海巴戟果實發(fā)育過程中果糖、果糖激酶及其基因的變化

王青芬, 宮樹森, 白艷, 劉念, 王培源, 吳田

海巴戟果實發(fā)育過程中果糖、果糖激酶及其基因的變化

王青芬, 宮樹森, 白艷, 劉念, 王培源, 吳田*

(西南林業(yè)大學園林園藝學院，國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術研究中心，云南省功能性花卉資源及產業(yè)化技術工程研究中心，昆明 650224)

為揭示海巴戟果實風味形成機制，對果實發(fā)育過程的果糖激酶(FRK)活性及其基因的表達模式進行了研究。結果表明，海巴戟果實中的果糖、蔗糖、葡萄糖含量隨發(fā)育不斷積累，均在果實完全成熟時達到最高值，而果糖激酶活性隨果實發(fā)育不斷下降。從果實中克隆了果糖激酶基因，命名為，GenBank登錄號為MW380742, 其ORF全長為984 bp，編碼327個氨基酸，與咖啡()的FRK2氨基酸序列相似性為98%。qRT-PCR表明，的表達量在果實發(fā)育過程中呈下降趨勢，當果實成熟時表達的趨于平穩(wěn)，與果糖激酶活性變化趨勢一致。因此，可能通過調控果實果糖激酶活性而參與糖代謝，對調控果實風味的形成具有重要作用。

海巴戟；果糖激酶基因；果糖；表達

海巴戟()，亦稱諾麗，為茜草科(Rubiaceae)巴戟天屬植物，果實中含有多種營養(yǎng)成分，如維生素、礦物質、氨基酸、塞洛寧原、多糖、香豆素等重要成分。2004年全球諾麗產業(yè)已實現(xiàn)40億美元的銷售，且呈逐年增加的態(tài)勢，主要用于增強免疫力的保健食品[1]。海巴戟果實屬于典型的呼吸躍變型，在果實后熟過程中積累有益于人體健康的營養(yǎng)成分并形成其特有的風味，對果實成熟品質特性和品質形成進行研究具有重要意義。而果實風味形成的重要決定因素是糖類物質代謝，如葡萄糖、果糖、蔗糖等，蔗糖是大多數(shù)植物光合作用的同化產物[2]，在轉化酶的作用下分解為果糖和葡萄糖，果糖的進一步利用需要被果糖激酶(fruc- tokinase, FRK, EC 2.7.1.4)或者己糖激酶(hexokinase, HK, EC 2.7.1.1)磷酸化，但果糖激酶與果糖的親和力更高，植物中的果糖可能主要被果糖激酶磷酸化[3-5]。同時FRK調節(jié)植物的代謝和生長發(fā)育[6], 因此，研究海巴戟FRK及其在果實發(fā)育過程中的表達情況，有利于了解果糖代謝，為改善果實風味提供理論基礎。

目前，已從多種高等植物中克隆了基因，木薯()中有6個基因()，其在葉、莖、花和果實中表達模式不同[7]。柑橘()有2個基因(和)，在幼葉或幼果等幼嫩組織中表達,而在成熟的果實中表達，F(xiàn)RK活性隨果實發(fā)育呈下降趨勢，與果實中果糖的積累有關, 推測FRK活性在柑橘果實果糖積累中起重要作用[8]。Qin等[9]從枇杷()中克隆了1個基因，的表達量和FRK活性在果實發(fā)育早期高于成熟時期，與果糖含量變化趨勢相反，表明高FRK活性可能抑制果糖的積累。因此，F(xiàn)RK在植物不同的發(fā)育時期的表達具有特異性。

目前對海巴戟的研究主要集中在化學成分、生理特征、藥用價值、種質資源、繁殖和加工技術等方面，對海巴戟果實成熟調控機理的研究鮮有報道。本研究以不同發(fā)育時期海巴戟果實為材料，因為果實中糖含量和FRK活性具有一定的關系，基于前期RNA-seq研究結果，進一步克隆了果糖激酶基因，分析了在海巴戟果實不同發(fā)育時期中的表達模式，為后續(xù)深入研究相應基因功能和調控海巴戟果實品質提供理論和技術基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

