干擾素刺激基因15（ISG15）在天然免疫中的抗病毒作用研究進(jìn)展

嵇祝星 王曉泉 劉曉文 劉秀梵

（揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225000）

1 ISG15概述

干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）最初于1979年在IFN處理后的細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，這種蛋白在合成之初表現(xiàn)為17 kD的前體形式，但隨后被水解為15 kD的蛋白，因此被命名為“15 kD蛋白”。1987年，在發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄由IFN-β驅(qū)動(dòng)后，將其更名為“ISG15”［1］。晶體結(jié)構(gòu)顯示，ISG15由2個(gè)類泛素（UBL）結(jié)構(gòu)域組成，各結(jié)構(gòu)域中均含有4個(gè)β-折疊和1個(gè)α-螺旋，2個(gè)結(jié)構(gòu)域由1個(gè)被稱為“鉸鏈”的多肽序列連接［2］。值得注意的是這2個(gè)UBL結(jié)構(gòu)域N端和C端末端氨基酸序列分別與泛素具有29%和31%同源性。

2 ISG15的修飾作用

ISG15的細(xì)胞內(nèi)作用與泛素相似，目前對(duì)ISG15的研究表明，盡管未結(jié)合（游離）的ISG15也有多種功能，但其作用主要通過與賴氨酸（K）殘基結(jié)合實(shí)現(xiàn)。ISG15存在17 kD前體，通過蛋白水解加工為15 kD的成熟形式，加工后暴露ISG化所需的羧基末端的LRLRGG基序［3］。ISG15通過這個(gè)基序與目標(biāo)蛋白共價(jià)連接，這一過程稱為ISG化（ISGylated）。ISG化需要三步酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括E1激活酶（Ube1L）、E2結(jié)合酶（UbcH8）和E3連接酶（Herc5或TRIM25/EFP）。ISG化可被泛素特異性蛋白酶18（USP18）逆轉(zhuǎn)［4］。USP18與ISG15一樣，也是眾多IFN刺激基因下游的產(chǎn)物。ISG15作為類泛素樣蛋白與泛素的不同體現(xiàn)在泛素具有數(shù)百種可用于形成復(fù)雜多聚泛素鏈的E1-E2-E3酶，ISG15僅有一組數(shù)量有限的E1-E2-E3酶介導(dǎo)其單體連接至目標(biāo)蛋白。ISG化發(fā)生位置主要在核糖體，但由于主要的ISG15 E3-連接酶（Herc5）定位，所以ISG化很大程度上發(fā)生于新合成的蛋白［5］。

3 病毒ISG化修飾

ISG15 E3連接酶（Herc5）主要位于核糖體，因此，病毒感染期間，活躍的翻譯蛋白如病毒蛋白優(yōu)先被ISG化。病毒蛋白ISG化可干擾其定位、蛋白酶活性，破壞其與宿主蛋白或其他病毒蛋白相互作用，破壞其自身寡聚和幾何結(jié)構(gòu)，或影響其他功能，最終導(dǎo)致病毒復(fù)制減少或宿主免疫應(yīng)答改變。

流感病毒NS1蛋白是最早被報(bào)道的ISG化病毒蛋白［6］。NS1對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要，可抑制Ⅰ型IFN［7］。A型流感病毒（influenza A virus，IAV）NS1（NS1/A）的ISG化阻止其形成同源二聚體，其中第41位賴氨酸（K41）修飾破壞NS1與Importin-α相互作用，從而抑制NS1核轉(zhuǎn)位，使病毒易受IFN抑制［6］。研究發(fā)現(xiàn)，IAV的NS1可被ISG15在7個(gè)賴氨酸（K20/41/108/110/126/217/219）上修飾，Herc5可通過其HECT結(jié)構(gòu)域特異性催化ISG化反應(yīng)。此外，NS1/A在不同位點(diǎn)的ISG化干擾其與RNA靶標(biāo)結(jié)合，包括U6 snRNA、dsRNA、PolyA RNA和病毒RNA。而IAV在ISG15基因敲除的A549細(xì)胞中繁殖能力增強(qiáng)［8］。

