050051 3 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣州510006）

菌菇多糖作為食用菌中扶正固本、 安全無毒的主要天然活性成分， 已被研究證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)[1-3]、抗腫瘤[4-5]、抗疲勞[6-7]、抗衰老[8-9]、降血糖[10-12]等多種生理活性和功能，被廣泛稱為“生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑”。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分病變與體內(nèi)抗氧化能力衰退有關(guān)， 當(dāng)機(jī)體不能及時(shí)清理體內(nèi)過氧化物時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體受損、病變。菌菇多糖的多種生物活性均與其抗氧化性相關(guān)[13-14]，即多糖可以通過緩解衰老、疾病、輻射、 代謝等引起的氧化應(yīng)激達(dá)到治療和預(yù)防腫瘤發(fā)生、免疫力低下等疾病。多糖的抗氧化性被認(rèn)為是其多種生理活性和功能的作用機(jī)理之一[13]。

近年來， 生物活性多糖的研究也正由單獨(dú)應(yīng)用向多糖與多糖間的協(xié)同效應(yīng)研究轉(zhuǎn)變[15-16]。 例如，枸杞多糖、黃芪多糖與紅棗多糖組成的復(fù)合多糖在低劑量時(shí)即可對(duì)細(xì)胞有較好的抗氧化作用，并可抑制四氯化碳造成的小鼠肝臟損傷， 表現(xiàn)出優(yōu)于單一多糖活性的效果[17]。 同樣，我國(guó)食用菌種類繁多，菌菇多糖之間的復(fù)合使用，無疑為菌菇多糖的開發(fā)提供了新的研究方向。

本研究結(jié)合菌菇多糖在抗腫瘤、 代謝及免疫調(diào)節(jié)等方面的應(yīng)用，選取香菇、滑子菇和栗蘑為原料， 以抗氧化活性指標(biāo)為依據(jù)， 采用試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、 關(guān)鍵信號(hào)通路與人類同源的模式生物秀麗線蟲為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過體內(nèi)、體外相結(jié)合的評(píng)價(jià)方法對(duì)菌菇復(fù)合多糖的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合秀麗線蟲體內(nèi)的氧化脅迫抗性檢測(cè)初步探究其活性作用機(jī)制，以期為食用菌資源的利用，菌菇多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模式動(dòng)物與試驗(yàn)材料

野生型秀麗線蟲N2、 轉(zhuǎn)基因線蟲LG345、GR1352 和大腸桿菌（OP50 和NA22），購(gòu)于美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)秀麗線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics center）。 香菇 【Lentinusedodes（Berk.）Sing.】、滑子菇（Pholiota nameko）、栗蘑【Polyporus frondosus （Dicks.） Fr.】，購(gòu)于安國(guó)市藥材市場(chǎng)。

1.2 試劑與儀器

維生素C、DPPH、鄰二氮菲、瓊脂、胰蛋白胨、酵母提取物、 氨芐青霉素、2′-脫氧-5-氟脲苷，美國(guó)Sigma 公司；硫酸亞鐵、雙氧水，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Pierce BCA 蛋白定量分析試劑盒，美國(guó)Thermo 公司；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）檢測(cè)試劑盒，碧云天生物科技有限公司。

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Synergy H1 型），美國(guó)BioTek公司；Image Xpress Micro 高內(nèi)涵成像分析儀，美國(guó)Molecular Devices 公司； 定量PCR 儀， 美國(guó)Bio-Rad 公司； 紫外-可見分光光度計(jì) （SP-756型），上海光譜儀器；研磨機(jī)（JX-24 型），上海凈信公司。

1.3 方法

1.3.1 菌菇多糖的提取 取等量的香菇、 滑子菇和栗蘑的干燥子實(shí)體按質(zhì)量比1∶1∶1 的比例配料，粉碎，稱重，乙醇回流提取2 次，每次2 h。過濾，將濾渣揮干乙醇后，水浴加熱提取2 次，每次2 h，合并水提液并濃縮。 濃縮液按1∶3 的比例加入無水乙醇并攪拌， 沉淀出粗多糖， 用75%乙醇反復(fù)洗滌、沉淀，離心分離沉淀物，采用噴霧干燥法干燥，得到菌菇復(fù)合多糖樣品（FHP）。 取與復(fù)合配料同等質(zhì)量的香菇、 滑子菇和栗蘑的干燥子實(shí)體，粉碎，稱重，按同樣方法制備香菇多糖（XGP）、滑子菇多糖（HZP）和栗蘑多糖（LMP）的單一多糖樣品，備用。其中，用于秀麗線蟲體內(nèi)活性試驗(yàn)的樣品需溶于秀麗線蟲液體培養(yǎng)基中， 配制成5 mg/mL 的多糖樣品母液， 過0.22 μm 無菌微孔濾膜后，備用。

