基于RNA-seq的脂代謝相關(guān)基因Tmem176a功能分析

崔茂生, 段維旺, 李曉寧，湯 晨，李 凱, 周宇荀, 肖君華

(東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620)

隨著人們飲食營養(yǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而越來越偏向高脂化，動脈粥樣硬化[1]、冠心病[2]等心腦血管疾病發(fā)病率逐年升高。肝臟組織作為人體主要的脂質(zhì)代謝器官，參與了脂質(zhì)消化、吸收、合成、分解、運輸?shù)壬磉^程。因此，研究人員一直致力于尋找肝臟中與高脂響應相關(guān)的潛在基因，這對預防和治療高脂血癥具有重要意義。

Tmem176a屬于跨膜蛋白位于人類染色體7q36.1，作為腫瘤早期診斷的生物標志物具有很高的臨床價值。據(jù)報道，在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)生雜合性丟失，Tmem176a啟動子在人類結(jié)直腸癌[3-4]和食管癌[5]中頻繁甲基化，并在這些癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而Tmem176a在膠質(zhì)母細胞瘤[6](GBMs)中具有腫瘤促進作用，并在細胞凋亡中起到中心作用，體現(xiàn)出Tmem176a功能具有組織特異性。

本研究使用Tmem176a的過表達載體plenti-CMV-Tmem176a-3FLAG-P2A-EGFP和siRNA-Tmem176a轉(zhuǎn)染小鼠肝癌Hepa1-6細胞，將過表達、敲低的Tmem176a的Hepa1-6細胞進行RNA-seq分析，通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行整理挖掘，利用生物信息學算法對差異表達基因進行基因GO注釋和KEGG通路富集分析，為解析Tmem176a調(diào)控脂質(zhì)代謝機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠肝癌Hepa1-6細胞，購自中國科學院細胞庫,測序樣本信息如表1所示，慢病毒表達載體Plenti-CMV-MCS-3FLAG-P2A-EGFP由本實驗室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基購自上海元象生物科技有限公司；胰酶購自上海元象生物科技有限公司；PBS緩沖液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清購自Gbico USA；Lipofectamine TM 3000購自InvitrogenUSA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo USA；qPCR試劑盒購自近岸蛋白科技有限公司。

表1 RNA-seq樣本信息

1.2 方法

1.2.1Tmem176a慢病毒過表達載體的構(gòu)建及siRNA的設(shè)計

通過NCBI找到小鼠Tmem176a的基因編碼序列(CDS)，通過同源重組方法將Tmem176a的CDS導入Plenti-CMV-MCS-3FLAG-P2A-EGFP載體、純化、轉(zhuǎn)化進大腸桿菌、測序。siRNA設(shè)計原則：(1)從 mRNA 序列的 AUG 起始密碼開始，尋找 AA 二連序列并將其3′端的 19nt 作為潛在的 siRNA 靶點，一般越靠近靶基因 3′端其基因沉默效果可能越出色。(2)序列的GC含量應該為30%～60%。(3)非編碼區(qū)有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，會影響 siRNA核酸內(nèi)切酶復合物結(jié)合 mRNA 從而影響基因沉默的效果，因此要避免在此區(qū)域內(nèi)挑選 siRNA。將挑選的序列進行 BLAST 以確保目的序列與其他基因沒有同源性。同源重組引物及siRNA設(shè)計如表2所示。

表2 同源重組引物及siRNA設(shè)計

1.2.2 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

將每種樣本細胞按照每孔2×105個細胞的密度接種于24孔板上，待細胞貼壁且培養(yǎng)至80%的匯合度后進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染進肝癌Hepa1-6細胞48 h后將細胞取出進行RNA抽提，建庫，利用Illumina Hiseq測序儀上機測序，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估采用軟件FastQC(version 0.10.1)進行分析，對低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)過濾采用軟件Cutadapt(version1.9.1)，參考序列的比對分析采用軟件Hisat2(version 2.0.1)。轉(zhuǎn)錄組功能注釋采用差異基因表達分析EdgeR(version 3.4.6)、GO enrichment分析Goseq(version 1.34.1)與 GO(Gene ontologyhttp:∥geneontology.org/)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https:∥www.genome.jp/)，與公共數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，發(fā)現(xiàn)具有較高同源性/相似性的序列。

