嵌合抗原受體T細(xì)胞靶向PD-L1的初步研究①

彭群藝 朱雄鵬 李純團(tuán) 辛鵬亮 鄭艷

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院，泉州 362000）

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞技術(shù)是通過基因工程方法合成的抗原受體T細(xì)胞，可靶向識別細(xì)胞表面抗原，并直接殺傷靶細(xì)胞，從而繞過了傳統(tǒng)的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）免疫激活途徑，具有MHC非限制性特點。其主要結(jié)構(gòu)涉及識別抗原的單鏈抗體可變區(qū)片段（single chain antibody variable fragments，scFvs）、鉸鏈或間隔區(qū)、跨膜區(qū)、T細(xì)胞受體β鏈CD3ζ（T細(xì)胞活化第一信號）和協(xié)同刺激信號結(jié)構(gòu)域（T細(xì)胞活化第二信號）等［1-3］。通過構(gòu)建不同scFv結(jié)合特異性抗原，具有治療多種腫瘤疾病的廣泛前景。CD19特異性CART細(xì)胞可有效殺滅B淋巴腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)長期的完全緩解，為復(fù)發(fā)和難治性淋巴細(xì)胞白血病治療提供新的治療手段［4-6］。

雖然CART細(xì)胞治療在血液腫瘤取得了可喜成績，但仍存在諸多局限，伴有嚴(yán)重副反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放癥狀、腦病和B細(xì)胞再生障礙等［7］。CART細(xì)胞治療在實體腫瘤治療方面也面臨巨大挑戰(zhàn)［8-9］。多種腫瘤細(xì)胞缺少表達(dá)腫瘤特異性的抗原，CART針對的抗原為腫瘤相關(guān)性抗原，這種抗原在正常組織中也有低表達(dá)，因此CART細(xì)胞也可能對正常器官組織抗原產(chǎn)生應(yīng)答，將導(dǎo)致災(zāi)難性后果［10-11］。

免疫檢查點PD-1也可抑制CART細(xì)胞功能，影響CART細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌。CART細(xì)胞治療聯(lián)合PD-1抗體治療可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)，在實體瘤治療方面取得突破性進(jìn)展［12］。但PD-1/PD-L1抗體治療本身仍依賴T細(xì)胞對腫瘤進(jìn)行免疫應(yīng)答，且PD-1抗體治療本身也存在多種副反應(yīng)，影響皮膚、消化道、肝臟、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及其他器官，可能與PD-1抗體介導(dǎo)的自身免疫有關(guān)［13-14］。

本研究擬以免疫檢查點阻斷為策略，將免疫檢測點抑制劑序列整合至CART細(xì)胞，借助CART技術(shù)構(gòu)建一種新的抗PD-L1的CART細(xì)胞（αPDL1-CART細(xì)胞），其胞外是能結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面配體PD-L1的抗PD-L1 scFv，胞內(nèi)含有4-1BB、CD3ζ等提供T細(xì)胞活化刺激信號，一方面利用CART細(xì)胞通過非MHC限制性方式直接殺傷PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞，另一方面可阻斷PD-1/PD-L1通路，為CART細(xì)胞提供靶向性優(yōu)勢，表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞不僅不會抑制CART細(xì)胞活性，反而增強(qiáng)CART細(xì)胞殺傷作用，進(jìn)一步增強(qiáng)其對淋巴瘤細(xì)胞的殺傷性。將兩者結(jié)合，以免疫阻斷和CART結(jié)合方式進(jìn)一步加強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，打破腫瘤免疫耐受，為進(jìn)一步改造雙靶向受體CART結(jié)合免疫檢查點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco）；慢病毒（GeneChem）；Annexin V-FITC（美 國BD）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD）；TE2000-U熒光顯微鏡（日本Nikon）。

