外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆氮代謝及產(chǎn)量的影響

曹亮，張玉先，金喜軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

大豆是我國重要的油料作物之一，富含大量的蛋白質(zhì)、油脂以及豐富的次生代謝產(chǎn)物，被人類廣泛用于食品加工、生物飼料等方面。氮代謝是作物體內(nèi)最基礎(chǔ)的生理過程之一，其在作物生長發(fā)育期間的變化直接影響植株礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收及蛋白質(zhì)的合成[1]。氮代謝能夠否正常運(yùn)轉(zhuǎn)與作物產(chǎn)量呈正相關(guān)，作物氮代謝機(jī)制主要通過NR、GS、GOGAT等關(guān)鍵酶進(jìn)行催化調(diào)節(jié)[2]。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致土壤耕層水分長期虧缺，可供給作物吸收的有效水分大量減少，作物無法吸收到足夠維持其正常生長發(fā)育的水分，致使其正常的生理活動(dòng)受到干擾，進(jìn)而導(dǎo)致作物體內(nèi)蛋白質(zhì)降解，氨基酸含量發(fā)生改變，硝酸還原酶活性降低，氮代謝過程受到干擾，作物養(yǎng)分吸收受阻，致使作物根系生長受到抑制。氮代謝關(guān)鍵酶活性降低會(huì)阻礙作物吸收氮素，同時(shí)還會(huì)對(duì)同化產(chǎn)物的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致產(chǎn)量降低[3]。

褪黑素（Melatonin）又名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，屬吲哚類激素，作為近年來新興的植物生長調(diào)節(jié)劑一直被用于植物逆境調(diào)節(jié)等方面，同時(shí)它還廣泛地存在于植物體中[4-5]。上世紀(jì)，已被證實(shí)褪黑素是一類激素物質(zhì)，參與動(dòng)物的生長發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，后有學(xué)者從藻類中分離并鑒定出了褪黑素，證明了植物體中也存在該物質(zhì)，隨著科研人員的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，并緩解逆境脅迫對(duì)植物造成的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可有效增加側(cè)根和不定根的再次生長，同時(shí)它還可以提高植物的抗逆性，增強(qiáng)氮代謝進(jìn)程[6]。研究表明，外源褪黑素可提升NaHCO3脅迫下下黃瓜幼苗葉片的氮代謝水平，有助于黃瓜幼苗有效抵抗逆境脅迫[7]。低溫條件下褪黑素顯著增強(qiáng)甜瓜氮代謝酶的活性，穩(wěn)定葉片因逆境脅迫造成銨態(tài)氮增加的現(xiàn)象，進(jìn)而提高植物對(duì)逆境條件下的適應(yīng)性[8]。

大豆是固氮作物，對(duì)氮代謝有較高的要求，而外源褪黑素對(duì)干旱條件下大豆各器官氮代謝相關(guān)的研究鮮有報(bào)道。因此，研究以大豆品種“綏農(nóng)26”為供試品種，探討干旱條件下外源褪黑素對(duì)大豆氮代謝的調(diào)控效應(yīng)以及對(duì)產(chǎn)量損失緩解程度，為未來逆境下使用化控手段提高大豆抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于2018—2019年在大慶市國家雜糧工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試大豆品種為綏農(nóng)26，盆栽用桶直徑30.0 cm，高33.0 cm，所有盆栽均放置在遮雨棚中。大豆種子采用75%的酒精處理后，用無菌水洗凈后播種。每盆播種6粒，VC期定苗，保留長勢(shì)一致的3株幼苗。采用稱重法控制土壤含水量為田間持水量的80%。鼓粒始期記為第1 d，正常供水處理仍保持土壤含水量為田間持水量的80%，干旱處理通過停止供水逐步使土壤含水量達(dá)到田間持水量的50%，并維持此含水量至處理結(jié)束，凋萎含水量為田間持水量的40%。每個(gè)處理30盆，具體處理設(shè)置如下：

正常處理（CK），維持盆栽中土壤含水量為田間持水量的80%；

干旱處理（D），停止供水，并每天稱重，于第10天達(dá)到田間持水量的50%，而后補(bǔ)水以保持當(dāng)前含水量，至第28天恢復(fù)至田間持水量的80%，直至收獲；