ISG15在小鼠模型中顯示出強(qiáng)大的抗B型流感病毒活性［9］。ISG15-/-小鼠更易感染IBV，證實(shí)ISG化抑制B型流感病毒復(fù)制［10］。但與IAV不同的是，B型流感病毒中核蛋白（nucleoprotein，NP）是ISG15的主要靶標(biāo)。ISG15可作為NP寡聚化抑制劑，使其無法形成病毒核糖核蛋白（vRNP），并導(dǎo)致病毒蛋白合成和病毒復(fù)制減少［11］。

此外，柯薩奇B3病毒（CVB3）2A蛋白酶的ISG化抑制其在心肌細(xì)胞中切割真核起始因子eIF4G蛋白的能力，從而阻止“宿主關(guān)閉”現(xiàn)象，因此，ISG15與CVB3結(jié)合可降低病毒滴度，限制炎癥性心肌病和心力衰竭［12］。ISG化也抑制人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）基因表達(dá)和病毒粒子釋放。HCMVpUL26蛋 白可 抑 制TNF-α誘 導(dǎo)的NF-κB活化［13］。pUL26蛋白的ISG化改變了pUL26穩(wěn)定性，并抑制其抑制NF-κB信號(hào)的能力［14］。

ISG化對(duì)登革熱病毒2型（DENV-2）復(fù)制起抑制作用。過表達(dá)ISG15可顯著抑制細(xì)胞外病毒釋放，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA無影響，且ISG15過表達(dá)可降低細(xì)胞外病毒感染力。研究顯示，IFN處理的細(xì)胞中DENV-2 RNA水平顯著降低，并可在ISG15基因敲除后部分恢復(fù)，主要由于DENV-2蛋白中NS3和NS5發(fā)生ISG化抑制DENV-2顆粒釋放，因此，ISG15可作為宿主抗病毒因子對(duì)抗DENV-2感染［15］。

ISG15在抑制偽狂犬病病毒（PRV）時(shí)也發(fā)揮重要作用。研究表明，PRV感染早期，過表達(dá)ISG15可通過降低病毒滴度和其mRNA水平有效抑制PRV復(fù)制，從而增加IFN-β表達(dá)，激活I(lǐng)SRE啟動(dòng)子并上調(diào)IFN誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。說明ISG15在細(xì)胞抗PRV反應(yīng)中具有潛在免疫調(diào)節(jié)作用［16］。以上結(jié)果表明病毒蛋白ISG化作用可降低病毒后代生產(chǎn)效率和質(zhì)量，并限制病毒蛋白調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答的能力。

4 宿主蛋白ISG化修飾

除通過直接對(duì)病毒蛋白進(jìn)行ISG化修飾外，對(duì)病毒釋放所需的宿主蛋白進(jìn)行修飾也可有效防止病毒產(chǎn)生。

ISG15可抑制艾滋病病毒（HIV）釋放。將表達(dá)ISG15的質(zhì)粒與HIV-1病毒共轉(zhuǎn)染可抑制HIV-1釋放，但對(duì)HIV-1病毒蛋白表達(dá)無影響［17］。Gag蛋白是HIV-1出芽和釋放所必需的蛋白，ISG15表達(dá)抑制HIV-1 Gag蛋白泛素化，破壞其與TSG101蛋白相互作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，半完整的細(xì)胞系統(tǒng)中，IAV血凝素蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)被ISG化的TSG101所抑制［18］。抵抗HIV感染過程中，ISG15可降解由USP18的蛋白酶活性積累導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的p53。相反，缺少ISG15可導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的負(fù)顯性p53積累，從而增強(qiáng)HIV-1復(fù)制。說明錯(cuò)誤折疊p53的ISG化清除對(duì)抵抗HIV感染具有重要意義［19］。