1.2 方法

1.2.1 αPDL1-CAR病毒載體構(gòu)建和包裝αPDL1-CAR主要由胞外的anti-PD-L1 scFv（MEDI4736）、胞內(nèi)的CD137和CD3ζ組成［15-16］。胞內(nèi)信號區(qū)末端通過2A自我剪切肽序列連接1個協(xié)同表達(dá)的EGFP綠色熒光標(biāo)志蛋白以監(jiān)測αPDL1-CAR轉(zhuǎn)染效率。慢病毒載體主要由上海吉凱公司合成（GeneChem Biotechnology，catalog no.GORL0104629），構(gòu) 建的αPDL1-CAR慢病毒均進(jìn)行滴度檢測和DNA測序驗證。

1.2.2 K562細(xì)胞株基因修飾人K562細(xì)胞株由福建省血液病研究所提供。將K562細(xì)胞轉(zhuǎn)入帶有CD274基因的慢病毒載體，共培養(yǎng)8 h，離心換液，加入5μg/ml嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PD-L1和mCherry熒光標(biāo)記的PDL1-K562細(xì)胞；對照組K562細(xì)胞轉(zhuǎn)入空載體，穩(wěn)定表達(dá)mCherry熒光蛋白。將αPDL1-CAR病毒載體轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞，共培養(yǎng)8 h，離心換液，構(gòu)建αPDL1-K562細(xì)胞。所有細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。

1.2.3 共培養(yǎng)試驗將1×105個αPDL1-K562細(xì)胞按1∶1分別與實驗組PDL1-K562和對照組K562細(xì)胞共培養(yǎng)4 h，熒光顯微鏡觀察并捕獲細(xì)胞相互作用情況。

1.2.4 淋巴細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和基因修飾采集健康志愿者外周血200 ml，并簽署知情同意書。Ficoll梯度離心法收集外周血單個核細(xì)胞（PBMC），培 養(yǎng) 于 含CD3mAb、r-Fibronection CH296、IL-2（100 U/ml）和10%FBS的1640培養(yǎng)液。T細(xì)胞在激活第2天開始進(jìn)行αPDL1-CAR慢病毒感染（病毒滴度：2×108TU/ml），1640重懸細(xì)胞密度為1×106個/ml，加入30 U/ml IL-2。按MOI=10加入αPDL1-CAR病毒于包被的24孔培養(yǎng)板，Histrnas P病毒感染增強(qiáng)液4μl，混勻，1 000 g離心1 h，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，更換新鮮的1640培養(yǎng)基，IL-2維持200 U/ml。隔天進(jìn)行半量換液，加入細(xì)胞因子感染96 h，觀察熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測αPDL1-CART細(xì)胞感染率，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 細(xì)胞毒性試驗取2.5×105個效應(yīng)細(xì)胞與5×104個靶細(xì)胞混合，效靶比為5∶1。實驗分為4組：T細(xì) 胞 與K562細(xì) 胞、T細(xì) 胞 與PDL1-K562細(xì) 胞、αPDL1-CART細(xì)胞與K562細(xì)胞、αPDL1-CART細(xì)胞與PDL1-K562細(xì)胞。各組重復(fù)3次。共培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，采用Annexin V對死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，靶細(xì)胞表達(dá)mCherry熒光，JIMBIO FIL計算混合細(xì)胞總數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測24 h剩余活的靶細(xì)胞百分比，計算24 h共培養(yǎng)后剩余的腫瘤細(xì)胞數(shù)=混合細(xì)胞總數(shù)×剩余活的靶細(xì)胞百分比。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)感染的αPDL1-CART細(xì)胞由于序列中連接有EGFP熒光蛋白，流式細(xì)胞儀檢測507 nm處EGFP熒光細(xì)胞百分比。細(xì)胞毒性試驗中加入5 μl Annexin-V用于凋亡細(xì)胞染色，剩余活的腫瘤靶細(xì)胞則檢測610 nm激發(fā)波長下mCherry熒光蛋白標(biāo)記的信號細(xì)胞。所有樣本加入抗體后暗室孵育30 min，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。兩獨立樣本均數(shù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 αPDL1-CAR病毒載體構(gòu)建αPDL1-CAR胞外為anti-PD-L1 scFv（取自MEDI4736抗體的重鏈VH和輕鏈VL），跨膜區(qū)為CD8α hinge，胞內(nèi)信號區(qū)由CD137和CD3ζ組成（圖1A）。信號區(qū)末端通過2A自我剪切肽連接EGFP熒光蛋白，檢測αPDL1-CAR表達(dá)。構(gòu)建的αPDL1-CAR慢病毒經(jīng)基因測序與MEDI4736序列相符，感染K562細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到αPDL1-K562細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（圖1B）。