1.3.2 體外自由基清除的測(cè)定 羥自由基（·OH）和1，1-二苯-2-苦肼基（DPPH·）自由基清除試驗(yàn)參照周萍等[13]的方法，以VC 的自由基清除率為陽(yáng)性對(duì)照， 等體積的蒸餾水為對(duì)照組， 平行測(cè)量3次，數(shù)據(jù)以（±s）表示。 將上述復(fù)合及單一多糖樣品（FHP、XGP、HZP、LMP）分別配成1.0 mg/mL 的溶液，用于測(cè)量。

1.3.3 秀麗線蟲食物清除率的測(cè)定 食物清除率試驗(yàn)參考Zhang 等[18]方法。 將同步化的L1 期N2線蟲、 食物大腸桿菌OP50 及樣品溶液一同加入96 孔板中，對(duì)照組以液體培養(yǎng)基代替，每個(gè)樣品質(zhì)量濃度設(shè)置8 個(gè)復(fù)孔。 用普通光學(xué)酶標(biāo)儀檢測(cè)96 孔板每孔的OD570nm值， 作為第1 天的初始值。將線蟲于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第2～7 天每天相同的時(shí)間測(cè)定OD570nm值。

1.3.4 秀麗線蟲百草枯氧化脅迫存活率的測(cè)定秀麗線蟲百草枯氧化脅迫存活率試驗(yàn)參照Wang等[19]的方法。 將同步化的成蟲初期線蟲，2′-脫氧-5-氟脲苷 （終質(zhì)量濃度75 μg/mL）、 氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）、食物NA22（OD570nm≈0.70） 和不同的多糖樣品一同加入96 孔板中，空白對(duì)照組以液體培養(yǎng)基代替，每個(gè)樣品設(shè)10 個(gè)復(fù)孔，20 ℃繼續(xù)孵育48 h 后， 加入10 μL 百草枯溶液（ROS 誘導(dǎo)試劑，終濃度為60 mmol/L），混合均勻后置于20 ℃孵育。 以加入百草枯為第0 小時(shí)，每12 h 統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲的存活狀況，直至其全部死亡。 統(tǒng)計(jì)過程中將身體僵直不動(dòng)及對(duì)輕微震動(dòng)無反應(yīng)的秀麗線蟲判斷為死亡狀態(tài)。

1.3.5 秀麗線蟲體內(nèi)ROS 水平的測(cè)定 線蟲體內(nèi)ROS 水平測(cè)定試驗(yàn)參照Zhang 等[18]的DCFHDA 探針法。按照氧化脅迫存活試驗(yàn)方法準(zhǔn)備秀麗線蟲并給藥處理，不同之處在于將線蟲加入24 孔板中（終體積1 000 μL/孔，500 條線蟲/孔，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔），20 ℃培養(yǎng)2 d 后， 加入10 μL 百草枯溶液（終濃度為10 mmol/L），之后于20 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 d，收集每個(gè)處理組的蟲液，并用液體培養(yǎng)基洗滌3 次以除去樣品、 大腸桿菌和百草枯， 用400 μL PBS 重懸線蟲， 采用研磨機(jī)在4 ℃下研磨勻漿6 min（研磨45 s，間隔15 s），離心（4 ℃，12 000 r/min，10 min），收集上清即酶液。 采用Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒和ROS 檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定酶液的蛋白質(zhì)濃度和ROS 水平。 測(cè)定結(jié)果以每mg 酶液蛋白的ROS 含量表示。

水庫(kù)入庫(kù)前1 km處地勢(shì)平緩，有較厚淤泥層，可修建人工濕地（前置庫(kù)），種植耐水濕陸生植物，耐陰常綠水生植物，并在濕地內(nèi)開挖導(dǎo)流引水溝，凈化水質(zhì)。