海巴戟()種植于云南省玉溪市元江縣海巴戟種植基地。元江是典型的干熱河谷氣候，年平均為23.7 ℃，年均降水量約800 mm，適合海巴戟的生長發(fā)育[10]。海巴戟果實發(fā)育分為花脫落期(4成熟)、幼果形成期(5成熟)、膨大期(6成熟)、綠熟期(8成熟)和白熟期(全熟)。采集不同發(fā)育時期的果實切碎，迅速用液氮速凍，放于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 果實糖含量

海巴戟果實糖含量參照帥良等[11]的方法測定，用高效液相色譜儀(Agilent1260，德國)測定，每個發(fā)育時期3個重復。所用標準品為果糖、葡萄糖和蔗糖，均為分析純樣品，通過比較樣品和標準品的峰保留時間和峰面積，分析糖的種類并計算含量。

1.3 果實的果糖激酶活性測定

參照帥良等[11]的方法提取果糖激酶(FRK)，用紫外分光光度計(UV-5100, 上海)測定FRK活性, 所有操作都在冰上完成，重復3次。

1.4 McFRK2的表達分析

基于海巴戟RNA-seq研究，篩選出4個基因片段，其中基因在采摘后0和48 h表達量差異顯著，設計熒光定量引物qFRK2 (表1)，以為內參基因[12]進行qPCR擴增。反應體系為20L，包括2×SYBR Green master mix 10L，正、反向引物qFRK2各0.6L，果實cDNA模板2L，ddH2O 6.8L。qPCR反應程序為先95 ℃ 10 min; 然后95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40個循環(huán)。3個重復，用2-??CT計算相對表達量, 并用SPSS進行方差分析，以<0.05表示顯著差異,<0.01表示極顯著差異，用Origin 2019作圖。

1.5 McFRK基因的克隆

采用Trigol試劑盒(鼎國生物科技有限公司，北京)提取海巴戟總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測RNA的質量。按照TransScript One- Step gDNA Removal and cDNA Syntjesis SuperMix試劑盒(全式金生物技術有限公司，北京)說明書操作，合成第一鏈cDNA。根據(jù)RNA-seq篩選的果實基因片段，使用Primer 5.0軟件設計特異性引物FRK2 (表1)，以反轉錄合成的cDNA為模板，擴增基因的全長序列。PCR反應體系為 20L,包括ddH2O 13.2L, 10×EasyBuffer 2.5L, dNTPs(2.5 mmol/L) 2L，正、反向引物FRK2各0.5L,cDNA模板1L，DNA polymeRABe 0.3L。PCR反應程序為：先95 ℃ 3 min; 然后95 ℃ 45 s, 58 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s, 共35個循環(huán); 最后72 ℃7 min。于4 ℃下保存，PCR產物經電泳檢測后,切膠回收，連接到pMD18-T克隆載體上，轉入大腸桿菌，挑取陽性單菌送至上海生工生物科技有限公司進行測序。

表1 引物序列及PCR程序

1.6 生物信息學分析

用NCBI-blastx進行序列比對，篩選出相似性較高的氨基酸序列，運用MEGA6軟件構建系統(tǒng)進化樹。采用ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行開放閱讀框比對并推導氨基酸序列，用NCBI- CD-Search進行保守結構域分析。用Cell-PLoc 2.0[13](http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行亞細胞定位。用TMHMM Server v.2.0[14](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行蛋白跨膜結構域預測。

