睪丸新鮮精子與冷凍復(fù)蘇精子臨床妊娠結(jié)局的比較

葉臻,夏宇澤,孟天慶,李莉華,章慧平,熊承良

不育癥是指在12個(gè)月正常且無保護(hù)的性交后仍不能獲得臨床妊娠的一種疾病，困擾著全球8%～12%的育齡夫婦，其中約有50%是男方因素造成的[1]。無精子癥患者占不育男性的10%～15%[2]，其中梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia,OA)約占40%，非梗阻性無精子癥(nonobstructive azoospermia,NOA)約占60%[3]。卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection,ICSI) 是利用顯微操作將精子直接注射到卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的輔助生殖技術(shù)，是治療男性不育的有效方法[4]。睪丸穿刺取精(testicular sperm aspiration,TESA)、睪丸顯微取精(microdissection testicular sperm extraction,m-TESE)及供精等方法為無精子癥患者獲得后代提供了可能[5-7]。本文對比OA患者TESA新鮮精子、冷凍復(fù)蘇精子和NOA患者m-TESE新鮮精子、冷凍復(fù)蘇精子行 ICSI 助孕的結(jié)局，以及對比OA、NOA患者移植新鮮、冷凍復(fù)蘇胚胎的結(jié)局，分析不同來源的精子和胚胎對最終妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2021年3月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受ICSI助孕的1 116個(gè)周期。選擇標(biāo)準(zhǔn)：① 所有組別受試者年齡22～45歲之間，根據(jù)《WHO人類精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版，取精液做3次常規(guī)分析并離心沉淀后均未發(fā)現(xiàn)精子；② 排除女方因素不育，包括輸卵管梗阻、多囊卵巢綜合征、卵巢儲備功能低下、高齡、子宮畸形和子宮內(nèi)膜異位癥等，且女方竇卵泡計(jì)數(shù)>8個(gè)，抗苗勒管激素水平>1.45 ng/mL。根據(jù)患者病情和精子、胚胎來源不同，分為TESA新鮮精子組(n=421)，TESA冷凍復(fù)蘇精子組(n=12)，m-TESE新鮮精子組(n=34)，m-TESE冷凍復(fù)蘇精子組(n=38)，OA移植新鮮胚胎組(n=290)，NOA移植新鮮胚胎組(n=28)，OA移植冷凍復(fù)蘇胚胎組(n=236)和NOA移植冷凍復(fù)蘇胚胎組(n=57)。此課題嚴(yán)格通過倫理委員會討論并得到審批，所有無精子患者均簽署知情同意書，充分知情并了解整個(gè)手術(shù)的術(shù)中及術(shù)后注意事項(xiàng)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)超排卵 采用促性腺激素激動劑進(jìn)行降調(diào)節(jié)，用卵泡生成激素促超排卵，當(dāng)卵泡發(fā)育成熟后，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)誘發(fā)排卵，36～38 h后在超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。

1.2.2 TESA組 OA患者取仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾后，5 mL 2%利多卡因生理鹽水1∶1 稀釋后精索局部麻醉阻滯。固定一側(cè)睪丸后用連接 9號針頭20 mL的注射器經(jīng)皮穿刺睪丸抽吸，將抽吸出的曲細(xì)精管置于培養(yǎng)皿中，用注射器針頭撕碎曲細(xì)精管，倒置顯微鏡下尋找活動精子。在顯微鏡下若發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量較多，征求患者同意后，給予冷凍保存。

1.2.3 m-TESE組 NOA患者全麻或者腰麻下，取陰囊正中切開皮膚約2 cm，依次切開筋膜、鞘膜，充分露出睪丸，切開白膜約1.0 cm，在手術(shù)顯微鏡下放大20倍，尋找稍微飽滿的生精小管放入培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡下尋找活動精子。征求患者夫妻雙方同意，在顯微取精沒有找到精子及其配偶不愿意行供精體外受精治療時(shí)，可以先做m-TESE，取到精子后實(shí)行冷凍保存處理。

