橄欖ISSR和RAPD遺傳多樣性分析和核心種質(zhì)構(gòu)建

賴瑞聯(lián), 陳瑾, 馮新, 韋曉霞, 陳義挺, 沈朝貴, 吳如健

橄欖ISSR和RAPD遺傳多樣性分析和核心種質(zhì)構(gòu)建

賴瑞聯(lián), 陳瑾, 馮新, 韋曉霞, 陳義挺, 沈朝貴, 吳如健*

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，福州 350013)

為揭示中國(guó)橄欖()種質(zhì)資源的遺傳多樣性，采用ISSR和RAPD標(biāo)記對(duì)橄欖主要分布區(qū)的86份種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建核心種質(zhì)。結(jié)果表明，基于UPGMA遺傳相似系數(shù)，86份種質(zhì)資源可分為3個(gè)大類；基于STRUCTURE模型聚類，可分為4個(gè)類群，這基本符合橄欖的地域性分布規(guī)律。采用ISSR和RAPD獲得的中國(guó)橄欖種質(zhì)資源的整體遺傳多樣性水平分別為0.284±0.169和0.244±0.163，多態(tài)性位點(diǎn)百分率分別為92.56%和100%，總遺傳分化系數(shù)分別為0.127和0.142，基因流分別為3.423和3.025，群體間遺傳相似系數(shù)分別為0.930和0.939，個(gè)體間遺傳相似系數(shù)分別為0.736和0.732。因此，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性主要來源于個(gè)體間的遺傳分化或變異，且這種遺傳多樣性存在明顯的地域性差異。

橄欖；遺傳多樣性；核心種質(zhì)；ISSR；RAPD

橄欖()又名青果，是國(guó)家衛(wèi)健委公布的藥食同源原料。作為《中國(guó)藥典》記載的傳統(tǒng)中藥材，橄欖各組織均有良好的藥用價(jià)值，其果實(shí)味甘澀酸、性平，具有生津、利咽、清肺、解毒等功效；根微苦性平，能夠清咽、祛濕、舒筋；核仁味甘性平，可潤(rùn)燥、解毒。最近的研究表明，橄欖富含多酚、類黃酮、氨基酸、脂肪酸、維生素C和礦質(zhì)元素等藥用成分，在抗氧化[1–2]、抗病毒[3]、抗菌消炎[4]以及緩解糖尿病[5]等方面均有很好的藥理活性。通常認(rèn)為，中國(guó)是橄欖種質(zhì)資源起源和遺傳多樣性中心[6]。作為我國(guó)重要的特色中藥資源，開展橄欖種質(zhì)資源研究對(duì)其資源保護(hù)和開發(fā)利用具有重要意義。

單重復(fù)序列間隔區(qū)(inter-simple sequence repeats,ISSR)和隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(random amplified poly- morphic DNA, RAPD)是物種遺傳多樣性研究中常見方法[7–8]。在橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中, ISSR和RAPD反應(yīng)體系已建立并進(jìn)行了改良[9–14]。楊培奎等[15–16]采用ISSR技術(shù)認(rèn)為廣東省粵東地區(qū)和潮汕地區(qū)橄欖遺傳多樣性水平較低，且與來源地和品種名關(guān)系不大；劉天亮[17]采用ISSR技術(shù)認(rèn)為橄欖遺傳多樣性與地理環(huán)境存在相關(guān)性，且福建省內(nèi)橄欖品種遺傳多樣性較為豐富；張明賢等[18]采用ISSR技術(shù)對(duì)福州市主栽橄欖品種和優(yōu)株進(jìn)行了鑒定。聶珍素[19]采用RAPD技術(shù)認(rèn)為福建省橄欖遺傳分化較大，遺傳背景較復(fù)雜。此外，SRAP (sequence- related amplified polymerphism)[19]和AFLP (amplified fragment length polymerphism)[20–21]等技術(shù)也在橄欖遺傳多樣性研究中應(yīng)用。然而，目前橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性研究多集中在較小地區(qū)范圍內(nèi)，且受樣本數(shù)量限制，研究結(jié)果難以代表整個(gè)中國(guó)橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系特征。此外，當(dāng)前研究方法主要使用單一技術(shù)分析橄欖遺傳背景，缺乏彼此之間相互驗(yàn)證，在一定程度上削弱了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠度。