2 結果和分析

2.1 果實的FRK活性和糖含量變化

從圖1可見，F(xiàn)RK活性隨果實的發(fā)育而不斷下降，果實完全成熟時最低。果實不同發(fā)育期的果糖、蔗糖和葡萄糖含量變化趨勢相似，即3種糖含量都隨果實的發(fā)育不斷升高，均在果實完全成熟時最高，分別為20.02、8.76和10.01 mg/g。果實在成熟過程中，果糖含量顯著高于葡萄糖和蔗糖含量，并且與葡萄糖和蔗糖的總量大致相等。以膨大期果實為分界，從花脫落期到膨大期FRK活性下降速率高于從膨大期到白熟期，果糖、蔗糖、葡萄糖含量從花脫落期到膨大期的上升速率高于從膨大期到白熟期。FRK活性與糖含量呈負相關關系，說明高水平的FRK活性可能會抑制果實中糖的積累。

2.2 基于海巴戟轉錄組測序的FRK基因克隆

RNA-seq測序可以得到植物特定組織或器官在特定時期的基因表達信息，有助于挖掘次生代謝產物合成調控關鍵酶基因[15]。經RNA-seq[16](PRJNA 503490)分析，F(xiàn)RK參與了果糖和甘露糖代謝(ko- 00051)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、氨基糖和核苷糖代謝(ko00520)途徑。在ko00051和ko00500途徑中，果糖(d-fructose)在FRK和HK作用下轉化為-d-果糖-6P (-d-fructose-6P)，然后進入糖酵解或糖異生途徑。在ko00520途徑中，果糖(fructose)在FRK和HK作用下磷酸化為果糖-6P (fructose-6P)，然后進入糖酵解和糖異生階段。在這3個途徑中，我們挖掘到差異表達的(和)和(和)基因，其中在果實采摘后0和48 h的表達差異大(圖2)，F(xiàn)C值達190.57和35.81，可見該基因為海巴戟果實果糖磷酸化的關鍵候選基因, 故選擇該基因進行后續(xù)的全長克隆及表達分析。

圖1 海巴戟果實不同發(fā)育時期的糖含量和FRK活性。1: 花脫落期; 2: 幼果形成期; 3: 膨大期; 4: 綠熟期; 5: 白熟期。

2.3 McFRK克隆及McFRK生物信息學分析

克隆的基因的ORF全長為984 bp，編碼327個氨基酸。利用NCBI-blastx進行相似性比對，結果該蛋白與咖啡()的FRK2氨基酸序列相似性為98%。系統(tǒng)進化樹表明(圖3)，海巴戟的FRK與茜草科咖啡屬咖啡的FRK2親緣關系最近。這進一步表明海巴戟是基因家族成員，故將該基因命名為, GenBank登錄號為MW380742。

用NCBI中的CD-Search進行保守結構域分析，表明McFRK2具有PfkB家族的高度保守特性，包含3個底物結合區(qū)域、6個ATP結合位點和3個保守結構域PLN02323、bac_FRK和RbsK, 推測Mc- FRK2蛋白可能具有保守結構域的功能，屬于果糖激酶，對果糖具有高度特異性(圖4)。

圖2 RNA-seq篩選的6個差異表達基因的表達。1: TRINITY_DN17136_ c0_g1; 2: TRINITY_DN4665_c0_g1; 3: TRINITY_DN18580_c0_g1; 4: TRINITY_DN17192_c0_g1; 5: TRINITY_DN17601_c0_g1; 6: TRINITY_ DN10207_c0_g1。

利用Cell-PLoc 2.0進行亞細胞定位預測，結果表明McFRK2蛋白主要位于細胞質中。TMHMM Server v.2.0的跨膜結構預測表明，該蛋白沒有跨膜結構域，暗示McFRK2蛋白主要在細胞質合成并行使功能，屬于非分泌蛋白。

2.4 McFRK2的表達分析

隨果實的發(fā)育，表達量逐漸下降，但在果實接近完全成熟時表達量趨于穩(wěn)定(圖5)。從花脫落期到果實膨大期，的表達雖逐漸下降，但維持在相對較高的水平。白熟期果實的表達量最低。