圖1 αPDL1-CAR慢病毒載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Construction of αPDL1-CAR lentiviral vector

2.2 共培養(yǎng)實驗αPDL1-K562細(xì)胞（綠）分別與實驗組PDL1-K562細(xì)胞（紅）和對照組K562細(xì)胞（紅）共培養(yǎng)4 h，熒光顯微鏡可觀察到αPDL1-K562細(xì)胞（綠）和PDL1-K562細(xì)胞（紅）相互結(jié)合聚集成團(tuán)，而對照組細(xì)胞游離分散（圖2）。提示αPDL1-K562細(xì)胞可與PDL1-K562細(xì)胞結(jié)合。

圖2 αPDL1-CART細(xì)胞4 h共培養(yǎng)圖譜（×200）Fig.2 Images of αPDL1-CART cells following 4 h coculture（×200）

2.3 αPDL1-CART細(xì)胞表達(dá)PBMC經(jīng)活化刺激后第2天開始進(jìn)行αPDL1-CAR慢病毒感染，在MOI=10條件下，培養(yǎng)第6天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，αPDL1-CART細(xì)胞表達(dá)率為（48.9±13.9）%，見圖3A。熒光顯微鏡鑒定結(jié)果顯示，αPDL1-CART細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（圖3B）。

圖3 αPDL1-CART細(xì)胞表達(dá)Fig.3 Expression of αPDL1-CART cells

2.4 T細(xì)胞和αPDL1-CART細(xì)胞體外殺傷性檢測在效靶比為5∶1條件下，將T細(xì)胞和αPDL1-CART細(xì)胞分別與K562和PDL1-K562共培養(yǎng)24 h，對照組T細(xì)胞中剩余腫瘤細(xì)胞數(shù)大于初始加入的腫瘤 細(xì) 胞 數(shù)50 000個［（63 144.7±3 392.5）個 和（6 480.0±32 422.8）個］，說明T細(xì)胞并不能有效殺傷腫瘤細(xì)胞。而實驗組αPDL1-CART細(xì)胞與K562細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，剩余的腫瘤細(xì)胞數(shù)也近50 000個［（49 990.0±1 595.0）個］，但與PDL1-K562細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后剩余腫瘤細(xì)胞數(shù)顯著減少［（2 136.9±766.1）個］，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4）。

圖4 體外檢測αPDL1-CART細(xì)胞殺傷活性Fig.4 Cytotoxicity of αPDL1-CART cells was determined in vitro

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤免疫治療面臨的主要障礙，其中免疫抑制性受體可在腫瘤免疫應(yīng)答過程中表達(dá)上調(diào)，從而激活機(jī)體免疫抑制通路誘導(dǎo)腫瘤耐受，其中PD-1/PD-L1通路是研究最為廣泛的領(lǐng)域之一。PD-1是T細(xì)胞表達(dá)的重要免疫檢查點受體，屬于免疫球蛋白超家族，可與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的配體PD-L1結(jié)合，進(jìn)而抑制活化T細(xì)胞對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，影響腫瘤免疫治療效果。因此，阻斷或封閉PD-1/PD-L1通路作為新的治療方法，廣泛用于不同腫瘤臨床治療，且已證明具有持續(xù)臨床效果［17］。