核心種質(zhì)構(gòu)建一直是物種種質(zhì)資源研究的熱點(diǎn)[22]。常用的核心種質(zhì)取樣策略主要包括隨機(jī)取樣策略(completely random sampling strategy, R)和系統(tǒng)取樣策略，其中系統(tǒng)取樣策略又包括C (constand strategy)、P (proportional strategy)、L (logarithmic strategy)、S (square root strategy)、G (genetic diversity dependent strategy)和M (maximization strategy)等。Yonezawa等[23]提出遺傳冗余度(degree of genetic redundancy)為0.2～0.9，核心種質(zhì)的最適取樣比例為20%～30%，同時(shí)認(rèn)為G策略明顯優(yōu)于R、P、L、C策略。在橄欖核心種質(zhì)構(gòu)建方面，楊培奎[24]提出, 基于ISSR分析結(jié)果，依據(jù)Nei & Li計(jì)算遺傳距離和非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA法)聚類，采用G策略按樣本量總數(shù)的25%取樣時(shí)能獲得具有較高代表性的橄欖核心種質(zhì)庫(kù)。為進(jìn)一步揭示中國(guó)橄欖種群的遺傳多樣性，本研究基于ISSR和RAPD對(duì)主要分布區(qū)和產(chǎn)區(qū)的86份橄欖種質(zhì)資源進(jìn)行研究，系統(tǒng)揭示中國(guó)橄欖種質(zhì)資源的遺傳多樣性特征，并初步構(gòu)建核心種質(zhì)，以期為橄欖種質(zhì)資源保存研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的86份橄欖種質(zhì)資源采自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福州橄欖種質(zhì)資源圃，涵蓋了福建、廣東、廣西、四川和浙江等中國(guó)橄欖主要分布區(qū)的種質(zhì)資源(表1)。

1.2 方法

基因組DNA提取 采集生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的橄欖當(dāng)年新抽嫩葉，清水洗凈后用濾紙吸干, 迅速去除葉脈，隨后采用改良CTAB法提取橄欖基因組DNA。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)橄欖基因組DNA的純度，用超微量紫外光分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280，計(jì)算A260/A280和基因組DNA濃度。質(zhì)量和純度檢測(cè)合格后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增 采用混樣基因組DNA對(duì)26對(duì)ISSR引物[17,24]進(jìn)一步篩選，選取12對(duì)擴(kuò)增效率高、條帶清晰、重復(fù)性高、多態(tài)性好的引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增(表2)。ISSR-PCR擴(kuò)增體系為DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 12.5L，DNA模板50 ng, 引物0.8mol/L，用高壓ddH2O補(bǔ)足至終體積25L。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃變性30 s,退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35次循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。從26對(duì)RAPD引物[19,25]中選取9對(duì)最適引物進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增(表2), 擴(kuò)增體系為DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 12.5L, DNA模板50 ng，引物0.8mol/L，用高壓ddH2O補(bǔ)足至終體積25L。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；然后94 ℃變性1 min，退火1.5 min, 72 ℃延伸2 min,共45次循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶, 并拍照保存。

表1 橄欖種質(zhì)資源信息

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)

根據(jù)ISSR和RAPD電泳圖譜，將任意位點(diǎn)條帶記為1，相應(yīng)位點(diǎn)沒有條帶記為0，構(gòu)建1、0二元數(shù)據(jù)矩陣。采用Popgene 32分析橄欖的遺傳多樣性指數(shù)，包括觀測(cè)等位基因數(shù)(observed number of alleles,)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,)、Nei’s基因多樣性參數(shù)(Nei’s genetic diversity,)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index,)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(number of polymorphism loci,)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率(percentage of polymorphism loci,)等；采用NTSYS 2.10e分析遺傳相似系數(shù),基于遺傳距離采用UPGMA法制作聚類樹狀圖；參照Evanno等[26]的方法采用STRUCTURE 2.2構(gòu)建橄欖種質(zhì)資源模型聚類圖。

表2 試驗(yàn)所用ISSR和RAPD引物

1.4 核心種質(zhì)構(gòu)建

利用ISSR和RAPD電泳圖譜二元矩陣，參照楊培奎等[24]的方法，依據(jù)Nei & Li計(jì)算遺傳距離,采用UPGMA法進(jìn)行聚類。采用G策略確定各亞組的取樣比例，組內(nèi)取樣利用多次聚類隨機(jī)取樣的方法逐步刪減達(dá)到總樣本量的25%，若組內(nèi)只有1份樣本則直接選取構(gòu)成核心種質(zhì)。比較分析核心種質(zhì)和初始種質(zhì)的遺傳多樣性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 遺傳多態(tài)性分析