圖3 不同物種間FRK蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖4 海巴戟McFRK2蛋白保守結構域分析

圖5 海巴戟果實McFRK2基因的表達。1: 花脫落期; 2: 幼果形成期; 3: 膨大期; 4: 綠熟期; 5: 白熟期。

3 結論和討論

果實的風味包括甜味、酸味、香味等，甜味主要與果實中的可溶性糖有關，果實中的可溶性糖主要是果糖、葡萄糖和蔗糖，以果糖最甜，其次是蔗糖、葡萄糖。因此，提高果實的總糖含量或果糖的累積均可改良果實風味[17]。基因可調節(jié)果實生長發(fā)育和可溶性糖含量。果糖是植物細胞中的主要糖分之一，是蔗糖水解的產物，必須磷酸化后才能進入下一步代謝，果糖的磷酸化主要是在FRK的催化作用下進行。在海巴戟中成功克隆出1個果糖激酶基因，經過系統(tǒng)進化樹分析，與茜草科的咖啡聚在同一支，表明海巴戟基因與同科植物的基因相似度高，進化關系較近。本研究以海巴戟RNA-seq為基礎，分析基因在糖代謝途徑中的作用，有助于我們研究該基因的功能[18]，改善果實的風味。

海巴戟果實中果糖、蔗糖、葡萄糖含量及FRK活性在果實發(fā)育初期含量最低，隨著果實發(fā)育，積累量增加，果實成熟達到最大值。這可能是因為果實發(fā)育早期需要分解大量蔗糖用于生長，因此早期果實內沒有積累大量果糖[19]；果實發(fā)育后期，蔗糖大量分解，果糖隨之大量積累[20]，果實中的果糖含量達到最高，是蔗糖和葡萄糖含量的總和?；螂S著海巴戟果實的成熟逐漸下降，這與‘紅顏’草莓(‘Hongyan’)中的基因[21]、枸杞()中的基因[22]和楊梅()中的基因[23]的表達模式一致。基因屬于糖調節(jié)基因[24]，海巴戟基因的表達量隨果實的發(fā)育而下降，推測可能與果實中含糖量的變化有關。在海巴戟果實發(fā)育的后期，糖含量達最大，但是基因的表達量最低，因此推測基因的表達也可能受糖含量的調控。海巴戟果實發(fā)育過程中，基因的表達量與果糖、蔗糖、葡萄糖含量呈負相關。對柑橘()[8]、枇杷()[9]、蘋果()[25]果實的研究結果表明，、和基因在果實中的表達與果糖的積累呈負相關。因此，說明當與糖類物質分解相關基因的表達和活性下降時，有利于果實中糖類物質的積累，在蘋果中過表達基因，果糖濃度下降，且同源基因在不同植物中的功能是類似的[25]，進一步表明在海巴戟果糖降解過程中發(fā)揮作用。

在柑橘果實中，糖含量與果實的口感直接相關，并且是果實品質和風味[26]的重要影響因素。果糖對果實的品質具有重要的作用，也是枇杷成熟果實中主要的糖類之一[9]。進一步表明糖代謝機制的研究對改善果實風味具有重要意義。后續(xù)我們將通過構建該基因超量表達載體，利用課題組前期建立的高效遺傳轉化體系[27-28]進行轉基因研究，以明確該基因在果糖代謝過程中及風味形成過程中的功能。

[1] LIU J L, ZHANG R, LIU Y B, et al.Literature research and discussion of Chinese medicinal properties of[J].China J Chin Mat Med, 2020, 45(5): 984-990.doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20191230.403.

劉金蓮, 張睿, 劉曄斌, 等.諾麗的文獻研究及中藥藥性理論探討 [J].中國中藥雜志, 2020, 45(5): 984-990.doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20191230.403.

[2] RUAN Y L.Signaling role of sucrose metabolism in development [J].Mol Plant, 2012, 5(4): 763-765.doi: 10.1093/mp/sss046.