1.3.6 秀麗線蟲體內(nèi)MDA 含量的測(cè)定 秀麗線蟲的培養(yǎng)、處理、酶解液的制備及蛋白含量的測(cè)定同ROS 檢測(cè)方法。 MDA 含量測(cè)定采用脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒測(cè)定， 結(jié)果換算為每mg 酶液蛋白的MDA 含量。

1.3.7 抗氧化酶活性的檢測(cè) 秀麗線蟲的培養(yǎng)、處理、酶解液的制備及蛋白含量的測(cè)定同ROS 檢測(cè)方法。SOD、CAT 和GPx 的活力測(cè)定采用總SOD活性檢測(cè)試劑盒、 過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒和總谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒， 結(jié)合全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定，測(cè)定結(jié)果換算為每mg 酶液蛋白的抗氧化酶活力。

1.3.8 轉(zhuǎn)錄因子入核的檢測(cè) 轉(zhuǎn)錄因子SKN-1的入核試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)基因線蟲LG345 進(jìn)行觀察[20]，DAF-16 的入核試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)基因線蟲GR1352 進(jìn)行觀察[21]。 將同步化的L1 期秀麗線蟲置于24 孔板中培養(yǎng)并給予多糖處理，其中LG345 線蟲在20℃下多糖處理24 h， 在線蟲L2 期進(jìn)行觀察；GR1352 線蟲在20 ℃下多糖處理48 h，在L3 期進(jìn)行觀察。 收集指定時(shí)間線蟲，M9 緩沖液洗去殘留細(xì)菌，重懸于50 μL M9 緩沖液中，取約20 μL 蟲液轉(zhuǎn)移至新的24 孔板的正中央，加蓋14 mm 圓形蓋玻片，用Image Xpress Micro 設(shè)備拍照。 收集線蟲熒光圖片， 統(tǒng)計(jì)SKN-1 和DAF-16 的入核情況。 每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)挑選50 條線蟲進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算發(fā)生入核轉(zhuǎn)移的線蟲比例。 判斷轉(zhuǎn)錄因子入核的標(biāo)準(zhǔn)：GFP 在線蟲腸道或者體細(xì)胞中形成分散的、聚集樣熒光斑塊。

1.3.9 RNA 提取及定量PCR 檢測(cè) 將同步化的L1 期N2 線蟲、大腸桿菌NA22（OD570nm≈0.70）及多糖樣品溶液（終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL）一同加入24 孔板中 （終體積1 000 μL/孔，500 條線蟲/孔，設(shè)4 個(gè)復(fù)孔），對(duì)照組以液體培養(yǎng)基代替樣品。20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集各組線蟲約2 000 條。采用Trizol 法提取線蟲總RNA，Primer 5 設(shè)計(jì)相關(guān)基因引物。 SYBR Green 為DNA 熒光染料，以Real-Time PCR 的2-△△CT值表示相關(guān)基因在秀麗線蟲體內(nèi)的mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.10 壽命試驗(yàn) 秀麗線蟲壽命試驗(yàn)參考Zhang等[22]的方法。 將同步化的成蟲初期線蟲（10～15 條/孔），2′-脫氧-5-氟脲苷（終質(zhì)量濃度75 μg/mL）、氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）、食物NA22（OD570nm≈0.70） 和不同質(zhì)量濃度樣品一同加入96孔板中（終體積100 μL/孔），空白對(duì)照組以液體培養(yǎng)基代替樣品，做液體壽命試驗(yàn)。每個(gè)樣品質(zhì)量濃度設(shè)置10 個(gè)復(fù)孔， 以開始給藥為第0 天， 在20℃、120 r/min 條件下培養(yǎng)，每隔2 d 統(tǒng)計(jì)1 次秀麗線蟲的存活狀況，直至全部死亡。統(tǒng)計(jì)過程中將身體僵直不動(dòng)并對(duì)輕微震動(dòng)無反應(yīng)的秀麗線蟲判斷為死亡。