從圖1和表3可見，12條ISSR引物對(duì)86份橄欖種質(zhì)資源共擴(kuò)增出242條帶，其中231條多態(tài)性條帶，每條引物擴(kuò)增20.17條帶和19.25多態(tài)性條帶, 多態(tài)性百分率為95.45%。其中UBC889擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)性條帶百分率僅為82.61%,而UBC818、UBC825、UBC826、UBC840、UBC841和UBC855擴(kuò)增的多態(tài)性百分率均為100%。9條RAPD引物擴(kuò)增出160條帶，其中156條為多態(tài)性條帶，每條引物擴(kuò)增17.78條帶和17.33多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為97.50%。其中S58擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最少，多態(tài)性條帶百分率僅為88.89%，而SBS- A5、SBS-A15、SBS-I1、SBS-Q4和SBS-Q9的多態(tài)性百分率均為100%。這說明中國(guó)橄欖種質(zhì)資源具有較高水平的遺傳多態(tài)性，可能存在較高頻率的遺傳變異。

2.2 聚類分析

采用NTSYS 2.10e構(gòu)建了86份橄欖種質(zhì)資源的遺傳進(jìn)化樹(圖2)?；贗SSR分析，福建南安的‘埔垱1號(hào)’ (28)與其他種質(zhì)資源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其他85份橄欖種質(zhì)資源主要分為3大類(I-1、I-2、I-3)。I-1包含44份來自福建和3份來自廣東的種質(zhì)資源，其中I-1中福建福安的‘葡萄’(1)與其他種質(zhì)資源的遺傳距離較遠(yuǎn)，其余46份種質(zhì)資源又可分為2個(gè)亞類(I-1-1和I-1-2)。I-1-1包含23份種質(zhì)資源，主要來自福建中部或北部的福安、閩侯、閩清等地區(qū)；I-1-2的23份種質(zhì)資源主要來源于福建省緯度較低的莆田、上杭、永定、云霄、漳浦、詔安，少數(shù)來自廣東的電白和高州等?？梢?，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源親緣關(guān)系的地域性差異較為明顯。I-2包含21份種質(zhì)資源，其中4份來源于福建，分別是‘閩侯自來圓’ (11)、‘上杭三棱欖’ (40)、‘云霄穗橄欖’ (47)和‘長(zhǎng)泰野生欖’ (52)；8份來源于廣東的電白、高州、化州、揭西、饒平、信宜，其中還有2份與廣東較近的廣西浦北和大部分的四川種質(zhì)資源，初步認(rèn)為廣東、廣西和四川的橄欖種質(zhì)資源遺傳距離較近；此外，福建的‘上杭三棱欖’可能引種自廣東，這對(duì)橄欖同物異名現(xiàn)象起到了一定的校正作用。I-3包含17份種質(zhì)資源，其中大部分來自浙江瑞安和平陽,還有6份福建、1份廣東、1份廣西和1份四川的種質(zhì)資源，說明浙江橄欖種群與福建橄欖種群的種質(zhì)資源存在較多的遺傳交流，其遺傳相似性更高。整體上，基于ISSR的分類結(jié)果符合橄欖種質(zhì)資源的地域性分布，與所屬生態(tài)類型存在較大的相關(guān)性，來源于同一地區(qū)或生態(tài)類型區(qū)的種質(zhì)資源普遍存在較高的遺傳相似性。

圖1 ISSR和RAPD引物的擴(kuò)增結(jié)果。A: 引物UBC855; B: 引物SBS-A5; A和B所用Marker分別為DL5000和DL2000 Marker。