干旱噴施褪黑素處理（D+M），在干旱處理的基礎(chǔ)上，在第11、12、13天夜晚21點(diǎn)噴施濃度為10 0μmol·L-1褪黑素。

取樣時(shí)間為鼓粒初期后的第18、23、28天取樣（褪黑素處理后5、10、15 d），其中硝酸還原酶活性取樣后立即進(jìn)行測(cè)定，其他酶活性等生理指標(biāo)的樣品用液氮冷凍并快速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待分析用，用于干物質(zhì)積累測(cè)定的樣品經(jīng)105℃殺青后在80℃下烘干至恒重，稱量干重后粉碎待分析用。

1.2 氮代謝生理指標(biāo)的測(cè)定

硝酸還原酶（NR）測(cè)定參照徐龍光[9]方法測(cè)定。谷氨酰胺合成酶（Gs）參照王小純等[10]方法測(cè)定。谷氨酸合成酶（GOGAT）參照陳繼康等[11]方法測(cè)定。谷氨酸脫氫酶（GDH）參照現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南測(cè)定[12]。銨態(tài)氮含量根據(jù)Oliveira H C等[13]方法測(cè)定。硝態(tài)氮根據(jù)Reguera等[14]方法測(cè)定。酰脲含量參照劉承憲等[15]方法測(cè)定。

氮素積累量=干物質(zhì)積累量×氮素含量

1.3 產(chǎn)量的測(cè)定

待植株成長至成熟期時(shí)，選取長勢(shì)相同且具備代表性的15株測(cè)產(chǎn)，盆栽試驗(yàn)以單株粒重表示產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由表1所示，谷氨酸脫氫酶在干旱后第5、10、15天整體呈先上升后下降的趨勢(shì)。與CK處理相比D處理谷氨酸脫氫酶活性顯著下降，降幅為30.22%、20.44%和26.05%。同時(shí)D+M處理相較D處理顯著提升了12.78%、8.95%和14.68%。而谷氨酸合成酶與硝酸還原酶活性則伴隨著干旱時(shí)間的延長整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，D處理的谷氨酸合成酶與硝酸還原酶活性在第10天相較于第5天降低了14.20%、10.67%，第15天相較于第10天降低了17.85%、24.56%。而D+M處理則相對(duì)降幅有所減少，其谷氨酸合成酶與硝酸還原酶活性在第10天相較于第5天降低了7.66%和8.65%，第15天相較于第10天降低了15.16%和19.62%。而谷氨酰胺合成酶在D+M處理相較于D處理中提高了10.66%、12.73%和18.69%。

2.2 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆銨態(tài)氮含量的影響

由圖1所可知，與CK處理相比，D處理葉片與根系中的銨態(tài)氮含量顯著升高，分別在第5、10、15天提升了13.35%、40.40%、27.45%和10.18%、26.60%、45.17%。D+M處理相較于CK處理在葉片銨態(tài)氮含量提高了10.98%、16.27%和27.44%，而在莖稈中D處理的銨態(tài)氮含量也顯著高于CK，但D+M處理相較于D處理則有效降低了8.16%、8.53%和19.90%。

圖1 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆銨態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effects of exogenous melatonin on ammonium nitrogen in Soybean under drought stress

2.3 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆硝態(tài)氮含量的影響

由圖2所可知，根、莖、葉中的硝態(tài)氮含量在第5、10、15天這三個(gè)時(shí)間段中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中莖稈中硝態(tài)氮含量下降幅度最大，D處理在第10天相較于第5天莖稈中硝態(tài)氮含量下降了19.31%，而葉片與根系中D處理的硝態(tài)氮含量只下降了2.26%和14.09%。與CK處理相比D處理中葉片的硝態(tài)氮含量在第5、10、15天提升了19.73%、33.76%、38.32%，莖稈中提升了12.90%、33.11%、24.48%，根系中提升了22.08%、29.09%、41.64%。與D處理相比，D+M處理在第5、10、15天根、莖、葉硝態(tài)氮含量減少了12.40%、19.64%、13.95%，9.08%、11.90%、20.69%和11.19%、16.42%、19.09%。