1.2.3 qPCR驗證

采用Thermo Fisher Sicentific公司的First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按操作說明進行1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，包括4個過表達Tmem176a后基因B3gnt6、Rab40b、Klhl30、H2-Q2，包括4個敲低Tmem176a后基因Prelid3a、Dipk1b、Cdhrl、Aqp1。使用ddH2O將得到的cDNA進行10倍稀釋。按照下列體系進行qPCR檢測：10 μL SuperRealPreMix Plus，0.4 μL ROX，2.5 μL cDNA模板，300 nmol/L的上下游引物，補水至20 μL。采用兩步法PCR反應程序進行反應：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火 32 s，40個循環(huán)，每個樣本做3次重復。結(jié)果使用相對定量的方法進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。試驗結(jié)果使用GraphPad Prism軟件，各組間比較采用t檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 將Tmem176a的過表達載體和siRNA-Tmem176a轉(zhuǎn)染進Hepa1-6細胞中

將Plenti-CMV-Tmem176a-3FLAG-P2A-載體和si-RNA轉(zhuǎn)染進Hepa1-6細胞，72 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，確定過表達載體轉(zhuǎn)染進Hepa1-6細胞，轉(zhuǎn)染效率約為35%。過表達和敲低Tmem176a后基因相對表達量變化如圖1所示。

(a)過表達Tmem176a;(b)敲低Tmem176a。* 表示顯著；** 表示較為顯著；**** 表示極其顯著。

2.2 過表達、敲低Tmem176a后的Hepa1-6細胞RNA-seq結(jié)果

2.2.1 過表達、敲低Tmem176a后差異基因的GO分析

使用OmicShare平臺GO富集工具進行GO分析，使用R繪制結(jié)果如圖2所示，這些DEGs生物學過程(biological process，BP)主要參與了生物、脂質(zhì)代謝過程、氧化還原過程、定位、對脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)代謝過程等。在細胞組分(cellerular component，CC)方面，DEGs富集于質(zhì)膜成分、細胞表面等。在分子功能(molecular function，MF)方面，DEGs富集于鈣離子結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運活性、T細胞受體活性、磷脂結(jié)合等功能。

(a)OE-Tmem176a;(b)KD-Tmem176a。

2.2.2 過表達、敲低Tmem176a后差異基因的KEGG分析

使用OmicShare平臺GO富集工具進行KEGG分析, 使用R 繪制結(jié)果如圖3所示，這些DEGs生物學過程主要參與了PPAR信號通路、脂肪的消化和吸收、酪氨酸代謝、膽固醇代謝、鈣信號通路、蛋白消化和吸收、PI3K-Akt信號通路、膽汁分泌、AMPK通路等。KEGG富集到的與脂質(zhì)代謝相關(guān)的通路較多，表明Tmem176a過表達、敲低后，Hepa1-6細胞脂質(zhì)代謝通路發(fā)生顯著性變化。

(a)OE-Tmem176a;(b)KD-Tmem176a。

2.3 聚類分析

為了進一步確認過表達、敲低Tmem176a后差異表達基因，將差異表達基因進行層次聚類分析，篩選依據(jù)為每個基因在每組樣本間的FPKM值之和≥10、P<0.05，過濾，過表達、敲低Tmem176a后差異表達基因數(shù)量分別為322、952，使用R繪制結(jié)果如圖4所示，可以看到過表達、敲低差異基因可以分為兩類。

(a)表示過表達Tmem176a后差異基因熱圖；(b)表示敲低Tmem176a后差異基因熱圖。圖下方代表樣本名稱，紅色DEGs代表上調(diào)的差異基因，藍色的DEGs代表下調(diào)的差異基因,上方分支樹為聚類樣本，左側(cè)分支樹為差異基因聚類，顏色由藍至紅表示基因表達量提高。

