超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度評定

◎ 朱飛如，馮俊富，余開科，麥運(yùn)佳，李 峰

(北海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 北海 536000)

金剛烷胺又名三環(huán)癸胺、金剛胺，屬于三環(huán)胺類藥物，1960年首次人工合成[1]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，金剛烷胺這種藥物，最開始被用于抑制流感病毒，在1966年被國際上批準(zhǔn)為預(yù)防藥，1976年在預(yù)防藥的基礎(chǔ)上又確認(rèn)為治療藥[2-3]。在畜牧養(yǎng)殖方面，金剛烷胺主要用在治療和預(yù)防禽類流感，其容易引起副作用主要在兩方面，一是精神異常，二是日益增加的耐藥性，危害著消費(fèi)者的身體健康，同時(shí)也對畜禽產(chǎn)品的安全監(jiān)管帶來極大挑戰(zhàn)。我國農(nóng)業(yè)部2017年印發(fā)獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃的通知中，第一個(gè)監(jiān)控項(xiàng)目是金剛烷胺，由此看出控制金剛烷胺的重要性[4]。金剛烷胺抗病毒獸藥使用，給消費(fèi)者身體帶來極大的危害。2005年10月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號公告，禁止金剛烷胺等抗病毒獸藥的生產(chǎn)和使用[5]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的測定金剛烷胺方法主要包括毛細(xì)管氣相色譜法[6]、高效液相色譜-熒光檢測法[7]和液質(zhì)聯(lián)用法[8]等。隨著檢測要求的提高，數(shù)據(jù)要求更加精準(zhǔn)，以便加強(qiáng)監(jiān)管，實(shí)驗(yàn)室控制數(shù)據(jù)質(zhì)量的一個(gè)重要步驟是測量不確定度，它不單在科學(xué)上有著重要意義，在現(xiàn)實(shí)上也有重要意義[9]。在許多在儀器操作方面都有廣泛的應(yīng)用，如理化實(shí)驗(yàn)、儀器操作等[10-16]。本研究根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[17]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[18]，對國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品中金剛烷胺殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[19]中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法檢測雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度進(jìn)行評定，建立了雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度評定方法，推斷出測量不確定度結(jié)果的主要來源和影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度的主要因素，為加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供更加科學(xué)、可信和準(zhǔn)確的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

金剛烷胺（99.05%，Stanford Chemicals）；D15-金剛烷胺（99.20%，Stanford Chemicals）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；正己烷（色譜純，美國Merck公司）；冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（優(yōu)級純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1290/6460 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；XA205DU電子天平（MAX 81g/220 g，d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；本實(shí)驗(yàn)使用玻璃量器均是A級。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流速：0.3 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇；梯度洗脫：0～1.5 min，維持10% B；1.5～2 min，10% B線性變化至90% B；2～5 min，維持90% B；5～5.1 min，90% B線性變化至10% B；5.1～10 min，維持10% B。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧（ESI），正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）；監(jiān)測離子見表1。

表1 被測物的母離子和子離子參數(shù)表

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品金剛烷胺0.010 20 g于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：精密量取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液A：精密量取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液B：精密量取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液A 1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液C：精密量取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液B 2 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品0.000 90 g于1 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：精密量取D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

分別加入金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液C 50 μL、100 μL，金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液B 50 μL、100 μL，金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液A 50 μL、100 μL，分別加入D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，分別加入空白基質(zhì)溶液350 μL、300 μL、350 μL、300 μL、350 μL 和300 μL，配制成標(biāo)曲 1 ～ 6 濃度分別為 2.02 μg·L-1、4.04 μg·L-1、10.10 μg·L-1、20.21 μg·L-1、101.03 μg·L-1和 202.06 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.4 樣品的處理

稱取試料2 g，于50 mL離心管中，加D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μL，加1%乙酸乙腈溶液10 mL，漩渦2 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1），上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，加無水硫酸鈉3 g、正己烷10 mL，渦旋1 min，3 000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉(zhuǎn)至100 mL雞心瓶中，40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸干，用1.0 mL甲醇溶解殘?jiān)?。加入PSA 50 mg，渦旋30 s，取上清液過濾膜至1.5 mL試管中。量取濾液0.5 mL于離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?0%乙腈水溶液0.5 mL，渦旋 30 s，10 000 r·min-1離心 5 min，取上清液供上機(jī)測定。

1.2.5 空白溶液的制備

除未加樣品外，其他操作參照“1.2.4”，制備空白溶液。

2 數(shù)學(xué)模型

雞肉中金剛烷胺殘留量的數(shù)學(xué)模型為：

式中：X-樣品中金剛烷胺殘留量，μg·kg-1；C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到金剛烷胺的質(zhì)量濃度，μg·L-1；V-溶解殘?jiān)募状俭w積，mL；m-樣品的質(zhì)量，g。

3 不確定度來源分析

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析可知，影響雞肉中金剛烷胺殘留量的不確定度因素主要有：稱量樣品引入的不確定度urel(m)；溶解殘?jiān)募状俭w積引入的不確定度urel(v)；配置標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(C)；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(I)；重復(fù)測量樣品的不確定度urel(x)。

4 不確定度的評估

4.1 稱量樣品引入的不確定度urel(m)

使用萬分之一電子天平，稱取2.000 0 g試樣，查閱其檢定證書可知，當(dāng)稱樣范圍在0～50 g時(shí)，其最大允許誤差為±0.000 5 g，按均勻分布則稱量樣品引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則稱量樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 溶解殘?jiān)募状俭w積引入的不確定度urel(v)