表3 橄欖的ISSR和RAPD擴(kuò)增結(jié)果

圖2 基于ISSR的橄欖聚類分析。1～86見表1。

基于RAPD分析(圖3)，來源于福建福安的‘葡萄’(1)、四川合江的‘合江二梭子’ (74)與其他種質(zhì)資源的遺傳距離較遠(yuǎn)，其余84份種質(zhì)資源可分為3個(gè)大類(II-1、II-2和II-3)。其中II-1和II-2各包含23份種質(zhì)資源，數(shù)量和樣本與基于ISSR聚類的I-1- 1和I-1-2完全一致。II-3包含38份樣本，涵蓋了基于ISSR聚類的I-2和I-3的絕大部分樣本，僅僅缺失四川合江的‘合江二梭子’ (74)，但增加了福建南安的‘埔垱1號(hào)’ (28)。從聚類的結(jié)果上看，基于ISSR和RAPD的分類具有極高的相似度，僅僅2份種質(zhì)資源的歸屬存在差異。進(jìn)一步分析表明，II-3又可分為3個(gè)亞類群(II-3-1、II-3-2和II-3-3)，其中II-3-1包含了I-3中的全部樣本，此外還增加了福建南安的‘埔垱1號(hào)’ (28)和福建上杭的‘小目欖’ (40); II-3-2包含了I-2的21份樣本中的15份，僅僅缺失福建閩清的‘甜欖35號(hào)’ (24)、福建上杭的‘上杭小目欖’ (40)、福建長(zhǎng)泰的‘野生欖’ (52)、廣東電白的‘馬路香欖’ (58)、四川合江的‘合江二梭子’ (74)和浙江瑞安的‘瑞安5號(hào)’ (83)；此外，II-3-3特異性從I-2分離出2份種質(zhì)資源，分別為福建閩清的‘甜欖35號(hào)’ (24)和浙江瑞安的‘瑞安5號(hào)’ (83)?？梢?，基于ISSR和RAPD的聚類結(jié)果僅‘葡萄’(1)、‘埔垱1號(hào)’ (28)和‘合江二梭子’ (74)的歸屬在大分類上存在較大差異，整體相似度達(dá)到96.51%，二者分類結(jié)果得到了相互驗(yàn)證，具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

假設(shè)86份橄欖種質(zhì)資源群體數(shù)為2～12，重復(fù)計(jì)算7次，結(jié)果表明，基于ISSR和RAPD獲得的對(duì)數(shù)似然函數(shù)值隨群體數(shù)的增加呈先上升后趨于平緩，并未出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)(圖4: A-1, B-1)。對(duì)K變化趨勢(shì)的分析表明，值取4時(shí)，ISSR和RAPD試驗(yàn)獲得的K值均達(dá)到峰值，分別為404.58和403.43 (圖4: A-2, B-2)。因此，基于ISSR和RAPD均將86份橄欖種質(zhì)資源分為4個(gè)類群。

從各樣本歸屬相應(yīng)群體的概率(值)上看，基于ISSR的橄欖種質(zhì)資源后驗(yàn)概率為0.547～0.996, 其中福建‘閩侯大粒黃’ (17)的分布概率值最低，僅為0.547，而福建詔安的‘新營(yíng)2號(hào)’ (54)、廣東饒平的‘新塘1號(hào)’ (66)、廣西浦北的‘豬欖3號(hào)’ (70)和浙江平陽的‘平陽6號(hào)’ (77)分布概率均達(dá)到0.996。此外，57份樣本的分布概率均在0.9以上，占總體樣本的66.28%，說明本研究的聚類結(jié)果可信度較高。4個(gè)類群分布標(biāo)注為i-1、i-2、i-3和i-4 (圖5: A)，i-1包含24份種質(zhì)資源均來源于福建，所歸屬樣本也與基于ISSR的NTSYS聚類結(jié)果I-1-1一致；i-2中的18份樣本的組成成分較為復(fù)雜，其中7份來源于福建，8份來源于浙江，廣東、廣西和四川各1份，與I-3的樣本基本一致；i-3中共有23份樣本，其中20份來源于福建，3份來源于廣東，與I-1-2的結(jié)果一致；i-4包含的橄欖樣本中，4份來源于福建、8份來源于廣東、2份來源于廣西、5份來源于四川和2份來源于浙江，與I-1的結(jié)果一致?；赗APD的橄欖種質(zhì)資源后驗(yàn)概率為0.336～ 0.995，其中福建閩侯的‘上灣檀香’ (8)、福建南安的‘埔垱2號(hào)’ (30)和浙江瑞安的‘瑞安3號(hào)’ (84)的概率值較低, 分別為0.342、0.397和0.336。從聚類的結(jié)果來看, 基于STRUCTURE的橄欖種質(zhì)資源RAPD聚類與NTSYS聚類幾乎一致(圖5: B)，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 ISSR (A)和RAPD (B)聚類對(duì)數(shù)似然函數(shù)值隨K變化趨勢(shì)及△K隨K變化趨勢(shì)