1.3.11 脂褐素水平的測(cè)定 脂褐素水平檢測(cè)參照Gerstbrein 等[23]的方法。按照壽命試驗(yàn)方法準(zhǔn)備秀麗線蟲，加入黑色96 孔板中，每個(gè)濃度設(shè)10 個(gè)復(fù)孔，20 ℃下培養(yǎng)24 h，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定脂褐素相對(duì)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm，記為第1 天。 每隔2 d 測(cè)定1 次，連續(xù)測(cè)定3 次。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。 存活曲線以重復(fù)試驗(yàn)中最具代表性的試驗(yàn)結(jié)果表示， 其統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 的時(shí)序檢測(cè)（Mantel-Cox test）方法。 與對(duì)照組相比，P＜0.05 被認(rèn)為具有顯著性差異。食物清除率試驗(yàn)以10 個(gè)復(fù)孔檢測(cè)值的（±s）表示。 其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±SEM）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graph-Pad Prism 5 的one-way ANOVA 分析和鄧尼特多重比較檢驗(yàn) （Dunnett's multiple comparisons test）比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的差異性。 與對(duì)照組相比，P＜0.05 被認(rèn)為具有顯著性差異（*P＜0.05；**P＜0.01）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 菌菇多糖的體外自由基清除率

為了確定菌菇復(fù)合多糖是否具有比單一多糖更優(yōu)的體外抗氧化效果， 首先檢測(cè)XGP、HZP、LMP 和FHP 的體外·OH 和DPPH·的自由基清除效率，結(jié)果見表2。 與對(duì)照組比較，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的XGP、HZP、LMP 和FHP 對(duì)·OH 和DPPH·均表現(xiàn)出明顯的清除活性。相同條件下，菌菇復(fù)合多糖的體外自由基清除能力均大于單一菌菇多糖，表現(xiàn)出更好的體外抗氧化效果。

表2 菌菇多糖的自由基清除能力（±s， n=3）Table 2 Free radical scavenging ability of mushroom polysaccharide（±s， n=3）

表2 菌菇多糖的自由基清除能力（±s， n=3）Table 2 Free radical scavenging ability of mushroom polysaccharide（±s， n=3）

組別 質(zhì)量濃度/mg·mL-1·OH 自由基清除率/%DPPH·自由基清除率/%陽(yáng)性對(duì)照（VC）0.03 49.3±0.8 57.5±0.6香菇多糖（XGP）1.0 65.5±0.8 71.3±1.1滑子菇多糖（HZP）1.0 46.8±0.7 55.3±0.9栗蘑多糖（LMP）1.0 61.7±1.0 70.7±1.1復(fù)合多糖（FHP）1.0 70.7±0.7 82.3±1.0

2.2 菌菇多糖對(duì)秀麗線蟲氧化脅迫存活率的影響

在體外檢測(cè)基礎(chǔ)上， 通過模式生物秀麗線蟲的氧化脅迫存活率試驗(yàn)研究菌菇多糖的體內(nèi)抗氧化活性。 首先通過N2 線蟲的食物清除率試驗(yàn)，摸索菌菇多糖合適且不影響線蟲正常生長(zhǎng)的體內(nèi)質(zhì)量濃度。 其結(jié)果如圖1a 所示。 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)板中OP50 的含量呈降低趨勢(shì)。 與空白對(duì)照組曲線相比，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL 下，不論是單一組分多糖還是復(fù)合多糖對(duì)N2 線蟲的食物清除速率均未產(chǎn)生明顯影響， 曲線變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致。 質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL 和2.0 mg/mL時(shí)，曲線變化趨勢(shì)與對(duì)照組相比，均出現(xiàn)減緩或加速變化趨勢(shì)， 說明較高的多糖質(zhì)量濃度對(duì)秀麗線蟲正常生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生一定影響。 體內(nèi)抗氧化活性試驗(yàn)中各多糖處理組均采用≤0.5 mg/mL 的質(zhì)量濃度。之后，檢測(cè)了菌菇多糖對(duì)N2 線蟲抵抗百草枯氧化脅迫能力的影響。 結(jié)果如圖1b 所示。 當(dāng)隨機(jī)選擇質(zhì)量濃度0.3 mg/mL 時(shí)，不論是單一多糖組分XGP、HZP、LMP，還是復(fù)合多糖FHP，均表現(xiàn)出對(duì)秀麗線蟲氧化脅迫存活時(shí)間的延長(zhǎng)作用。 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)HP 處理組的延長(zhǎng)效果最顯著，其不僅延長(zhǎng)N2 線蟲在百草枯脅迫下的中位存活時(shí)間，而且延長(zhǎng)了線蟲的平均存活時(shí)間和最大存活時(shí)間。該結(jié)果表明，菌菇復(fù)合多糖的體內(nèi)抗氧化效果同樣優(yōu)于單一多糖。進(jìn)一步的研究表明，F(xiàn)HP 對(duì)秀麗線蟲的體內(nèi)抗氧化效果與質(zhì)量濃度存在負(fù)相關(guān)性，結(jié)果如圖1c 所示，質(zhì)量濃度越低，對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)的氧化脅迫抗性越明顯。