圖2 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆硝態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on nitrate nitrogen in Soybean under drought stress

2.4 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆酰脲含量的影響

由圖3所可知，與CK處理相比D處理葉片中酰脲的含量在第5、10、15天下降了38.99%、46.81%和49.40%，莖稈中酰脲的含量下降了27.55%、20.84%和26.99%，根系中酰脲的含量下降了25.75%、19.20%和34.02%，均達(dá)到顯著水平。而D+M處理相較于D處理酰脲含量顯著上升，且葉片和莖稈在第15天葉片酰脲含量上升幅度達(dá)到最高25.90%和22.87%，根系酰脲含量在第10天上升幅度達(dá)到最高13.97%，均達(dá)到顯著水平。

圖3 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆酰脲含量的影響Fig.3 Effects of exogenous melatonin on the urea of soybean organs under drought stress

2.5 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆氮素積累的影響

由圖4可知，與CK處理相比，D處理后第5天植株氮素積累量呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，葉片、莖稈、根系的氮素積累量上升幅度為10.71%、10.22%和2.07%，D+M處理相較于CK處理提高了11.78%、11.00%和11.08%。隨著干旱時(shí)間的延長，D處理中氮素積累量逐漸下降，與CK處理相比，D處理后10、15 d葉片、莖稈與根系中的氮素積累量下降了19.28%、32.32%，29.46%、85.49%和47.59%、63.08%，均達(dá)到顯著水平。與CK處理相比，D+M處理后10、15 d下降了7.66%、17.56%，14.59%、33.50%和16.97%、33.53%。

圖4 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆氮素積累的影響Fig.4 Effects of exogenous melatonin on nitrogen accumulation in Soybean under drought stress

2.6 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下大豆產(chǎn)量的影響

由表2可知，2018年與CK處理，D處理產(chǎn)量顯著下降，其中單株莢數(shù)降低了7.04%、單株粒數(shù)降低了8.07%、百粒重以及單株粒重分別降低了28.75%和27.70%。施用褪黑素可有效緩解干旱對(duì)大豆產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)的抑制，最終提高產(chǎn)量。與D處理相比，D+M處理上述指標(biāo)依次提高2.02%、5.77%、12.91%和10.86%。綜合2018年和2019年各項(xiàng)產(chǎn)量指標(biāo)來看，外源褪黑素可降低干旱脅迫對(duì)大豆各項(xiàng)產(chǎn)量指標(biāo)的抑制，最終提高干旱條件下大豆的產(chǎn)量。

表2 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下產(chǎn)量構(gòu)成的影響Table 2 Effects of exogenous melatonin on yield components under drought stress

3 討論

氮是影響作物生產(chǎn)力的重要標(biāo)志[16]，氮代謝過程中，植物將外界環(huán)境的無機(jī)氮通過氮代謝關(guān)鍵酶經(jīng)過一系列調(diào)節(jié)與催化成為可供植物吸收利用的有機(jī)氮[17]，這些氮代謝關(guān)鍵酶活性可整體反映出脅迫下氮素轉(zhuǎn)化的過程[18]。研究發(fā)現(xiàn)，較長時(shí)間的干旱會(huì)嚴(yán)重降低硝酸還原酶活性[19]。曹讓等[20]發(fā)現(xiàn)干旱會(huì)使棉花葉片的氮代謝功能紊亂，引起蛋白質(zhì)的大量降解，氨基酸含量改變，硝酸還原酶活性受到抑制。另有研究表明[21]，干旱脅迫下，當(dāng)?shù)x關(guān)鍵酶中的硝酸還原酶受到抑制時(shí)，會(huì)降低大豆體內(nèi)GS和GOGAT活性，進(jìn)而導(dǎo)致大豆體內(nèi)的銨積累過多，產(chǎn)生毒害效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，大豆當(dāng)遭遇干旱脅迫時(shí)氮代謝關(guān)鍵酶呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而褪黑素的施用有效緩解干旱脅迫對(duì)氮代謝關(guān)鍵酶的抑制，并增強(qiáng)其活性。這可能是因?yàn)楦珊禃?huì)造成大豆體內(nèi)水解酶活性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成減少，進(jìn)而造成NR活性降低[22]，而NR活性的高低會(huì)間接影響氮素的轉(zhuǎn)化效率，這使得NO3-還原、NH4+同化受阻，導(dǎo)致NH4+及中間產(chǎn)物酮戊二酸的供應(yīng)不足[23]，從而降低了GS和GOGAT的活性，由此推測(cè)這可能是底物不足引起的連鎖反應(yīng)。褪黑素的施用加速了NR還原NO3-生成NH4+的進(jìn)程，同時(shí)保障了GS/GOGAT循環(huán)和GDH途徑的正常運(yùn)行。