1.2.4 精子冷凍保存及復(fù)蘇方法 術(shù)中取出的睪丸組織在體視鏡下用1 mL注射針頭剝離，將曲細(xì)精管中的精子擠出后,加入稀少精子冷凍保護(hù)劑，并與精液組織懸液完全混合后放置在室溫下平衡5 min以上。再用凍存管分裝，將凍存管水平放置在液氮液面上熏蒸5～10 min，并轉(zhuǎn)移到-196℃液氮存儲罐中保存。復(fù)蘇操作程序：從液氮罐中取出事先留存的精液標(biāo)本并核對后，快速置入37℃水浴鍋中復(fù)溫10 min。解凍后的精液標(biāo)本反復(fù)倒置混勻，取10 μL精液標(biāo)本進(jìn)行精液濃度和活力的鏡下檢查。

1.2.5 精子受精、移植及臨床妊娠情況的判定 ICSI 挑選一個(gè)形態(tài)正常，活動好的精子，注射于卵細(xì)胞內(nèi),分別于16～18 h后觀察是否正常受精。卵細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙原核為正常受精，單個(gè)或多個(gè)原核為異常受精，無原核出現(xiàn)為未受精。將正常受精卵轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每天根據(jù)胚胎的生長速率及形態(tài)學(xué)指標(biāo)評估胚胎發(fā)育的情況，記錄優(yōu)質(zhì)胚胎率。在取卵第3天選擇2枚優(yōu)質(zhì)胚胎移植入子宮內(nèi)，移植后14天抽靜脈血檢測女方血清β-hCG；若血清β-hCG>10 IU/L，再于2周后超聲檢測位于子宮內(nèi)有心管搏動的孕囊，就可以確認(rèn)為臨床妊娠。對于移植后未妊娠的患者以及沒有移植新鮮胚胎的患者，隨訪期間移植了冷凍復(fù)蘇胚胎，同樣對移植后的妊娠情況也進(jìn)行了隨訪。

1.2.6 胚胎冷凍保存及復(fù)蘇方法 所有胚胎的冷凍及復(fù)蘇嚴(yán)格按照玻璃化冷凍及復(fù)蘇試劑盒(KITAZATO，日本)說明書操作，僅在平衡時(shí)間及洗滌時(shí)間稍作改進(jìn)。冷凍過程分兩步：胚胎于1#平衡液中平衡8 min；轉(zhuǎn)至2#玻璃化冷凍中，快速裝桿，該步驟應(yīng)該在1 min內(nèi)完成。復(fù)蘇過程為4步：胚胎于37℃預(yù)溫的1#解凍液中迅速復(fù)溫，該過程在1 min內(nèi)完成；復(fù)溫的胚胎先后置于2#稀釋液3 min，3#洗滌液5 min，4#洗滌液2 min。

1.2.7 計(jì)算方法 ICSI受精率：(2pN+1pN+多精受精+晚期卵裂)/獲卵數(shù)；卵裂率：第3天胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率：第3天單個(gè)胚胎里細(xì)胞數(shù)≥6個(gè)同時(shí)碎片<20%的胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)；妊娠率：指臨床妊娠率， B超提示有孕囊或刮宮可見絨毛/移植人數(shù)；流產(chǎn)率：流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)；活產(chǎn)率：分娩的周期數(shù)/移植周期數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3.0分析，樣本率的比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)、連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA患者TESA新鮮精子與冷凍復(fù)蘇精子周期ICSI治療結(jié)局比較

在受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率方面，TESA新鮮精子明顯高于TESA冷凍復(fù)蘇精子(P<0.05)；在卵裂率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率方面，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 OA患者TESA新鮮精子與冷凍復(fù)蘇精子周期ICSI治療結(jié)局比較(%)

2.2 NOA患者m-TESE新鮮精子與冷凍復(fù)蘇精子周期ICSI治療結(jié)局比較

在受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率方面，m-TESE新鮮精子組高于m-TESE冷凍復(fù)蘇精子組(P<0.05)；在卵裂率方面，m-TESE冷凍復(fù)蘇精子高于m-TESE新鮮精子(P<0.05)；臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率比較，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 NOA患者m-TESA新鮮精子與冷凍復(fù)蘇精子周期ICSI治療結(jié)局比較(%)