2.5 qPCR驗證

分別從過表達、敲低的RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)果中隨機挑選4個差異基因進行qPCR驗證，其中過表達Tmem176a后B3gnt6、Rab40b、H2-Q2、Klhl30變化了0.23、0.41、22.05、30.95倍，敲低Tmem176a后Aqp1、Trac、Prelid3a、Dipk1b變化了0.26、0.38、37.48、36.84倍。與RNA-seq結(jié)果進行比較，過表達Tmem176a后B3gnt6、Rab40b、H2-Q2、Klhl30的Fold Change值分別變?yōu)?5.48(下調(diào))、-5.18(下調(diào))、4.03(上調(diào))、5.22(上調(diào))，敲低Tmem176a后Aqp1、Trac、Prelid3a、Dipk1b FoldChange值分別變?yōu)?5.49(下調(diào))、-5.82(下調(diào))、5.48(上調(diào))、5.50(上調(diào))，qPCR結(jié)果如圖5所示。qPCR數(shù)據(jù)與RNA-seq結(jié)果變化趨勢一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

(a)過表達Tmem176a;(b)敲低Tmem176a。

3 討論

試驗前期通過WGCNA(加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析)、QTL(數(shù)量性狀定位)[7-8]、NGS(二代測序)[9-10]等手段初步鑒定了大量和血脂代謝相關(guān)的候選基因，本研究前期利用生物信息學方法分析，從39個候選基因中篩選出Tmem176a作為脂質(zhì)代謝候選基因。RNA-seq[11-12]數(shù)據(jù)等結(jié)果表明Tmem176a過表達、敲低后會影響細胞內(nèi)多個基因的表達。這些差異表達基因GO、KEGG、聚類分析結(jié)果均顯示它們與血脂代謝密切相關(guān)，這也恰恰說明Tmem176a可能作為中樞基因來調(diào)控復雜的血脂代謝網(wǎng)絡(luò)。因此，基于以上分析結(jié)果，初步認為Tmem176a基因參與血脂代謝的過程且發(fā)揮重要的作用，但是具體的分子機制仍需要大量的試驗研究。目前，對Tmem176a基因在小鼠層面的研究較少，大多數(shù)集中在人類且報道參與了肝癌[13-14]、食道癌、直腸癌、胃癌[15-16]等癌癥進展。但是，Tmem176a基因的表達產(chǎn)物是一種跨膜蛋白，為什么會與血脂代謝的陽性基因Srebf2的基因表達譜類似并且參與到血脂代謝，猜測在小鼠中Tmem176a可能作為通道蛋白或是轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)助脂質(zhì)小分子進出細胞，也可能像別的跨膜蛋白如LDL受體一樣能夠與載脂蛋白結(jié)合，或如CD36跨膜蛋白一樣通過識別脂肪酸從而參與到脂肪酸轉(zhuǎn)運中。

本研究是針對小鼠肝癌細胞模型檢測小鼠肝癌細胞基因表達譜，與小鼠正常細胞基因表達譜相比較可能存在差異。在代謝方面，肝癌細胞也和正常細胞存在差異。正常細胞通過新陳代謝的方式，維持正常的生命活動；癌細胞在代謝方面不同于正常的組織細胞，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的異常旺盛，這樣可能使其代謝方式與正常細胞相比較而言出現(xiàn)較大差異。

對細胞表型和動物表型的研究來說，單基因表達水平的變化在體外、體內(nèi)試驗中對血脂水平并不一定會產(chǎn)生顯著影響，因此建立與人類血脂代謝相似的細胞模型和動物模型成為試驗研究的重點。雖然國內(nèi)外血脂代謝的研究主要采用高脂小鼠[17]、KO小鼠(Knockout Mouse)[18]及轉(zhuǎn)基因小鼠等，但動物模型周期長和花費大的特點使得其不適合基因的廣泛驗證。

研究表明，Tmem176a過表達、敲低后都會影響脂質(zhì)基因表達水平，Tmem176a通過影響脂肪的消化吸收、膽固醇代謝、甘油酯代謝、脂肪酸合成等代謝途徑參與到脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中。這一研究結(jié)果為脂質(zhì)代謝候選基因的挖掘提供新的發(fā)現(xiàn)，為小鼠脂質(zhì)代謝理論研究奠定基礎(chǔ)。