2.3 遺傳多樣性分析

UPGMA聚類和STRUCTURE聚類結(jié)果比較一致，采用Popgene 32對(duì)不同聚類群體間的遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行分析(表4), 基于ISSR聚類的3個(gè)群體的觀測(cè)等位基因、有效等位基因、Nei’s基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)信息指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率依次是I-1>I-2>I-3，但群體間的差異不大,尤其是Nei’s基因多樣性指數(shù)的差異非常小，從整體上看, 基于ISSR不同聚類群體的遺傳多樣性水平較為一致?；赗APD聚類的3個(gè)群體中，觀測(cè)等位基因、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率依次是II-3>II-2>II-1，與有效等位基因和香農(nóng)信息指數(shù)的變化趨勢(shì)不一致，而Nei’s基因多樣性指數(shù)依次是II-1>II-2>II-3，說明基于RAPD聚類的橄欖群體間存在遺傳多樣性差異。

2.4 遺傳分化與遺傳距離分析

從表5可見，基于ISSR分析，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源的總遺傳分化系數(shù)(G)為0.127，即87.3%的遺傳分化存在于群體內(nèi)，12.7%的遺傳分化來源于群體間，說明群體內(nèi)存在豐富的遺傳分化或遺傳變異。中國(guó)橄欖的基因流(N)為3.423，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.0，說明聚類獲得的不同群體間存在豐富的基因交流, 可能與不同地區(qū)頻繁的種質(zhì)交流有關(guān)。群體內(nèi)部個(gè)體間的遺傳多樣性(H)為0.244，總遺傳多樣性(H)為0.279，兩者之間的差異較小，說明橄欖遺傳多樣性主要來源于群體內(nèi)個(gè)體間，但群體間也存在一定水平的遺傳多樣性。與ISSR相比，基于RAPD聚類結(jié)果的總遺傳分化系數(shù)較大，而H、H和N均小于ISSR。

圖5 基于STRUCTURE 2.2的橄欖ISSR (A)和RAPD (B)聚類。1～86見表1。

表4 橄欖群體的遺傳多樣性

: 觀測(cè)等位基因數(shù);: 有效等位基因數(shù);: Nei基因多樣性指數(shù);: Shannon’s信息指數(shù);: 多態(tài)性位點(diǎn)數(shù);:多態(tài)性位點(diǎn)百分率。

: Observed number of alleles;: Effective number of alleles;: Nei’s genetic diversity index;: Shannon’s information index;: Number of polymorphism loci;: Percentage of polymorphism loci.

表5 橄欖群體的遺傳分化系數(shù)

從橄欖群體間的遺傳距離和遺傳相似性來看,基于ISSR或RAPD的不同類群間遺傳相似性較高,遺傳距離較近，群體間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.930和0.939，說明整體上中國(guó)橄欖種質(zhì)資源群體間的遺傳相似性較高?；贗SSR，86份橄欖種質(zhì)資源的平均遺傳相似系數(shù)為0.736，遺傳相似性最高的是福建的‘詔安新營(yíng)2號(hào)’和‘詔安材欖’，為0.897，而遺傳相似性最弱的是福建的‘上灣檀香’和四川的‘合江三白元’，僅為0.591?；赗APD，86份橄欖種質(zhì)資源的平均遺傳相似系數(shù)為0.732，遺傳相似性最高的是浙江的‘平陽2號(hào)’和‘瑞安1號(hào)’, 為0.919，而遺傳相似性最弱的是福建的‘葡萄’和‘小個(gè)子’，僅為0.50。可見，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源的遺傳多樣性與分布地域存在一定的相關(guān)性，同一地區(qū)或生態(tài)類型區(qū)的橄欖種質(zhì)資源具有較高的遺傳相似性。從整體上看，其遺傳多樣性可能主要來源于個(gè)體間的差異。

