lnc-SNHG5及miR-155在子癇前期患者血清及外泌體中的表達及其胎盤源性檢測

許洪梅，張媛，章樂霞，周淑

子癇前期(preeclampsia，PE)是產(chǎn)科嚴重并發(fā)癥之一，在孕婦中發(fā)病率約為4%～6%，也是導(dǎo)致產(chǎn)婦死亡的重要因素之一[1]。PE病情變化復(fù)雜，病因不明，目前研究認為該疾病為多種因素共同導(dǎo)致[2]。胎盤功能障礙是該疾病的主要表型，胎盤源性因素作用于全身系統(tǒng)，引發(fā)的一系列病理表現(xiàn)可能為PE發(fā)生的潛在機制。同時相關(guān)研究表明，多種非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括lncRNA、miRNA等在PE患者胎盤組織中差異性表達[3-4]，這些ncRNA能夠通過交互調(diào)控，影響下游靶基因，在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞功能、子宮螺旋動脈重鑄等過程中發(fā)揮作用，從而參與PE發(fā)病。然而，發(fā)生PE時胎盤-母體間的“對話”方式尚不明晰。

許晨等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-155在PE胎盤組織中表達增高，而我們的研究發(fā)現(xiàn)：在PE胎盤中低表達的lnc-SNHG5能夠發(fā)揮競爭性內(nèi)源性RNA樣作用，并通過影響miR-155/特異性趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)途徑，抑制滋養(yǎng)細胞侵襲，從而進一步明確了lnc-SNHG5與PE的相關(guān)性[6]。外泌體(exosomes，exo)中富含包括miRNA在內(nèi)的多種成分，能夠通過轉(zhuǎn)運至效應(yīng)器官/組織細胞，發(fā)揮諸多的生理調(diào)控作用[7]。因此，胎盤組織中差異性表達的lnc-SNHG5、miR-155能否以被外泌體裝載的方式作用于PE患者全身，從而引發(fā)一系列的病理變化產(chǎn)生，值得探究。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2020年11月至2021年3月在樂山市人民醫(yī)院產(chǎn)科住院接受剖宮產(chǎn)分娩的30例產(chǎn)婦；其中NC組15例，均為正常晚孕孕婦，無任何孕產(chǎn)期合并癥，平均(25.45±6.17)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)≤25 kg/m2，平均孕周(38.85±3.01)周；PE組15例，均按照人衛(wèi)第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》標準診斷為PE，且未接受任何治療，平均(27.67±4.17)歲，BMI≤25 kg/m2，平均孕周(36.38±2.71)周。兩組患者均為單胎初產(chǎn)患者；既往無遺傳性、傳染性疾及代謝性疾病病史；無孕早期藥物、放射線及毒物接觸史。本研究經(jīng)我院倫理委員同意并批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和材料

exoEasy Maxi Kit外泌體提取試劑盒(德國Qiagen公司)；exoRNeasy Serum(德國Qiagen公司)；PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本Takara公司)；TRIzol(美國invitrogen公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)；CD63多克隆抗體(中國武漢三鷹公司)；CD9單克隆抗體(英國Abcam公司)；PLAP單克隆抗體、HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)；ECL底物液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清標本收集 入院后在接受藥物及手術(shù)治療前，分次采集、收集納入孕婦晨起空腹肘靜脈血共計15 mL。所有血漿樣本均在采集后置促凝管中，4℃靜置過夜后2 000 r/min離心5 min，吸取上層血清至EP管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清標本外泌體提取 使用0.8 μm的濾膜過濾兩組血清，按照exoEasy Maxi Kit說明書步驟將過濾后血清與緩沖液1∶1混合，倒置混合均勻后加入至exoEasy自旋柱上，2 000 r/min離心1 min；收集離心液并加入緩沖液，5 000 r/min離心5 min；將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，加入400 μL緩沖液孵育1 min，500 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液重懸離心沉淀，即得到兩組exo(PE組exo、NC組exo)，留存?zhèn)錅y。

1.3.3 血清標本exo鑒定 使用Nanosight NS300系統(tǒng)進行exoNTA鑒定，PBS緩沖液多次稀釋exo樣本，直至影像學(xué)判斷樣品于合適濃度下觀察；依據(jù)收集的影像動態(tài)記錄片段，分析測量exo樣本顆粒粒徑(nm)及對應(yīng)顆粒濃度(顆粒個數(shù)/mL)。