此外，ISG15還可與泛素連接酶Nedd4結(jié)合，當(dāng)ISG15與VP40共表達(dá)時(shí)，可抑制埃博拉病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）釋放。由于埃博拉病毒VLP釋放需要宿主NEDD4（泛素蛋白連接酶）介導(dǎo)基質(zhì)蛋白VP40泛素化，而ISG15可通過影響NEDD4與泛素E2結(jié)合酶相互作用從而阻斷VP40泛素化［20-21］。

最近一項(xiàng)關(guān)于非洲豬瘟病毒（CSFV）的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α處理后誘導(dǎo)ISG15上調(diào)可抑制CSFV復(fù)制。此外，上調(diào)的ISG15可促進(jìn)Beclin-1的ISG化和功能障礙，從而抑制自噬，而自噬是CSFV復(fù)制所必需 的。此 外，HERC5的HECT和RLD結(jié) 構(gòu) 也 與BECN1相互作用，催化ISG15蛋白與病毒結(jié)合［22］。

5 ISG化影響宿主信號(hào)通路調(diào)節(jié)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究已確定數(shù)百種在干擾素刺激后可被ISG化的宿主蛋白［23］。這些研究大多表明ISG15結(jié)合可影響參與免疫調(diào)節(jié)的重要信號(hào)通路，如IFN、NF-κB、JNK通路。其中ISG化可通過延長(zhǎng)信號(hào)蛋白如IRF3、STAT1激活狀態(tài)增強(qiáng)抗病毒信號(hào)通路，導(dǎo)致Ⅰ型IFN和ISGs表達(dá)增加［24-25］。

干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子3（IRF3）是調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，也是ISG15的靶標(biāo)之一［26］。IRF3一旦被磷酸化就會(huì)從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)至細(xì)胞核，與CREB結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，激活I(lǐng)FN-α/β和ISGs轉(zhuǎn)錄［27-28］。ISG15與IRF3結(jié)合抑制蛋白酶體對(duì)ISG15的降解，導(dǎo)致人類細(xì)胞中更強(qiáng)大的IFN反應(yīng)［24］。仙臺(tái)病毒（SeV）感染過程中，IRF3被ISG化，抑制其與PIN1（肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶）相互作用，并阻止IRF3泛素化和降解［24］。

STAT1是STAT蛋白家族成員，作為轉(zhuǎn)錄因子參與Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型IFN誘導(dǎo)基因上調(diào)。STAT1在人源細(xì)胞中被ISG化，可維持已磷酸化的STAT1（pSTAT1）表達(dá)，且ISG化抑制其泛素化和進(jìn)一步蛋白酶體降解，使STAT1可持續(xù)活化介導(dǎo)更強(qiáng)大的干擾素反應(yīng)，限制病毒復(fù)制［29］。

雖然ISG15在維持和激活抗病毒免疫中起正向調(diào)節(jié)作用，但其也可對(duì)抗病毒信號(hào)通路起負(fù)反饋抑制作用，防止過度免疫反應(yīng)。RIG-Ⅰ是一種RNA傳感器，可釋放信號(hào)激活I(lǐng)RF3和NF-κB。ISG15與RIG-Ⅰ結(jié)合降低小鼠細(xì)胞中Ⅰ型IFN啟動(dòng)子活性，減少NF-κB反應(yīng)［30］。此外，游離的ISG15還通過促進(jìn)RIG-Ⅰ與p62相互作用調(diào)節(jié)RIG-Ⅰ水平，并通過選擇性自噬介導(dǎo)RIG-Ⅰ降解［30-31］。ISG15在NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑上與Ubc13結(jié)合，Ubc13是一種泛素結(jié)合酶，參與TAK1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1）泛素化［32］。ISG15抑制TAK1泛素化導(dǎo)致NF-κB途徑負(fù)調(diào)節(jié)［33］。

ISG15可與細(xì)絲蛋白B（Filamin B）結(jié)合，細(xì)絲蛋白B作為RAC1、mekkk1、MKK4和JNK的支架蛋白，可促進(jìn)IFN信號(hào)傳導(dǎo)，而ISG15與Filamin B結(jié)合阻止該支架形成，從而減少IFN反應(yīng)［34-35］。