2.5 核心種質(zhì)構(gòu)建

采用G策略按25%取樣構(gòu)建86份橄欖種質(zhì)資源的核心種質(zhì)，核心種質(zhì)在ISSR的3個(gè)群體間的取樣量較為一致，RAPD中II-1和Ⅱ-2的取樣量也基本相同，但I(xiàn)I-3的取樣量較少。依據(jù)Nei & Li計(jì)算遺傳距離并多次UPGMA聚類獲得基于ISSR構(gòu)建的核心種質(zhì)包括‘葡萄’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘清欖1號(hào)’、‘閩清2號(hào)’、‘福欖1號(hào)’、‘南安埔垱1號(hào)’、‘南靖南高3號(hào)’、‘三都島4號(hào)’、‘上杭三棱欖’、‘漳浦18號(hào)’、‘漳浦7號(hào)’、‘長(zhǎng)泰野生欖’、‘鳳湖欖’、‘新塘1號(hào)’、‘豬欖2號(hào)’、‘合江二百圓’、‘合江大梭子’、‘合江丁香鼓’、‘瑞安2號(hào)’、‘瑞安5號(hào)’、‘瑞安3號(hào)’，其中福建13份，廣東2份，廣西1份，四川3份，浙江3份。這些樣本保留了初始種質(zhì)25.58%的樣本量，核心種質(zhì)的多態(tài)性位點(diǎn)保留率達(dá)到了94.20%，而觀測(cè)等位基因、有效等位基因、Nei’s基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)信息指數(shù)的保留率分別為97.29%、101.76%、103.52%和102.31% (表6)。此外，保留種質(zhì)除樣本數(shù)量多于核心種質(zhì)，其余多樣性指標(biāo)均小于核心種質(zhì)或與核心種質(zhì)接近, 說明基于ISSR構(gòu)建的中國(guó)橄欖核心種質(zhì)基本保存了初始種質(zhì)的絕大部分基因資源。

基于RAPD構(gòu)建的橄欖核心種質(zhì)包括‘葡萄’、‘四季橄欖3號(hào)’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘黃皮長(zhǎng)營(yíng)26號(hào)’、‘大粒黃’、‘檀頭’、‘梅溪鎮(zhèn)建新2號(hào)’、‘福欖1號(hào)’、‘池2號(hào)’、‘延平劍洲’、‘上杭三棱欖’、‘永定務(wù)田3號(hào)’、‘西濱劉坂3號(hào)’、‘云霄白欖’、‘漳浦18號(hào)’、‘漳浦7號(hào)’、‘電白二頭尖欖’、‘四和1號(hào)’、‘鳳湖欖’、‘合江二梭子’、‘瑞安2號(hào)’和‘瑞安5號(hào)’，其中福建17份、廣東3份、四川1份、浙江2份。核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)的26.74%樣本量，其多態(tài)性位點(diǎn)保留率為89.38%，觀測(cè)等位基因、有效等位基因、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)的保留率分別為94.70%、101.02%、101.24%和99.74%, 保留種質(zhì)和核心種質(zhì)的多樣性指數(shù)并無明顯差異但樣本數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于核心種質(zhì)(表6)。值得注意的是，基于ISSR和RAPD構(gòu)建的核心種質(zhì)均保留了‘葡萄’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘福欖1號(hào)’、‘上杭三棱欖’、‘漳浦18號(hào)’、‘漳浦7號(hào)’、‘鳳湖欖’、‘瑞安2號(hào)’和‘瑞安5號(hào)’，說明這些種質(zhì)資源具有重要保存價(jià)值。

表6 橄欖核心種質(zhì)和初始種質(zhì)遺傳多樣性比較

: 觀測(cè)等位基因數(shù);: 有效等位基因數(shù);: Nei基因多樣性指數(shù);: Shannon’s信息指數(shù);: 多態(tài)性位點(diǎn)數(shù);:多態(tài)性位點(diǎn)百分率。

: Observed number of alleles;: Effective number of alleles;: Nei’s genetic diversity index;: Shannon’s information index;: Number of polymorphism loci;: Percentage of polymorphism loci.

3 結(jié)論和討論

3.1 中國(guó)橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性存在明顯的地域性差異

本研究中，基于ISSR和RAPD標(biāo)記技術(shù)，絕大部分橄欖種質(zhì)資源的分類結(jié)果相似度較高，說明獲得的橄欖種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)具有較高準(zhǔn)確性和可靠度。其中，大部分福建的橄欖種質(zhì)資源聚為一