圖1 菌菇多糖對(duì)N2 線蟲的體內(nèi)抗氧化活性的影響Fig.1 Effects of mushroom polysaccharides on antioxidant activity of N2 nematodes in vivo

2.3 菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)氧化脅迫水平的影響

在確定復(fù)合多糖FHP 較單一組成多糖更好的抗氧化效果后，就FHP 對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)氧化脅迫抗性機(jī)制進(jìn)行探討。 線蟲氧化脅迫存活率試驗(yàn)中，造模試劑百草枯是公認(rèn)的ROS 誘導(dǎo)劑。 為了驗(yàn)證FHP 增加線蟲氧化脅迫存活率的抗氧化效果是否與其體內(nèi)自由基清除相關(guān)，檢測(cè)FHP 對(duì)百草枯脅迫下秀麗線蟲體內(nèi)ROS 水平，ROS 介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 含量的影響。 其中，線蟲體內(nèi)ROS 水平檢測(cè)采用DCFH-DA 探針法， 通過探針在體內(nèi)與ROS 反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度間接反映體內(nèi)ROS 的水平。結(jié)果如圖2a 所示。隨著檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，探針檢測(cè)到的ROS 含量增多。 與對(duì)照組相比，F(xiàn)HP 處理組能顯著降低線蟲體內(nèi)ROS 水平， 其中0.1 mg/mL FHP 處理組的效果最顯著。ROS 介導(dǎo)的細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 含量檢測(cè)結(jié)果（圖2b）也表明，與對(duì)照組相比，F(xiàn)HP 處理可有效降低脅迫條件下N2 線蟲體內(nèi)的MDA 水平。其中，低質(zhì)量濃度（0.1 mg/mL 和0.3 mg/mL）FHP處理組的效果最明顯。以上結(jié)果表明，菌菇復(fù)合多糖的抗氧化活性應(yīng)與其降低脅迫條件下線蟲體內(nèi)ROS 水平和MDA 含量， 抑制線蟲體內(nèi)氧化脅迫水平相關(guān)，而這一活性與質(zhì)量濃度存在相關(guān)性。

圖2 菌菇復(fù)合多糖對(duì)脅迫條件下N2 線蟲體內(nèi)氧化脅迫水平的影響Fig.2 Effects of FHP on the oxidative stress levels in N2 nematodes under stress

2.4 菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲脅迫響應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子活性的影響

研究表明，胰島素信號(hào)通路（IIS）中與脅迫應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SKN-1/Nrf2 和DAF-16/FOXO 被證實(shí)可以對(duì)氧化脅迫信號(hào)分子ROS作出響應(yīng)并激活下游的抗氧化酶基因， 增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[24]。 為了驗(yàn)證菌菇復(fù)合多糖的抗氧化活性是否與上述應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制相關(guān)， 檢測(cè)FHP對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SKN-1 和DAF-16 活性的影響。

轉(zhuǎn)錄因子的入核轉(zhuǎn)移是其被激活的前提。 在試驗(yàn)過程中， 選用與SKN-1 和DAF-16 共表達(dá)GFP 融合蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲LG345 和GR1352，檢測(cè)FHP 對(duì)SKN-1 和DAF-16 的入核轉(zhuǎn)移的影響。 正常情況下，與SKN-1 共表達(dá)的GFP 聚集在ASI 神經(jīng)元的細(xì)胞核， 同時(shí)以彌散的小點(diǎn)狀分散在腸道細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中 （圖3a，LG345-對(duì)照）；與DAF-16 共表達(dá)的GFP 則分布在線蟲多個(gè)部位的細(xì)胞質(zhì)中，線蟲表現(xiàn)為通體熒光（圖3a，GR1352-對(duì)照）。 當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子被激活時(shí)，GFP 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移并聚集到細(xì)胞核內(nèi)， 形成分散的、 熒光聚集斑塊（圖3a，以熱激處理為陽(yáng)性對(duì)照）。 通過熒光聚集斑點(diǎn)的有、無可以間接判定轉(zhuǎn)錄因子的激活情況。以被檢測(cè)的線蟲體內(nèi)出現(xiàn)熒光聚集斑塊的線蟲比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖3b 所示。 與各組的空白對(duì)照相比，F(xiàn)HP 處理組顯著增加了轉(zhuǎn)錄因子SKN-1入核的線蟲比例， 而對(duì)DAF-16 入核轉(zhuǎn)移線蟲的比例雖有增加趨勢(shì)，但差異不顯著。 該結(jié)果表明，F(xiàn)HP 處理有效激活了線蟲體內(nèi)脅迫應(yīng)激關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SKN-1 的活性， 而DAF-16 的活性仍需驗(yàn)證。