[3] GRANOT D, DAVID-SCHWARTZ R, KELLY G.Hexose kinases and their role in sugar-sensing and plant development [J].Front Plant Sci, 2013, 4: 44.doi: 10.3389/fpls.2013.00044.

[4] GRANOT D, KELLY G, STEIN O, et al.Substantial roles of hexo- kinase and fructokinase in the effects of sugars on plant physiology and development [J].J Exp Bot, 2014, 65(3): 809-819.doi: 10.1093/jxb/ ert400.

[5] RIGGS J W, CAVALES P C, CHAPIRO S M, et al.Identification and biochemical characterization of the fructokinase gene family in[J].BMC Plant Biol, 2017, 17(1): 83.doi: 10.1186/s 12870-017-1031-5.

[6] ROLLAND F, BAENA-GONZALEZ E, SHEEN J.Sugar sensing and signaling in plants: conserved and novel mechanisms [J].Annu Rev Plant Biol, 2006, 57(1): 675-709.doi: 10.1146/annurev.arplant.57.032 905.105441.

[7] YAO Y, GENG M T, WU X H, et al.Identification, expression, and functional analysis of the fructokinase gene family in cassava [J].Int J Mol Sci, 2017, 18(11): 2398.doi: 10.3390/ijms18112398.

[8] QIN Q P, ZHANG S L, CHEN J W, et al.Isolation and expression analysis of fructokinase genes from[J].Acta Bot Sin, 2004, 46 (12): 1408-1415.

[9] QIN Q P, CUI Y Y, ZHANG L L, et al.Isolation and induced expre- ssion of a fructokinase gene from loquat [J].Russ J Plant Physl, 2014, 61(3): 289-297.doi: 10.1134/S1021443714030121.

[10] YANG F C, MAO X Y, LIU J X, et al.Variation of major environ- mental factors (temperature and precipitation) in Yuanjiang Dry-hot Valley and the response of pteridophytes [J].J Trop Subtrop Bot, 2020, 28(6): 537-546.doi: 10.11926/jtsb.4198.

楊逢春, 毛曉葉, 劉景欣, 等.元江干熱河谷主要環(huán)境因子(氣溫和降水)變化規(guī)律及蕨類植物的分布響應 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2020, 28(6): 537-546.doi: 10.11926/jtsb.4198.

[11] SHUAI L, XUE X Q, NIU J J, et al.Analyses of the fructokinase activity and its gene expression during the development of longan fruits [J].J S China Agric Univ, 2015, 36(5): 99-104.doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2015.05.017.

帥良, 薛曉清, 牛佳佳, 等.龍眼果實發(fā)育過程中果糖激酶活性及其基因表達分析 [J].華南農業(yè)大學學報, 2015, 36(5): 99-104.doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2015.05.017.

[12] WU T, LAN Z Q, WANG H F.Cloning and development of real-time fluorescence quantitative PCR assay ofgene fragment from Noni [J].J CS Univ For Technol, 2018, 38(2): 16-22.doi: 10.14067/j.cnki.1673-923x.2018.02.003.

吳田, 藍增全, 王華芳.諾麗基因片段克隆及實時熒光定量PCR方法的建立 [J].中南林業(yè)科技大學學報, 2018, 38(2): 16-22.doi: 10.14067/j.cnki.1673-923x.2018.02.003.

[13] CHOU K C, SHEN H B.Cell-PLoc: A package of Web servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms [J].Nat Protoc, 2008, 3(2): 153-162.doi: 10.1038/nprot.2007.494.

[14] KROGH A, LARSSON B, VON HEIJNE G, et al.Predicting trans- membrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes [J].J Mol Biol, 2001, 305(3): 567-580.doi: 10.1006/jmbi.2000.4315.

[15] LIN J B, WANG W Y, ZOU H, et al.Analysis of related genes in phytosterol biosynthesis inbased on trans- criptome sequencing technology [J].J Trop Subtrop Bot, 2019, 27(6): 693-701.doi: 10.11926/jtsb.4025.

