高效好氧反硝化菌篩選及復(fù)合菌群脫氮特性研究*

杜 顏，李思盈，韓世博，艾云鶴

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資環(huán)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150038）

傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)主要分硝化、反硝化兩個(gè)處理階段，硝化階段好氧，反硝化階段則被認(rèn)為是嚴(yán)格的厭氧階段。直到20世紀(jì)70年代，J.M.Krul等人才首次證明了好氧反硝化反應(yīng)現(xiàn)象的存在。

因好氧反硝化可以在有氧條件下進(jìn)行反硝化，故在脫氮工藝中可省去缺氧池，從而減少構(gòu)筑物，縮小占地空間，降低建設(shè)成本；其次，反硝化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的堿度，可以與硝化過(guò)程中產(chǎn)生的酸中和，無(wú)需另外向反應(yīng)池中投加堿，節(jié)省了直接成本；再次好氧反硝化菌的繁殖周期短，反應(yīng)速度快，節(jié)省反應(yīng)步驟，縮短了反應(yīng)時(shí)間，減少了含氮化合物的逸出，為實(shí)際生產(chǎn)中的脫氮工藝拓展了思路，具有很好的應(yīng)用價(jià)值及廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。

本研究從活性污泥中篩選出了6株好氧反硝化細(xì)菌，對(duì)此6株菌進(jìn)行了單株菌的反硝化性能研究，并將其中對(duì)各種環(huán)境適用性好的3株菌進(jìn)行混合，進(jìn)行了混合菌群的反硝化效果實(shí)驗(yàn)，以期為好氧反硝化研究提供一定的幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株來(lái)源

冬季從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生活污水處理廠取污水處理反應(yīng)器中的活性污泥若干，經(jīng)過(guò)馴化和篩選，得到好氧反硝化菌6株。

1.1.2 主要試劑及儀器

乙二胺二乙酸二鈉（哈爾濱市化工試劑廠）；ZnSO4（天津市瑞金特有限公司）；CaCl2（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；FeSO4（天津市恒星化學(xué)試劑有限公司）；CoCl2（天津市化學(xué)試劑三廠）。以上試劑均為分析純。

T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（普析儀器科技有限公司）；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱（上海博迅設(shè)備廠）；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅設(shè)備廠）。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基KNO31g、KH2PO41g，F(xiàn)eCl20.5g，CaCl20.02g，MgSO41g，琥珀酸鈉8.5g，用蒸餾水稀釋至1L。

BTB培養(yǎng)基 丁二酸鈉8.5 g，KNO31g，KH2PO41g，CaCl20.2g，MgSO41g，F(xiàn)eCl20.5g，1%溴百里酚藍(lán)溶液1mL，瓊脂20g，定容至1L，調(diào)節(jié)pH值至7.2。

乙酸鈉培養(yǎng)基 乙酸鈉2.16g，NaNO30.61g，K2HPO41.76g，MgSO40.20g，CaCl20.02g，F(xiàn)eSO40.005g，瓊脂18g，用蒸餾水稀釋至1L，調(diào)節(jié)pH值為7.2。

檸檬酸鈉培養(yǎng)基 檸檬酸鈉1.0g，KNO31.0g，KH2PO41.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05g，CaCl20.2g，MgSO41.0g，瓊脂18g，1%溴百里香酚藍(lán)1mL，用蒸餾水稀釋至1L，調(diào)節(jié)pH值為6.8。

1.1.4 其它試劑

微量元素溶液 乙二胺四乙酸50.0g（AR哈爾濱 市 化 工 試 劑 廠），ZnSO42.2g，CaCl25.5g，MnCl25.06g，F(xiàn)eSO45.0g，CuSO41.57g，CoCl21.01g。

模擬廢 水水樣 葡 萄 糖0.206g，（NH4）2SO40.235g，K2HPO40.1g，Na2HPO40.1g·L-1，MgSO40.1g，微量元素溶液1mL·L-1，1% Fe（NH4）2·（SO4）2·6H2O溶液1mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 好氧反硝化菌的篩選