2.3 OA與NOA患者移植新鮮胚胎妊娠結(jié)局比較

OA患者移植新鮮胚胎可以獲得比NOA患者更高的臨床妊娠率(P<0.05)；在流產(chǎn)率和活產(chǎn)率方面，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表3。

表3 OA和NOA患者移植新鮮胚胎周期ICSI治療結(jié)局比較(%)

2.4 OA與NOA患者移植冷凍復(fù)蘇胚胎妊娠結(jié)局比較

在臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率方面比較，OA、NOA患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見下頁表4。

表4 OA和NOA患者移植冷凍復(fù)蘇胚胎周期ICSI治療結(jié)局比較(%)

3 討論

隨著人們生活方式和社會環(huán)境的變化以及心理因素的影響，不孕癥的發(fā)生率在逐漸上升[8]，其中男性因素至關(guān)重要，治療男性不育的方法有藥物治療和體外受精治療等[9]。無精子癥是導(dǎo)致男性不育的重要原因，ICSI的問世為無精子癥患者生育后代帶來福音[10]。ICSI是將單一精子直接注射到卵細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)使其受精，跳過了精子進(jìn)入卵子的一系列步驟，不受精子不利條件的限制，被廣泛應(yīng)用于男性不育的治療[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論是OA患者做TESA，還是NOA患者做m-TESE，新鮮精子都比冷凍復(fù)蘇精子有更好的受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率；NOA患者m-TESE冷凍復(fù)蘇精子對應(yīng)的卵裂率顯著高于新鮮精子。關(guān)于新鮮精子與冷凍復(fù)蘇精子對ICSI治療結(jié)局的影響，文獻(xiàn)結(jié)果不同。董萌等[12]對OA和NOA患者進(jìn)行TESA取精和經(jīng)皮附睪穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)，認(rèn)為冷凍復(fù)蘇精子進(jìn)行ICSI不影響受精率和卵裂率。宋文妍等[13]認(rèn)為冷凍復(fù)蘇精子不影響優(yōu)質(zhì)胚胎率。精子凍存可以為以后的ICSI及胚胎移植提供方便，患者無需再次取精，避免了穿刺等有創(chuàng)操作[14]，減少了患者的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。但是精子冷凍是否會對精子造成損傷，目前仍有爭議。孟慶艷等[15]認(rèn)為精子冷凍之后會對糖代謝造成影響，袁水橋等[16]認(rèn)為冷凍精子無法保證復(fù)蘇率，但Nuez-Calonge等[17]認(rèn)為精子解凍的體外培養(yǎng)過程可以提高精子的活力和受精率。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，雖然新鮮精子可以提高受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率，但并不影響臨床妊娠率。對此，文獻(xiàn)結(jié)果也說法不一。宋文妍等[13]研究發(fā)現(xiàn)冷凍復(fù)蘇精子與新鮮精子在臨床妊娠率方面沒有明顯差別。孟慶艷等[15]對OA和NOA患者進(jìn)行睪丸切開取精，比較了新鮮精子和冷凍復(fù)蘇精子對ICSI結(jié)局的影響，發(fā)現(xiàn)冷凍復(fù)蘇精子可以提高臨床妊娠率，他們認(rèn)為原因可能是冷凍復(fù)蘇過程中對精子的進(jìn)一步篩選提高了精子的能動性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，OA患者移植新鮮胚胎可以獲得比NOA患者更高的臨床妊娠率。部分新鮮胚胎由于女方卵巢過度刺激綜合征、內(nèi)膜生長不良或是宮腔積液等問題，患者雙方選擇將胚胎冷凍，等待合適時(shí)機(jī)再進(jìn)行移植。

此外，本研究沒有納入和分析患者進(jìn)行PESA得到精子和射出精子的數(shù)據(jù)，還需要補(bǔ)充多中心研究，分析大數(shù)據(jù)來驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論。無精子癥患者還可以通過PESA與ICSI相結(jié)合的方式孕育后代[18]，但是無精子癥部分是由遺傳引起的[2]，所以在進(jìn)行ICSI之前需對患者進(jìn)行基因和染色體的篩查，以實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，此類患者可以通過精子庫供精來生育后代。