圖3 菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲脅迫響應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子活性的影響Fig.3 Effects of FHP on the activities of key transcription factors in response to stress in Caenorhabditis elegans

2.5 菌菇復(fù)合多糖對(duì)SKN-1 和DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子靶基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證FHP 對(duì)SKN-1 和DAF-16的激活情況，探究FHP 對(duì)IIS 信號(hào)通路的影響。 選擇野生型秀麗線蟲N2， 提取總RNA。 采用qRTPCR 法分別檢測(cè)FHP 對(duì)SKN-1 下游靶基因gcs-1（γ 谷酰基半胱氨酸合成酶），gst-4（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶），gst-10（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）和DAF-16 下游靶基因sod-3（超氧化物歧化酶），gsh-px（谷胱甘肽過氧化物酶），ctl-1（過氧化氫酶酶）的mRNA 表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖4 所示。 與對(duì)照組相比，F(xiàn)HP處理后，N2 線蟲體內(nèi)SKN-1 和DAF-16 的下游靶基因gcs-1、gst-4 和sod-3、gsh-px 的轉(zhuǎn)錄水平均有顯著增加。 該結(jié)果驗(yàn)證了FHP 對(duì)SKN-1 和DAF-16 的激活活性，表明FHP 可有效調(diào)控IIS 信號(hào)通路下游脅迫響應(yīng)效應(yīng)基因的表達(dá)。

圖4 菌菇復(fù)合多糖對(duì)N2 線蟲脅迫響應(yīng)效應(yīng)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of FHP on expression of stress responsive genes in N2 nematodes

2.6 菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶是細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵物質(zhì)，增強(qiáng)抗氧化酶活力有助于清除過量ROS 和緩解氧化脅迫。 為進(jìn)一步驗(yàn)證FHP 通過調(diào)控IIS 信號(hào)通路增強(qiáng)秀麗線蟲氧化脅迫抗性的作用機(jī)制，測(cè)定FHP 對(duì)秀麗線蟲體內(nèi)SOD、CAT 和GPx 活性的影響，結(jié)果如圖5 所示。 與對(duì)照組相比，F(xiàn)HP 處理組可顯著提高SOD 和GPx 的酶活力 （圖5a、5c），尤其在低質(zhì)量濃度處理組（0.1，0.3 mg/mL）效果最明顯。 而對(duì)CAT 的酶活力無顯著影響。 該結(jié)果表明，F(xiàn)HP 的自由基清除活性應(yīng)主要與其提升線蟲體內(nèi)SOD 和GPx 的活性相關(guān)， 而與CAT 的關(guān)系不大。該結(jié)果與FHP 對(duì)SKN-1 和DAF-16 下游效應(yīng)基因的影響相一致， 即雖然在入核轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中DAF-16 的入核激活并不顯著，但是FHP 的抗氧化效果仍與DAF-16 的激活及其下游效應(yīng)體相關(guān)。

圖5 菌菇復(fù)合多糖對(duì)脅迫條件下N2 線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of FHP on the activity of antioxidant enzymes in N2 nematodes under stress

2.7 菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲衰老的影響

根據(jù)衰老的自由基學(xué)說， 衰老的產(chǎn)生與體內(nèi)過量自由基的生成及由此產(chǎn)生的氧化脅迫環(huán)境直接相關(guān)。 在確定菌菇復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲良好的自由基清除及氧化脅迫抗性的生物活性基礎(chǔ)上，研究了菌菇復(fù)合多糖的抗衰老活性。 首先觀察了FHP 對(duì)N2 線蟲生存曲線的影響， 結(jié)果如圖6a 所示。與對(duì)照組相比，F(xiàn)HP 處理組線蟲的生存曲線沒有明顯差異， 即便是抗氧化效果最好的質(zhì)量濃度組（0.1 mg/mL 的FHP 處理組）也并未延長(zhǎng)秀麗線蟲的壽命。