CART是將嵌合免疫受體與T細(xì)胞結(jié)合的一種T細(xì)胞技術(shù)，可直接殺傷靶細(xì)胞，繞過了傳統(tǒng)的MHC免疫激活途徑。最初一代CART僅在CAR結(jié)構(gòu)并入T細(xì)胞活化信號CD3ζ鏈，因此在其scFv具有抗原特異性的同時，可活化T細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用［18］。隨著技術(shù)進(jìn)步，第二代和第三代CAR在一代CAR結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上逐漸引入CD28、CD27、OX-40和4-1BB等刺激信號，進(jìn)一步促進(jìn)CART細(xì)胞增殖與存活，細(xì)胞毒性也得到提升［19］。而第四代CAR則有很大不同，WU等［20］設(shè)計了帶有“開關(guān)”功能的CAR，可通過小分子調(diào)控CART細(xì)胞功能；SCHNEIDER等［21］則構(gòu)建了串聯(lián)的CAR，即在1個CAR結(jié)構(gòu)上同時帶有針對腫瘤細(xì)胞CD19和CD20抗原的scFv；BIELAMOWICZ等［22］在1個T細(xì)胞上并聯(lián)表達(dá)3個CAR，使CART細(xì)胞可同時針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤3個抗原位點HER2、IL-13Rα2和EphA2，增加了CART細(xì)胞靶點數(shù)，提高治療效果；ALBERT等［23］以納米靶向抗體結(jié)合通用型CAR（uniCAR），僅需通過更換不同靶向抗體就可以結(jié)合通用型CART細(xì)胞從而殺傷不同抗原的腫瘤細(xì)胞，無需重新設(shè)計針對新抗原的CART細(xì)胞；ADACHI等［24］的CART引入促進(jìn)細(xì)胞因子或趨化因子，使T細(xì)胞表達(dá)CAR的同時，也表達(dá)IL-7和趨化因子CCL19，CART不僅是靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞，也可作為細(xì)胞載體傳遞免疫調(diào)節(jié)分子。

免疫檢測點阻斷策略對于腫瘤免疫治療是一個非常有潛力的領(lǐng)域［25］。MEDI4736人源IgG1單克隆抗體對PD-L1有較高的特異性和親和性，能阻斷PD-1和CD80相互作用，從而阻礙T細(xì)胞活化的抑制信號。將免疫檢測點阻斷與CART技術(shù)結(jié)合，一方面可利用CART細(xì)胞直接殺傷特異靶點的腫瘤細(xì)胞，另一方面可阻斷PD-1/PD-L1信號通路，防止PD-1/PD-L1負(fù)調(diào)控信號影響CART細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

本研究構(gòu)建αPDL1-CAR的scFv來源于MEDI4736，共培養(yǎng)實驗說明構(gòu)建的αPDL1-CAR能夠特異性結(jié)合PD-L1靶細(xì)胞。細(xì)胞毒性實驗中，對照組T細(xì)胞24 h共培養(yǎng)后剩余的腫瘤細(xì)胞數(shù)均大于初始腫瘤細(xì)胞數(shù)，說明T細(xì)胞不能有效殺傷腫瘤細(xì)胞。而αPDL1-CART細(xì)胞組中，剩余的K562腫瘤細(xì)胞數(shù)并沒有減少，但PDL1-K562細(xì)胞數(shù)顯著減低。說明αPDL1-CART細(xì)胞能夠?qū)DL1-K562細(xì)胞進(jìn)行特異性識別和殺傷。

本研究以免疫檢查點阻斷為策略，通過CART技術(shù)將免疫檢測點抑制劑序列整合至CART細(xì)胞，構(gòu)建了一種新的αPDL1-CART細(xì)胞，并初步驗證了αPDL1-CART細(xì)胞對PDL1-K562細(xì)胞的特異性殺傷作用，為腫瘤免疫治療提供了新的思路，具有重要研究價值。