ISG15還可與蛋白激酶R（PKR）結(jié)合。PKR是一種IFN誘導(dǎo)的蛋白激酶，由雙鏈RNA激活，但在無病毒RNA情況下可被ISG15激活［36-37］。已知激活的PKR通過磷酸化eIF2a（真核啟動(dòng)因子2α）抑制蛋白翻譯，IFN或脂多糖刺激后PKR的ISG化發(fā)生于K69和K159，ISG化的PKR表現(xiàn)出不依賴RNA的結(jié)構(gòu)性激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白合成減少［37］。

6 ISG15作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子

ISG15除可發(fā)揮ISG化修飾作用，也可作為一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用。

采用抑制劑探究ISG15分泌途徑發(fā)現(xiàn)，ISG15由高爾基復(fù)合體分泌，而非由人類多藥抗性蛋白分泌［38］。中性粒細(xì)胞顆粒是潛在分泌ISG15的途徑，因?yàn)橹行粤＜?xì)胞可產(chǎn)生幾種對(duì)初始炎癥反應(yīng)非常重要的細(xì)胞因子和趨化因子［39］。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞中，ISG15定位于明膠酶和分泌物，表明粒細(xì)胞可能是ISG15的分泌途徑［40］。

TLR3激活的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了ISG15。初級(jí)巨噬細(xì)胞可內(nèi)化這些外泌體，導(dǎo)致ISG在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平增加［41］。重要的是，即使沒有Ⅰ型IFN誘導(dǎo)，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、cDC、pDC和NK細(xì)胞均有ISG15蛋白組成性產(chǎn)生，表明其在生理環(huán)境中產(chǎn)生ISG15，并能夠分泌ISG15［40］。

ISG15一旦分泌就可調(diào)節(jié)不同免疫細(xì)胞功能。研究證明，ISG15增加了LPS對(duì)原代單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，一項(xiàng)對(duì)ISG15缺乏癥患者的研究中證實(shí)了這一點(diǎn)，該缺乏癥患者對(duì)分枝桿菌感染的易感性增加［42］。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，ISG15與IL-12協(xié)同作用刺激PBMC釋放IFN-γ，其刺激效應(yīng)顯著的是自然殺傷（NK）細(xì)胞，其次是T細(xì)胞［43］。通過突變ISG15表面殘基，發(fā)現(xiàn)在C端泛素樣結(jié)構(gòu)域上有1個(gè)對(duì)誘導(dǎo)IFN-γ分泌起關(guān)鍵作用的小“補(bǔ)丁”，稱為“IFN-γ補(bǔ)丁”，可介導(dǎo)ISG15與NK-92細(xì)胞表面穩(wěn)定結(jié)合。之后采用泛素激活的相互作用陷阱技術(shù)（UBAITs，一種利用泛素系統(tǒng)的生物化學(xué)特性捕獲瞬時(shí)蛋白相互作用的方法）鑒定ISG15受體，證明LFA-1（CD11a/αL和CD18/β2整合素的異源二聚體）是ISG15受體，ISG15直接與其CD11a亞基結(jié)合［44］。該研究還指出ISG15對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響并不局限于IFN-γ，因?yàn)镮SG15還可誘導(dǎo)NK-92細(xì)胞分泌IL-10。重要的是，雖然ISG15介導(dǎo)的上游信號(hào)傳導(dǎo)已被初步鑒定，但下游介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的過程尚未確定。此外，能夠分泌ISG15的細(xì)胞類型及分泌機(jī)制也尚未闡明。

7 ISG15物種特異性對(duì)抗病毒效應(yīng)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，ISG15-/-患者表現(xiàn)出Ⅰ型IFN自身炎癥，而這一表型與ISG15-/-小鼠形成鮮明對(duì)比，表明ISG15型在不同物種間可能具有不同功能［45］。ISG15序列多樣性已被證明其影響一些病毒與機(jī)體反應(yīng)。