林江波, 王偉英, 鄒暉, 等.基于轉錄組測序的鐵皮石斛植物甾醇生物合成相關基因分析 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2019, 27(6): 693-701.doi: 10.11926/jtsb.4025.

[16] HU D Y, ZHANG Z X, LIU J, et al.Expression analysis of ethylene regulates related genes infruit based on transcri- ptome sequencing [J].J Sichuan Agric Univ, 2020, 38(5): 528-537.doi: 10.16036/j.issn.1000-2650.2020.05.004.

胡丹焱, 張正雪, 劉娟, 等.基于轉錄組測序的海巴戟果實中乙烯調控相關基因表達分析 [J].四川農業(yè)大學學報, 2020, 38(5): 528- 537.doi: 10.16036/j.issn.1000-2650.2020.05.004.

[17] WANG T L, YE H X, ZHENG J R, et al.Research progress of main flavor compounds in tomato fruits [J].Acta Agric Zhejiang, 2020, 32 (8): 1513-1522.doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2020.08.22.

王同林, 葉紅霞, 鄭積榮, 等.番茄果實中主要風味物質研究進展 [J].浙江農業(yè)學報, 2020, 32(8): 1513-1522.doi: 10.3969/j.issn.1004- 1524.2020.08.22.

[18] HUA W P, ZHANG Y, SONG J, et al.transcriptome sequencing into identify genes involved in the biosynthesis of active ingredients [J].Genomics, 2011, 98(4): 272-279.doi: 10.1016/j.ygeno.2011.03.012.

[19] QI H Y, LI T L, LIU H T, et al.Studies on carbohydrate content and sucrose-metabolizing enzymes activities in different parts of tomato [J].Acta Hort Sin, 2005, 32(2): 239-243.doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.2005.02.010.

齊紅巖, 李天來, 劉海濤, 等.番茄不同部位中糖含量和相關酶活性的研究 [J].園藝學報, 2005, 32(2): 239-243.doi: 10.3321/j.issn: 0513-353X.2005.02.010.

[20] QIN Q P, ZHANG S L, XIE M, et al.Progress on the research of the molecular regulation of sugar content and composition in fruit [J].J Fruit Sci, 2005, 22(5): 519-525.doi: 10.3969/j.issn.1009-9980.2005.05.019.

秦巧平, 張上隆, 謝鳴, 等.果實糖含量及成分調控的分子生物學研究進展 [J].果樹學報, 2005, 22(5): 519-525.doi: 10.3969/j.issn.1009-9980.2005.05.019.

[21] Lü W Y, ZHANG L Q, GAO Q H, et al.Cloning and expression analysis of fructokinase genefrom ‘Benihoppe’ strawberry [J].Acta Agric Shanghai, 2020, 36(6): 1-5.doi: 10.15955/j.issn1000-3924.2020.06.01.

呂文遠, 張麗勍, 高清華, 等.‘紅顏’草莓中果糖激酶基因的克隆與表達分析 [J].上海農業(yè)學報, 2020, 36(6): 1-5.doi: 10.15955/j.issn1000-3924.2020.06.01.

[22] ZHAO J H, YIN Y, LI H X, et al.Cloning and expression analysis of fructokinase gene () from wolfberry (Linn.) [J].Acta Bot Boreali-Occid Sin, 2018, 38(5): 816-822.doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.2018.05.0816.

趙建華, 尹躍, 李浩霞, 等.枸杞果糖激酶基因的克隆及表達分析 [J].西北植物學報, 2018, 38(5): 816-822.doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.2018.05.0816.

[23] CHEN X, SHI L Y, SHAO J R, et al.Molecular cloning and expression analysis ofin Chinese bayberry during fruit ripening [J].Acta Hort Sin, 2016, 43(8): 1585-1592.doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2016- 0219.