4.2.1 移液器體積校準(zhǔn)引入的不確定度u1(v)和u2(v)

溶解殘?jiān)募状俭w積為1 mL，根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[20]，用1 mL移液器移取1 mL的容量允差為±1.0%，測量重復(fù)性為0.5%，按均勻分布則移液器體積校準(zhǔn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2.2 溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3(v)

實(shí)驗(yàn)室保持溫度范圍在（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)是1.19×10-3/℃，其按均勻分布則溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

則溶解殘?jiān)募状俭w積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度urel(C)

4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel(C1)

查閱證書可知，標(biāo)準(zhǔn)品金剛烷胺含量為99.05%，不確定度為±1.0%；D15-金剛烷胺含量為99.20%，不確定度為±1.0%；當(dāng)樣品待測液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中內(nèi)標(biāo)物含量一致時(shí)，儲備液配制、中間液配制、工作液配制和內(nèi)標(biāo)物的純度等均不對樣品中的目標(biāo)物含量帶來影響，故本文僅評估內(nèi)標(biāo)物加入體積引入的不確定度[21]。

則金剛烷胺引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度urel(C2)

使用十萬分之一電子天平，稱取標(biāo)準(zhǔn)品金剛烷胺0.010 20 g，根據(jù)檢定證書當(dāng)稱樣范圍在0～5 g時(shí)，其最大允許誤差為±0.000 05 g，按均勻分布（則金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制引入的不確定度urel(C3)

標(biāo)準(zhǔn)儲備液是將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中。

（1）玻璃量器體積校準(zhǔn)引入的不確定度u1(C3)。查閱JJG 196—2006[22]可知，10 mL A級標(biāo)準(zhǔn)的容量瓶，容量允差為±0.020 mL，按均勻分布則玻璃量器體積校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(C3)。實(shí)驗(yàn)室保持溫度范圍（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)是1.19×10-3/℃，其按均勻分布則溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制引入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3.4 標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制引入的不確定度urel(C4)

標(biāo)準(zhǔn)中間液是標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中；標(biāo)準(zhǔn)工作液A是取標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中；標(biāo)準(zhǔn)工作液B是取標(biāo)準(zhǔn)工作液A 1 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中；標(biāo)準(zhǔn)工作液C是取標(biāo)準(zhǔn)工作液B 2 mL用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中。

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[22]，配置標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制引入的不確定度urel(C4)為0.012 5。

表2 標(biāo)準(zhǔn)中間液和標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

4.3.5 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程引入的不確定度urel(C5)

由“1.2.3”標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制可知，50 μL使用了3次，100 μL使用了9次，水的體積膨脹系數(shù)：2.1×10-4/℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)：1.37×10-3/℃，則50%乙腈水的平均體積膨脹系數(shù)為3.95×10-4/℃，根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[20]，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3，由表3可知，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線過程引入的不確定度urel(C5)為0.051 4。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

綜上所述，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(C)為

=0.053 4。

4.4 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(I)

取標(biāo)曲1～6系列濃度各測定2次，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，做線性擬合而成的線性回歸方程：I=bc+a（b為斜率，a為截距），測定數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

標(biāo)準(zhǔn)曲線變動性的標(biāo)準(zhǔn)差為：

式中：SR表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；n表示標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)點(diǎn)測量次數(shù)；Ii表示測定的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值；b表示校準(zhǔn)曲線的斜率；ci表示標(biāo)準(zhǔn)溶液含量，μg·L-1，a表示校準(zhǔn)曲線的截距。

用該曲線對樣液重復(fù)測定6次，樣液中含量平均值為82.03 μg·L-1，曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：SR表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；n表示標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)點(diǎn)測量次數(shù)；p表示被測樣品測定次數(shù)；b表示校準(zhǔn)曲線的斜率；表示樣液中含量平均值，mg·L-1；ci表示標(biāo)準(zhǔn)溶液含量，mg·L-1；

則曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.5 樣品重復(fù)測量的不確定度urel(x)

對樣品重復(fù)測定6次的結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果表

用貝塞爾公式計(jì)算樣品重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

式中：s表示標(biāo)準(zhǔn)偏差；n表示測量次數(shù)；xi表示樣品的測定值，單位μg·kg-1；X—表示n次測定的算術(shù)平均值，單位 μg·kg-1。

樣品重復(fù)測定平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品重復(fù)測定平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel

雞肉中金剛烷胺殘留量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總見表6。

表6 金剛烷胺殘留量不確定度分量總結(jié)表

則其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.7 擴(kuò)展不確定度的評定

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u=urel×x—=0.055 5×41.013=2.28 μg·kg-1，取擴(kuò)展因子k=2（95% 置信率），則擴(kuò)展不確定度：U=2u=2×2.28=4.56 μg·kg-1。金剛烷胺殘留量的測定結(jié)果為：X=（41.01±4.56）μg·kg-1（k=2）。

5 結(jié)論

通過不確定度的分析可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合是測量雞肉中金剛烷胺殘留量不確定度的主要來源。對此，要注意實(shí)驗(yàn)過程中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，這兩個(gè)因素影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。使用精確度更高，經(jīng)過嚴(yán)格檢定的玻璃量器，或增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定次數(shù)，嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作各個(gè)步驟，配制濃度范圍符合檢測項(xiàng)目實(shí)測值的標(biāo)準(zhǔn)曲線等，可大大降低測定結(jié)果的不確定度，多舉措、多方位提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。