ISG15序列在不同物種間具有高度變異性，最極端情況下，如在一些哺乳動(dòng)物和魚類間，ISG15序列同源性僅為30%~35%。即使在2種不同哺乳動(dòng)物之間，序列同源性也低于60%［46］。從另一個(gè)角度看，可能解釋了人類和小鼠ISG15與USP18結(jié)合能力差異的原因［45］。人ISG15與USP18的結(jié)合能力比小鼠ISG15更強(qiáng)，因此USP18在人類細(xì)胞中不被降解。

從抗病毒功能角度來說，ISG15與B型流感NS1蛋白（NS1/B）相互作用具有物種特異性。與其他物種ISG15相比，NS1/B與人ISG15結(jié)合比小鼠、牛和犬更加穩(wěn)定，表明NS1/B蛋白可能是決定B型流感病毒宿主敏感性的主要因素［47］。采用反向遺傳方法研究發(fā)現(xiàn)，僅ISG15鉸鏈區(qū)內(nèi)關(guān)鍵殘基突變就足以顯著影響其結(jié)合特性［48］。將人ISG15中的2個(gè)關(guān)鍵殘基（D76和K77）與小鼠、犬和牛ISG15中的相應(yīng)殘基進(jìn)行交換，將其與NS1/B結(jié)合降低至Western blot幾乎檢測(cè)不到的水平。相反，交換使小鼠、犬和牛ISG15結(jié)合能力均有所增加，可以解釋不同物種對(duì)B型流感病毒感染的不同細(xì)胞表型的問題，表明ISG15鉸鏈區(qū)可能是影響NS1/B宿主特異性的主要因素［49］。

此外，研究揭示奈羅病毒vOTUs和冠狀病毒PLPs均對(duì)不同物種的ISG15表現(xiàn)出不同的切割能力和物種親和性差異［50-51］。

ISG15的非保守性及病毒與不同種屬的ISG15分子作用效果差異，提示探究病毒與ISG15分子互作前，需要對(duì)每個(gè)物種ISG15進(jìn)行序列分析，尋找關(guān)鍵差異位點(diǎn)。更需要預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)上的差異，如小鼠和人類ISG15間除表面結(jié)構(gòu)變異外，其各自的Ub樣結(jié)構(gòu)域朝不同方向彎曲［50］。表明其物種間差異可能不僅是簡(jiǎn)單的表面片段置換，還可能包括ISG15結(jié)構(gòu)域間相互作用。

8 結(jié)論與展望

ISG15在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)對(duì)抗病毒感染時(shí)具有重要作用。目前，對(duì)ISG15發(fā)揮作用的形式和功能的研究已有初步理解，一是發(fā)揮ISG化修飾作用，針對(duì)病毒本身或病毒復(fù)制所需要的宿主蛋白進(jìn)行；二是ISG化修飾先天免疫信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，既可正向也可負(fù)向調(diào)節(jié)通路信號(hào)傳遞；三是作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，發(fā)揮ISG15單體生物學(xué)效應(yīng)，能夠與受體LFA-1相互作用觸發(fā)IFN-γ產(chǎn)生和其他信號(hào)通路，表明其是一種潛在的細(xì)胞因子。最重要的一點(diǎn)是不同物種ISG15與不同病毒的作用機(jī)制可能不同，顯示ISG15在體內(nèi)發(fā)揮作用的多元性和復(fù)雜性，其中多個(gè)方面進(jìn)行了進(jìn)一步研究，如作為機(jī)體對(duì)抗病原體入侵的手段，蛋白ISG化修飾譜具體范圍是什么？ISG化如何調(diào)節(jié)病毒蛋白、病毒復(fù)制和宿主內(nèi)穩(wěn)態(tài)仍然知之甚少。此外，對(duì)其作為細(xì)胞因子或是單體ISG15的分子作用機(jī)制及其對(duì)其他細(xì)胞調(diào)節(jié)能力的探究仍處于起步階段。ISG15作為一個(gè)非高保守性蛋白，物種間和種內(nèi)差異較大。確定蛋白ISG化的物種特異性結(jié)合偏好、范圍和潛在生物學(xué)意義將有助于理解先天性免疫應(yīng)答。