菌液的富集 取50mL活性污泥放于無(wú)菌三角瓶中，加入450mL的LB培養(yǎng)基，室溫下曝氣8h，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱30℃、150r·min-1培養(yǎng)8h，再室溫下曝氣8h后，放置30min，取上清液進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。

好氧反硝化菌株的初篩 取富集好的菌液上清液1mL，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，將稀釋好的菌液各取1mL接種于BTB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1d后，挑取培養(yǎng)基周?chē)優(yōu)樗{(lán)色且生長(zhǎng)情況良好的菌落，劃線接種于檸檬酸鈉培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)1d，以相同方法挑取生長(zhǎng)情況良好的菌落接種于乙酸鈉培養(yǎng)基繼續(xù)純化培養(yǎng)1d，選取生長(zhǎng)情況良好的菌落作為目的菌[4]。

好氧反硝化菌株的復(fù)篩 挑取目的菌加入無(wú)菌水，制成菌懸液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600，加入模擬廢水水樣、微量元素溶液，30℃培養(yǎng)1d，測(cè)定NO3-N去除率。

1.2.2 菌株的觀察及簡(jiǎn)單鑒定 將分離、純化好的菌株接種于檸檬酸鈉培養(yǎng)基上，24h后觀察其個(gè)體形態(tài)、菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭式染色鑒定。

1.2.3 菌株的脫氮特性研究 采用固定單因素法研究碳源、C/N比、pH值、接種量、溫度等影響因素對(duì)好氧反硝化作用的影響。

1.2.4 好氧反硝化菌群的脫氮性能研究 將篩選出來(lái)的6株菌等比例混合，在單菌株確定的最佳工藝條件下，測(cè)定其脫氮性能。

式中C1：反應(yīng)前NO3-N的含量，mg·L-1；C2：反應(yīng)后NO3-N的含量，mg·L-1。

1.2.5 分析鑒定方法 本實(shí)驗(yàn)中硝酸鹽-采用水質(zhì)硝酸鹽氮的測(cè)定紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 好氧反硝化菌的篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)好氧反硝化菌的富集篩選、分離純化，最終得到去除NO3-N效果良好的6株菌，分別命名為DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-5、DN-6，菌落特征見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌分離篩選結(jié)果Tab.1 Results of bacterial isolation and screening

由表1可見(jiàn)，篩選出的優(yōu)勢(shì)菌均為革蘭氏陰氏菌，其中5株菌為短桿菌，1株菌為球菌。

2.2 菌株的脫氮特性研究

2.2.1 不同碳源對(duì)NO3-N去除率的影響 為保證好氧反硝化菌的正常生長(zhǎng)及脫氮作用的正常進(jìn)行，在反應(yīng)過(guò)程中需要提供一定的碳源，因此，最佳碳源和C/N比的選擇對(duì)反應(yīng)尤為重要。本研究分別選擇了乙酸鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉3種有機(jī)物為碳源，以5%的接種量，在反應(yīng)溫度30℃，150r·min-1下培養(yǎng)48h，考察了不同碳源對(duì)NO3-N去除率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源對(duì)NO3-N去除率的影響Fig.1 Influence of different carbon sources for nitrate-N removal rate

由圖1可知，不同碳源下DN-1、DN-2、DN-5這3株菌的NO3-N去除率由低到高的順序是乙酸鈉＜葡萄糖＜檸檬酸鈉，DN-3、DN-4兩株菌的NO3-N去除率由低到高的順序是乙酸鈉＜檸檬酸鈉＜葡萄糖，DN-6的NO3-N去除率由低到高的順序是葡萄糖＜檸檬酸鈉＜乙酸鈉，其中DN-1、DN-2、DN-3 3株菌當(dāng)檸檬酸鈉為唯一碳源時(shí)的去除效果更加明顯，而DN-3、DN-4、DN-6這3株菌雖然檸檬酸鈉為碳源時(shí)去除率不是最大的，但也只是略低于其去除率最高的碳源。在6株菌中只有DN-6對(duì)3種碳源都有很好的利用率，而其它5株菌對(duì)乙酸鈉的利用率均不高。綜合以上原因，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以檸檬酸鈉為唯一碳源進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 不同C/N比對(duì)NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源，以5%的接種量，反應(yīng)溫度30℃，150r·min-1下培養(yǎng)48h，考察了C/N比為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1時(shí)，NO3-N去除率的情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同C/N比對(duì)NO3-N去除率的影響Fig.2 Effect of different C/N ratio on NO3-N removal rate