作物生長過程中氮素的存在必不可少，氮素在氨基酸、蛋白質(zhì)和其他含氮化合物的合成中極為重要，根系吸收固定的氮素主要以銨態(tài)氮與硝態(tài)氮為主，銨態(tài)氮可直接吸收利用，其余氮素則以硝態(tài)氮為主要形態(tài)的方式被吸收入植物體內(nèi)。植物體內(nèi)氮含量可作為直接反應(yīng)氮代謝是否活躍的重要指標(biāo)，是作為衡量大豆體內(nèi)的氮素營養(yǎng)、氮素同化利用與再利用狀況的重要指標(biāo)。有研究表明，銨態(tài)氮含量可作為評(píng)判植株是否遭遇脅迫的重要指標(biāo)[24]，而硝態(tài)氮含量的變化代表著作物體內(nèi)氮代謝水平與氮的同化利用情況[25]。有研究表明干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)植株體內(nèi)硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量顯著增加[26]，這與研究結(jié)果相同，干旱脅迫導(dǎo)致大豆根、莖、葉中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量顯著增加，而施用外源褪黑素后可大豆植株中的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮含量顯著降低，這種現(xiàn)象可能干旱導(dǎo)致無機(jī)氮含量上升，代謝受阻，還原同化能力下降，且褪黑素改善了這一情況。但與李麗杰等[27]研究結(jié)果有所差異，這可能是栽培條件差異造成了干旱脅迫對(duì)作物對(duì)無機(jī)氮吸收能力不同。

酰脲是大豆氮素儲(chǔ)備與運(yùn)輸?shù)闹饕问剑浜康亩嗌倥c大豆固氮酶的活性息息相關(guān)[28]。研究中，干旱條件下植株根、莖、葉中的酰脲含量顯著下降，同時(shí)隨著干旱時(shí)間的延長，酰脲的整體含量也在逐步降低，這說明干旱抑制了氮素在植物體內(nèi)的運(yùn)移，同時(shí)氮在植物體內(nèi)的積累減少，而施加外源褪黑素可促進(jìn)大豆各器官中酰脲含量的上升，這與董雪[29]的研究結(jié)果相同。植物的氮素積累量決定著最終產(chǎn)量的高低[30]。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下根、莖、葉中的氮素積累量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，產(chǎn)量顯著下降，外源褪黑素減輕了干旱脅迫帶來的不利影響，顯著提高了干旱脅迫下大豆根莖葉中的氮素積累量，產(chǎn)量顯著上升，這與李昊陽[31]研究的結(jié)果相同?？梢娡庠赐屎谒乜纱龠M(jìn)植株在干旱脅迫下維持根瘤共生固氮的正常運(yùn)作，并有助于在逆境下根瘤固氮酶活性的提高，從而穩(wěn)定氮素的積累，提高氮素利用率，進(jìn)而提高產(chǎn)量，研究結(jié)果與李菁華等研究一致[32]。

4 結(jié)論

干旱會(huì)導(dǎo)致氮代謝關(guān)鍵酶活性下降，無機(jī)氮含量增加，氮素積累和轉(zhuǎn)運(yùn)受到阻礙，產(chǎn)量降低。外源褪黑素可顯著提高干旱脅迫下氮代謝關(guān)鍵酶活性，降低無機(jī)氮含量，增加酰脲含量，提高植株各部位的氮素積累量，保障植株在干旱脅迫下的氮素同化和轉(zhuǎn)運(yùn)，最終提高產(chǎn)量。