陳馨, 施麗愉, 邵佳蓉, 等.楊梅果糖激酶基因的克隆及在成熟期果實中的表達分析 [J].園藝學報, 2016, 43(8): 1585-1592.doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0219.

[24] WANG W P, CUI N, YU Z H, et al.Cloning and expression analysis of fructokinase gene () from tomato fruit [J].Acta Agric Boreali-Sin, 2011, 26(3): 11-15.

王衛(wèi)平, 崔娜, 于志海, 等.番茄果實果糖激酶基因的克隆及其表達分析 [J].華北農學報, 2011, 26(3): 11-15.

[25] LI M J, FENG F J, CHENG L L.Expression patterns of genes involved in sugar metabolism and accumulation during apple fruit development [J].PLoS One, 2012, 7(3): e33055.doi: 10.1371/journal.pone.003 3055.

[26] ZHAO Z Z, ZHANG S L, CHEN J W, et al.The physiological mecha- nism on the difference of sugar accumulation in citrus varieties [J].Sci Agric Sin, 2002, 35(5): 541-545.

趙智中, 張上隆, 陳俊偉, 等.柑橘品種間糖積累差異的生理基礎 [J].中國農業(yè)科學, 2002, 35(5): 541-545.

[27] LIU J, LAN Z Q, WU T, et al.Transformation of non-seeded gene into noni root segment by[J].Biotechnology, 2018, 28(5): 473-477.doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.05.0082.

劉娟, 藍增全, 吳田, 等.農桿菌介導的無籽基因轉化諾麗根段 [J].生物技術, 2018, 28(5): 473-477.doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.05.0082.

[28] JIA D D, LAN Z Q, WU T.Studies on genetic transformation of seed- lessness gene to noni () with its stem segments as the explants [J].J SW Univ (Nat Sci), 2018, 40(9): 7-12.doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.09.002.

賈丹丹, 藍增全, 吳田.以諾麗莖段為外植體的無籽基因轉化研究 [J].西南大學學報(自然科學版), 2018, 40(9): 7-12.doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.09.002.

Changes in Fructose, Fructokinase and Its Gene induring Fruit Development

WANG Qingfen, GONG Shusen, BAI Yan, LIU Nian, WANG Peiyuan, WU Tian*

(Southwest Landscape Architecture Engineering Technology Research Center of National Forestryand Grassland Administration, Yunnan Functional Flower Resources and Industrialization Technology Engineering Research Center, College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences, Southwest Forestry University,Kunming 650224, China)

Toreveal the formation mechanism of fruit flavor in, the activity and expression pattern of fructokinase (FRK) gene during fruit development were studied.The results showed that the contents of fructose, sucrose and glucose in fruit ofaccumulated with the development of fruit, and reached the highest when the fruit was fully mature, while the activity of fructokinase decreased with the development of the fruit.The fructokinase gene, named aswas cloned fromfruit, with 984 bp ORF, encoding 327 amino acids, and the GenBank accession number was MW380742.The amino acid sequence of McFRK2 was similar to that of FRK2 of coffee () at 98%.By using qRT-PCR, the expression ofdecreased gradually during fruit development.When the fruit was ripe, the expression oftended to be stable, which was consistent with the change trend of fructokinase activity.Therefore,might be involved in glucose metabolism by regulating fructokinase activity in fruits, which plays an important role in regulating fruit flavor formation.

; Fructokinase gene; Sugar; Expression

10.11926/jtsb.4405

2021-03-02

2021-05-18

國家林業(yè)和草原局項目([2019]27); 云南省科技廳重點研發(fā)計劃項目(2019IB011)資助

This work was supported by the Projects of National Forestry and Grassland Administration (Grant No.[2019]27), and the Project for Key Research and Development in Yunnan (Grant No.2019IB011).

王青芬(1996～ )，女，碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究。E-mail: wangqingfen@swfu.edu.cn

通信作者Corresponding author.E-mail:wutianpotato@swfu.edu.cn