由圖2可見(jiàn)，DN-1、DN-3、DN-4、DN-6這4株菌NO3-N去除率的變化趨勢(shì)均是隨著C/N比的增加，去除率逐漸升高而后下降，這4株菌的最佳C/N比分別為8∶1、12∶1、8∶1、8∶1，DN-2菌株對(duì)NO3-N去除率隨著C/N比的增加而上升，C/N比為16∶1和20∶1去除效果比較接近，C/N比為20∶1時(shí)去除率最高，而DN-5菌株對(duì)NO3-N去除率隨著C/N比的增加而下降，去除效果最好的是C/N比為4∶1，即該種菌的C/N比最低。在好氧反硝化反應(yīng)過(guò)程中，C/N比過(guò)低，能源不足，提供的電子流小，影響了菌體生長(zhǎng)，降低了反硝化效果，但C/N比過(guò)高，不僅資源浪費(fèi)，而且過(guò)高的C/N比還會(huì)影響反硝化的效果[5]，故C/N比過(guò)低或過(guò)高均不適合脫氮效率的提高，綜合考慮以上因素，將本實(shí)驗(yàn)的C/N比定為8∶1。

2.2.3 不同pH值對(duì)NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源，C/N比為8∶1，以5%的接種量，反應(yīng)溫度30℃，150r·min-1下培養(yǎng)48h，考察了pH值為5、6、7、8、9時(shí)，NO3-N去除率的情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同pH值對(duì)NO3-N去除率的影響Fig.3 Effect of different pH ratio on NO3-N removal rate

由圖3可見(jiàn)，DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-6這5株菌NO3-N去除率的變化趨勢(shì)均是隨著pH值的增加，去除率逐漸升高而后略有下降，DN-1、DN-2、DN-3、DN-4這4株菌的最佳pH值為8，DN-6在pH值為7時(shí)去除率最高，為98.6%，DN-5的情況較為特殊，隨著pH值的增加，去除率一直增加，在pH值為8和9時(shí)，去除率相同，均為95.6%。在此6株菌中，DN-3、DN-6兩株菌的pH值適用范圍最寬，在pH值為5時(shí)，去除率可達(dá)到86%以上，在pH值為9時(shí)，去除率更是達(dá)到95.6%以上?？傮w來(lái)說(shuō)，這6株菌均在pH值為7～9處有最佳去除率。酸度過(guò)高或者過(guò)低不利于大多數(shù)菌的生長(zhǎng)，這主要是因?yàn)閜H值變化時(shí)，影響了微生物中酶的活性，改變了微生物的電解質(zhì)平衡，從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取能力，故不利于其生長(zhǎng)[6]。此結(jié)果也說(shuō)明，篩選出的好氧反硝化菌在中性偏弱堿性的環(huán)境中更易去除NO3-N。綜合考慮以上因素，將本實(shí)驗(yàn)的最佳pH值定為8。

2.2.4 不同溫度對(duì)NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源，C/N比為8∶1，以5%的接種量，pH值為8，150r·min-1下培養(yǎng)48h，考察了反應(yīng)溫度為15、20、30℃時(shí)，NO3-N去除率的情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同溫度對(duì)NO3-N去除率的影響Fig.4 Effect of different temperatures on NO3-N removal rate