類，廣東、廣西和四川的樣本聚為一類，浙江和少數(shù)幾個(gè)其他地區(qū)的種質(zhì)聚為一類。可見，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性的地域性差異較為明顯，與所屬分布區(qū)生態(tài)類型存在較大相關(guān)性。該結(jié)果與前人的研究基本一致[17]。其中，廣東、廣西和四川的橄欖種群遺傳相似性較高，可能具有相同的起源，而整體上福建橄欖種群和浙江橄欖種群的親緣關(guān)系較近。通常，植物的遺傳多樣性主要來源于遺傳變異和基因交流，且受多個(gè)因素共同影響。首先由于地理位置關(guān)系，福建和浙江橄欖主栽區(qū)域的橄欖種質(zhì)資源交流頻繁，造成2地間的種質(zhì)資源存在豐富的基因交流，再加上浙江和福建同屬于中國(guó)橄欖凍害危險(xiǎn)性區(qū)域，經(jīng)過長(zhǎng)年累月環(huán)境適應(yīng)性篩選，種質(zhì)資源的進(jìn)化方向和遺傳變異的方向較一致，2種群間又存在高頻率的基因交流，因此其遺傳距離更近。而廣東、廣西和四川橄欖種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近，很可能這些地區(qū)之間存在相同的橄欖起源。然而，值得注意的是，部分橄欖種質(zhì)資源的歸屬并不完全按照地域性分布，如福建‘上杭三棱欖’和福建‘云霄穗橄欖’，與廣東橄欖種群的遺傳距離更近, 而這兩份橄欖種質(zhì)資源均可能由廣東引種而來。結(jié)合已有研究結(jié)果表明，基于分子標(biāo)記技術(shù)能夠在一定程度上對(duì)中國(guó)橄欖種質(zhì)資源的同物異名現(xiàn)象進(jìn)行校正，可作為橄欖品種鑒定的重要依據(jù)[21,27]。

3.2 中國(guó)橄欖種質(zhì)資源個(gè)體間的遺傳分化或變異形成了相對(duì)豐富的整體遺傳多樣性

種質(zhì)資源遺傳多樣性反映的是種群之間或種群內(nèi)個(gè)體間基因組成的差異，對(duì)物種的起源、進(jìn)化以及開發(fā)利用研究具有重要參考價(jià)值。其中，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)是種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的關(guān)鍵指標(biāo)，本研究中，基于ISSR的中國(guó)橄欖種質(zhì)資源整體遺傳多樣性水平(0.284±0.169)高于Nybom[28]報(bào)道的多種植物的平均水平(0.22～0.23)，說明整體上，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源遺傳多樣性水平相對(duì)豐富。同時(shí)，也高于廣東潮汕橄欖和粵東地區(qū)橄欖的遺傳多樣性水平[24]。此外，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源存在高水平的遺傳多態(tài)性，可能存在高頻遺傳變異。而總遺傳分化系數(shù)較低，說明大部分遺傳分化來源于群體內(nèi)部。群體間的平均遺傳相似系數(shù)遠(yuǎn)高于個(gè)體間, 進(jìn)一步說明個(gè)體間的遺傳變異是造成其高水平遺傳分化的主要原因。值得注意的是，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源總遺傳多樣性水平仍高于群體內(nèi)遺傳多樣性, 說明群體間的遺傳分化或變異依然存在，也是導(dǎo)致其遺傳多樣性呈現(xiàn)地域性差異的原因?；贗SSR和RAPD獲得的基因流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.0，表明中國(guó)橄欖種質(zhì)資源種群之間存在豐富的遺傳信息交流[29–30]。因此，中國(guó)橄欖種質(zhì)資源個(gè)體間的遺傳分化或變異形成了相對(duì)豐富的遺傳多樣性，但群體間的遺傳多樣性差異依然存在，而群體間高頻率的遺傳信息交流導(dǎo)致其群體間遺傳距離不斷縮小。