使用2.5%的戊二醛4℃下固定兩組外泌體，磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗3次(每次15 min)；隨后使用2%鋨酸溶液室溫(20℃)下固定2 h；再次PBS液漂洗3次(每次15 min)；梯度乙醇脫水(20 min)；丙酮：812包埋劑(1∶1)混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜；將包埋板于60℃下聚合48 h；切片(成片厚度60 nm～80 nm)；2%醋酸鈾飽和水溶液及枸櫞酸鉛，各染色切片15 min后，室溫干燥過夜；最后于透射電鏡下拍照。

1.3.4 血清標本exo特征性蛋白及胎盤源性特異性蛋白檢測 RIPA裂解液提取PE組exo、對照組exo總蛋白；檢測蛋白濃度后，Western blot檢測exo特征性蛋白：配膠后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)；將目的條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫搖床封閉2 h；PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜(抗體濃度：exo特征性蛋白CD9 1∶2 000、CD63 1∶400；胎盤源性特異性蛋白PLAP 1∶500)；TBST洗滌PVDF膜；PVDF膜浸泡于HRP標記二抗(1∶50 000)孵育液中，室溫孵育2 h；ECL顯影、定影，BandScan分析膠片灰度值。

1.3.5 血清標本及exo中l(wèi)nc-SNHG5、miR-155在mRNA水平的表達檢測 Trizol法及按照exoRNeasy Serum說明書步驟分別提取血清標本及exo中總RNA；檢測RNA質(zhì)量后，按照PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit說明書步驟進行實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)。引物序列詳見表1。反應(yīng)條件：95°C 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，進行PCR反應(yīng)。每次檢測設(shè)定3個復(fù)孔，每個樣本重復(fù)3次。根據(jù)PCR擴增曲線，使用 2-△△Ct法計算各組中目的基因lnc-SNHG5、miR-155 mRNA水平的表達情況。

表1 目的基因引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清標本外泌體鑒定

NTA鑒定結(jié)果顯示，PE組exo及NC組exo的粒徑大小均主要集中于30 nm～200 nm范圍內(nèi)；粒子濃度分別為：為2.84×109particles/mL、 2.31×109particles/mL，見圖1。

圖1 NTA檢測PE組exo及NC組exo粒徑、濃度

于透射電鏡下觀察血清標本中所提取的PE組exo及NC組exo，可見兩組形態(tài)均為典型囊泡狀，圓盤雙凹形；直徑大小大多位于50 nm～150 nm范圍內(nèi)，見圖2。

圖2 PE組exo及NC組exo透射電鏡圖(比例尺200 nm)

2.2 血清標本外泌體特征性蛋白及胎盤源性特異性蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示，PE組exo及NC組exo均可表達exo表面特征性蛋白CD9、CD63以及胎盤源性特異性蛋白PLAP，見圖3。

圖3 Western blot檢測PE組exo及NC組exo CD9、CD63、PLAP蛋白水平表達

2.3 血清標本及外泌體中l(wèi)nc-SNHG5、miR-155在mRNA水平的表達情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，與NC組比較，PE組lnc-SNHG5 mRNA表達水平在血清及exo中均降低(P<0.05)；PE組miR-155 mRNA表達水平在血清及exo中均升高(P<0.05)，詳見表4。

表4 血清及exo中l(wèi)nc-SNHG5、miR-155在mRNA水平的表達

3 討論

PE是以高血壓、蛋白尿等多系統(tǒng)器官功能紊亂為主要表現(xiàn)的全身性疾病，是妊娠期導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及胎兒不良結(jié)局的常見疾病[1]。胎盤娩出，PE癥狀即可緩解或消失[8]，提示胎盤功能異常在PE發(fā)病中的重要作用。有研究顯示，妊娠狀態(tài)下胎盤細胞分泌的微小脂質(zhì)囊泡，即exo能夠參與母體-胎盤間部分“對話”過程，從而起到傳遞及調(diào)節(jié)胎盤功能的作用[9]。因此提示，胎盤源性exo在PE發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。