由圖4可知，6株菌NO3-N去除率的變化趨勢(shì)均是隨著溫度的增加逐漸升高，當(dāng)溫度由15℃升高到30℃時(shí)，DN-4和DN-5兩株菌的NO3-N去除率受溫度影響變化比較大，去除率分別增加了10.97%和11.31%，而DN-2和DN-6兩株菌的NO3-N去除率受溫度影響比較小，當(dāng)溫度由15℃升高到30℃時(shí)，去除率分別增加了2.09%和2.79%。結(jié)果表明，升高溫度對(duì)于NO3-N的去除有一定的效果，但相對(duì)來(lái)說(shuō)，篩選出的菌株在15～30℃，均能保持比較高的活性，這與取樣的季節(jié)為冬季，水體溫度較低，菌株已受到一定的自然馴化不無(wú)關(guān)系。

2.2.5 不同接種量對(duì)NO3-N去除率的影響 選擇檸檬酸鈉為唯一碳源，C/N比為8∶1，溫度為30℃，pH值為8，150r·min-1下培養(yǎng)48h，考察了接種量為2%、5%、7%和10%時(shí)，NO3-N去除率的情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，DN-1、DN-2、DN-3、DN-4、DN-6這5株菌NO3-N去除率的變化趨勢(shì)均是隨著接種量的增加，去除率逐漸升高而后略有下降，其最佳接種量分別為7%、5%、7%、5%、7%，只有DN-2在2%處即達(dá)到最大去除率97.37%，繼續(xù)增加接種量，其去除率反而下降。出現(xiàn)上述情況的原因是，如果在反應(yīng)過(guò)程中接種量不足，菌的數(shù)量少，會(huì)達(dá)不到脫氮的預(yù)期效果；而接種量過(guò)大，則會(huì)引起競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，使部分細(xì)菌死亡[7]。所以，選擇適量的接種量，對(duì)于脫氮的效果很關(guān)鍵?？紤]到在接種量為2%時(shí)，6株菌的去除率均已達(dá)到93%以上，故工藝最佳接種量定為2%。

圖5 不同接種量對(duì)NO3-N去除率的影響Fig.5 Effect of different inoculation amount on NO3-N removal rate

2.2.6 好氧反硝化菌群的脫氮特性研究 依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，選擇各種碳源利用高并且溫度、pH值適用范圍廣的DN-6，C/N比需求最低的DN-5，和在最小接種量下NO3-N去除率仍可達(dá)97.4%的DN-2，以相同比例將3株菌混合組成好氧反硝化菌群，選擇檸檬酸鈉為唯一碳源，C/N比為4∶1，溫度為30℃，pH值為8，接種量為2%，150r·min-1下培養(yǎng)48h后，進(jìn)行NO3-N去除率的情況研究，復(fù)合菌與單株菌的NO3-N去除率的對(duì)比見(jiàn)圖6。

由圖6可知，復(fù)合菌群的NO3-N的去除率達(dá)98.6%，好于任何一株單株菌。主要的原因是在混合菌群中，各種菌的共存和相互作用產(chǎn)生了群體感應(yīng)、互利共生等作用，使混合菌的脫氮能力有了一定程度的提高。另外，在實(shí)際水處理過(guò)程中，水質(zhì)成分一般比較復(fù)雜，單株菌的降解能力有限，利用菌群中各種菌的協(xié)同作用，會(huì)對(duì)脫氮性能有很大的提高[8-11]。

3 結(jié)論

本研究篩選分離得到了6株好氧反硝化細(xì)菌，并選擇其中適用性好的3株菌組成復(fù)合菌群，結(jié)論如下：

（1）篩選得到的6株菌均在檸檬酸鈉為碳源的情況下有較好的脫氮效果，DN-6對(duì)3種碳源都有很好的利用率。

（2）C/N比為8∶1時(shí)，6株菌的脫氮效果綜合考慮比較理想。

（3）溫度高對(duì)于脫氮有利，相對(duì)來(lái)說(shuō)，6菌株適用的溫度范圍比較大。

（4）將篩選出的3株菌制成復(fù)合菌群，效果明顯好于單株菌。

實(shí)驗(yàn)表明，選擇好氧反硝化菌群更有利于脫氮效果的提高，在實(shí)際應(yīng)用中，由于其適應(yīng)能力更強(qiáng)，將具有更好的應(yīng)用價(jià)值。