與此同時(shí)， 檢測(cè)了FHP 對(duì)N2 線蟲體內(nèi)可間接反映衰老進(jìn)程的脂褐素積累水平的影響。 根據(jù)脂褐素的光學(xué)性質(zhì)， 結(jié)合秀麗線蟲通體透明的特點(diǎn)， 采用熒光酶標(biāo)儀法定量分析線蟲體內(nèi)的脂褐素，結(jié)果如圖6b 所示。與對(duì)照組相比，F(xiàn)HP 的處理未顯著影響線蟲體內(nèi)脂褐素的積累水平， 即FHP未延緩N2 線蟲的衰老進(jìn)程。 綜上，菌菇復(fù)合多糖雖具有較好的抗氧化效果， 但未表現(xiàn)出延緩秀麗線蟲衰老的抗衰老活性。

圖6 菌菇復(fù)合多糖對(duì)N2 線蟲衰老的影響Fig.6 Effects of FHP on the senescence of N2 nematodes

3 討論與結(jié)論

近年來，復(fù)合多糖的研究表明，不同的生物活性多糖之間的協(xié)同效應(yīng)往往會(huì)獲得優(yōu)于單一多糖的活性效果[16，25]。 菌菇多糖作為“生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑”，目前的應(yīng)用更多偏向于單一應(yīng)用。 探究菌菇復(fù)合多糖的生物活性及機(jī)制有利于菌菇多糖的高效利用及開發(fā)。

本研究結(jié)果表明：由香菇多糖、滑子菇多糖和栗蘑多糖組成的菌菇復(fù)合多糖（FHP）較單一組成多糖具有更好的體外自由基清除效率和延長(zhǎng)秀麗線蟲氧化脅迫存活率的協(xié)同抗氧化效果。 其增強(qiáng)秀麗線蟲體內(nèi)氧化脅迫抗性的作用機(jī)制與其降低線蟲體內(nèi)ROS 水平及MDA 含量等氧化脅迫水平， 激活脅迫應(yīng)激關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SKN-1 和DAF-16 的活性及其下游效應(yīng)基因表達(dá)和增強(qiáng)抗氧化酶活性相關(guān)。 FHP 的抗氧化效果與質(zhì)量濃度存在負(fù)相關(guān)性，即在較低質(zhì)量濃度處理時(shí)，F(xiàn)HP 的抗氧化效果好。 推測(cè)可能與粗多糖沒有進(jìn)一步純化以及多糖質(zhì)量濃度過高影響細(xì)胞滲透壓相關(guān)。 以后還需對(duì)復(fù)合多糖的純化做進(jìn)一步研究。此外，研究結(jié)果還表明， 雖然FHP 具有較好的抗氧化活性，但是其對(duì)秀麗線蟲的衰老并無明顯影響， 這可能與其對(duì)胰島素信號(hào)通路中與衰老相關(guān)的DAF-16的調(diào)控力度不夠有關(guān)，后期需繼續(xù)探索。此結(jié)果與竹蓀多糖[18]和淫羊藿多糖[26]的研究結(jié)果相一致，即雖然具有良好的體內(nèi)抗氧化及自由基清除活性，但是竹蓀多糖和淫羊藿多糖同樣不能延緩秀麗線蟲的衰老，未表現(xiàn)出抗衰老活性。 同樣，生育酚[27]雖具有強(qiáng)大的抗氧化能力， 但其對(duì)模式生物壽命的影響不明顯。 這表明壽命調(diào)節(jié)和應(yīng)激響應(yīng)存在更復(fù)雜的機(jī)制。

綜上所述，菌菇復(fù)合多糖FHP 具有良好的協(xié)同增效的體內(nèi)外抗氧化活性， 不具備明顯的抗衰老活性。 其增強(qiáng)秀麗線蟲氧化脅迫抗性的作用機(jī)制與其激活脅迫應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子SKN-1 和DAF-16，影響其下游效應(yīng)體活性有關(guān)。研究結(jié)果為菌菇多糖的高效利用及復(fù)合多糖的深入開發(fā)提供了理論依據(jù)。