exo直徑僅為30 nm～100 nm，其存在于各種組織、體液、細胞中，并攜帶脂質(zhì)組、蛋白質(zhì)、核酸物質(zhì)、非編碼RNA[7]等成分，以發(fā)揮其病理及生理調(diào)節(jié)作用[10]。在exo所攜帶的各類分子成分中，miRNA能夠發(fā)揮其對靶基因的定向調(diào)控作用，參與多種病理生理過程，已經(jīng)在多個生命科學(xué)領(lǐng)域中得到了明確[11]。既往研究提示：在胎盤組織中病理性高表達的miR-155能夠調(diào)控多個靶基因，參與滋養(yǎng)細胞凋亡、侵襲、血管生成以及炎癥反應(yīng)等多種生理過程，從而參與PE發(fā)病[12]；后續(xù)我們研究中進一步發(fā)現(xiàn)，lnc-SNHG5在胎盤組織中低表達，其能夠負向調(diào)控miR-155，進而影響miR-155靶基因CXCR4的表達，從而抑制滋養(yǎng)細胞侵襲；提示lnc-SNHG5與miR-155之間構(gòu)成的調(diào)節(jié)系統(tǒng)在PE發(fā)病中起到了一定作用[6]。但是，上述PE相關(guān)的差異性表達的非編碼RNA(lnc-SNHG5、miR-155)是在胎盤組織中所發(fā)現(xiàn)，組織中的差異表達趨勢，是否也同樣存在于母體中？本研究中我們進一步檢測了母體血清中l(wèi)nc-SNHG5、miR-155的表達情況，結(jié)果提示：與對照組相比，PE組lnc-SNHG5 mRNA表達水平在血清中降低、miR-155 mRNA表達水平在血清升高；這與前期研究中，在胎盤組織中發(fā)現(xiàn)的lnc-SNHG5、miR-155差異表達趨勢一致；進一步驗證了lnc-SNHG5、miR-155與PE的相關(guān)性以及它們有成為疾病標志物的潛力。但是PE時，lnc-SNHG5、miR-155如何從胎盤作用于母體全身、以及這兩者間如何完成調(diào)控作用尚未知。

結(jié)合exo具有細胞間基因交流的功能，本研究中，我們嘗試分離PE及正常晚孕孕婦血清中的exo并鑒定這些exo是否具有胎盤源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PE組及對照組exo均可表達exo表面特征性蛋白CD9、CD63以及胎盤源性特異性蛋白PLAP。進一步檢測exo中l(wèi)nc-SNHG5、miR-155表達，結(jié)果提示：與對照組相比，PE組lnc-SNHG5表達水平降低、miR-155表達水平升高；這與我們前期在胎盤組織及血清中的檢測結(jié)果均一致。與其他exo不同，胎盤來源exo可特異性表達PLAP[13]，通過上述研究我們驗證了攜帶差異性表達lnc-SNHG5、miR-155的exo源自胎盤細胞，提示胎盤組織中差異表達的lnc-SNHG5、miR-155可能通過exo攜帶轉(zhuǎn)運的方式實現(xiàn)了兩者間調(diào)控，以及參與了PE發(fā)病過程。lncRNA雖不能直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯過程，但是其可以通過miRNA實現(xiàn)其調(diào)節(jié)力，這一過程可能通過exo作為介導(dǎo)，在多種組織環(huán)境中實現(xiàn)；已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，exo源性miRNA能夠通過參與調(diào)控多種細胞的生物學(xué)功能，影響螺旋動脈重鑄、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細胞代謝、自噬等過程[14-15]；并且相較于血清中，exo源性lncRNA、miRNA具有更好的穩(wěn)定性并不易被降解[16-17]，從而完好無損地從其“發(fā)源地”前往“目的地”發(fā)揮相關(guān)作用。在后續(xù)的研究中，我們還將進一步通過細胞攝取實驗驗證攜帶差異表達lncRNA、miRNA的胎盤源性exo能否被滋養(yǎng)細胞、血管內(nèi)皮細胞等直接攝取，流式細胞術(shù)聯(lián)合侵襲小室、管樣形成實驗等并觀察細胞功能是否發(fā)生變化，以及qRT-PCR、western-blot檢測涉及的相關(guān)因子表達情況，以期從功能調(diào)節(jié)角度驗證胎盤源性exo所發(fā)揮的具體作用。

綜上，lnc-SNHG5、miR-155在PE患者胎盤組織、血清以及血清exo中具有一致的差異性表達趨勢，并且血清中exo lnc-SNHG5、miR-155具有胎盤源性。上述發(fā)現(xiàn)有助于進一步明確lnc-SNHG5、miR-155與PE的相關(guān)性，并且為探索PE發(fā)病機制和PE的臨床診治提供新的思路以及潛在靶點。