3.3 橄欖核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建策略

核心種質(zhì)是評(píng)價(jià)和利用種質(zhì)資源的重要切入點(diǎn)，是原始種質(zhì)的一個(gè)核心子集，必須同時(shí)具備代表性、多樣性和異質(zhì)性的特點(diǎn)。通過遺傳相似系數(shù)或遺傳距離篩除相同或相近的株系，重復(fù)聚類多次剔除構(gòu)建核心種質(zhì)是常用的技術(shù)手段之一[31]。本研究中，基于ISSR和RAPD構(gòu)建的核心種質(zhì)存在一定的差異，但均保留了‘葡萄’、‘大目埕橄欖王’、‘上灣檀香’、‘福欖1號(hào)’、‘上杭三棱欖’、‘漳浦18號(hào)’、‘漳浦7號(hào)’、‘鳳湖欖’、‘瑞安2號(hào)’和‘瑞安5號(hào)’等10份橄欖種質(zhì)資源，說明這些種質(zhì)資源具有重要保存價(jià)值。然而，雖然橄欖核心種質(zhì)的構(gòu)建最大限度保留了種質(zhì)的基因庫(kù)，但并不意味著保留種質(zhì)可以淘汰，一方面核心種質(zhì)或多或少丟失了部分原始種質(zhì)類型，另一方面所構(gòu)建核心種質(zhì)無法滿足某些性狀要求時(shí)依然要從保留種質(zhì)中獲取。此外，采用基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建的核心種質(zhì)忽略了表型性狀、農(nóng)藝性狀等方面的特征，往往不夠全面，還需要結(jié)合葉[32]、花[33]、果[34]等數(shù)據(jù)精確構(gòu)建核心種質(zhì)。橄欖核心種質(zhì)是種質(zhì)資源保存和研究的重點(diǎn)，后續(xù)還應(yīng)進(jìn)一步對(duì)其開展全面的鑒定評(píng)價(jià)，并在橄欖育種中充分有效地利用。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步加大現(xiàn)有資源圃的種質(zhì)資源的收集保存工作，使其更加全面地覆蓋中國(guó)橄欖大部分種質(zhì)資源，甚至越南、泰國(guó)、柬埔寨、老撾、緬甸、菲律賓和馬來西亞等世界其他分布區(qū)的橄欖種質(zhì)資源。在全面收集橄欖種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上構(gòu)建更具有代表性的橄欖核心種質(zhì)，為橄欖研究、育種和生產(chǎn)提供重要基礎(chǔ)。

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[33] WEI X X, LAI R L, CHEN J, et al.Studies on genetic diversity on inflorescence phenotypic characteristics ofgerm- plasm resource [J].J Trop Subtrop Bot, 2019, 27(1): 1–10.doi: 10.11926/jtsb.3940.

韋曉霞, 賴瑞聯(lián), 陳瑾, 等.橄欖種質(zhì)資源花序表型性狀遺傳多樣性研究 [J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2019, 27(1): 1–10.doi: 10.11926/ jtsb.3940.

[34] WU R J, WAN J F, WEI X X, et al.Fruit character diversity analysis and numerical classification of Chinese olive germplasm resources [J].J Fruit Sci, 2015, 32(5): 797–805.doi: 10.13925/j.cnki.gsxb.20150129.

吳如健, 萬繼鋒, 韋曉霞, 等.橄欖種質(zhì)資源果實(shí)表型性狀多樣性分析及其數(shù)量分類研究 [J].果樹學(xué)報(bào), 2015, 32(5): 797–805.doi: 10.13925/j.cnki.gsxb.20150129.

ISSR and RAPD Genetic Diversity Analysis and Core Germplasms Construction of

LAI Ruilian, CHEN Jin, FENG Xin, WEI Xiaoxia, CHEN Yiting, SHEN Chaogui, WU Rujian*

(Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013, China)

To reveal the genetic diversity of germplasm resources ofin China, the genetic diversity of 86 germplasms selected from the major distribution areas was studied by using ISSR and RAPD markers, and core germplasms were constructed.The results showed that 86 germplasms could be divided into 3 groups based on UPGMA genetic similarity, and 4 groups by using STRUCTURE cluster analysis, which basically conform to the regional distribution ofin China.The overall genetic diversity coefficient using ISSR and RAPD was 0.284±0.169 and 0.244±0.163, the percentage of polymorphism loci was 92.56% and 100%, the genetic differentiation coefficient was 0.127 and 0.142, the gene flow was 3.423 and 3.025, the average genetic similarity coefficient between populations was 0.930 and 0.939, and the average genetic similarity coefficient between individuals was 0.736 and 0.732.Therefore, it was suggested that the rich genetic diversity ofin China mainly caused by the genetic differentiation or variation among individuals, and there were obvious regional differences.

; Genetic diversity; Core germplasm; ISSR; RAPD

10.11926/jtsb.4437

2021-04-29

2021-06-02

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019J01110)；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種資源保護(hù)(熱帶作物)項(xiàng)目(151821301354052701)；福建省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源創(chuàng)新專項(xiàng)([2021]53)資助

This work was supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (Grant No.2019J01110); the Project of Species and Varieties Protection (Tropical Crops) of Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Grant No.151821301354052701); and the Project for Agricultural Germplasm Resources Innovation in Fujian (Grant No.[2021]53).

賴瑞聯(lián)(1990～ )，男，博士研究生，研究實(shí)習(xí)員，從事果樹生物技術(shù)與遺傳資源研究。E-mail: lairl0618@163.com

通信作者Corresponding author.E-mail:wurujian@126.com