超微腫痛貼對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的軟骨中JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的影響

馮帥華 吳官保 文哲 姚紅艷 姚順騫 張淼 仇湘中

〔摘要〕 目的 觀(guān)察超微腫痛貼對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA）模型的JNK/p38 MAPK信號(hào)通路的mRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法 將50只3月齡新西蘭兔隨機(jī)分為空白組、模型組、氟比洛芬凝膠貼膏組、超微腫痛貼組，每組各12只，除空白組外，其他3組均采用木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)腔注射方式造模。造模成功后，超微腫痛貼組予超微腫痛貼貼于右膝關(guān)節(jié)，每日1次，每次6 h，連續(xù)給藥4周。氟比洛芬凝膠貼膏組予氟比洛芬凝膠貼膏貼于右膝關(guān)節(jié)，每日1次，每次6 h，連續(xù)給藥4周。干預(yù)4周后空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)兔，觀(guān)察各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分;ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中TNF-α水平;采用RT-PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中JNK和p38 MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)量;Western blot檢測(cè)軟骨中p38 MAPK、JNK、MMP-13蛋白表達(dá)。結(jié)果 超微腫痛貼組與氟比洛芬凝膠貼膏組關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分及關(guān)節(jié)液中TNF-α表達(dá)水平顯著低于模型組（P<0.05），并且JNK和p38 MAPK mRNA的表達(dá)水平，及p38 MAPK、JNK、MMP-13蛋白表達(dá)水平較模型組均顯著下降（P<0.05），超微腫痛貼組各指標(biāo)與氟比洛芬凝膠貼膏組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 超微腫痛貼能夠有效減輕兔KOA的軟骨損傷，調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨JNK/p38 MAPK信號(hào)通路，抑制軟骨MMP-13表達(dá)，減少關(guān)節(jié)液中TNF-α表達(dá)水平，這可能為其治療KOA的部分作用機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕 膝骨關(guān)節(jié)炎;超微腫痛貼;關(guān)節(jié)軟骨;MAPK信號(hào)通路;軟骨損傷

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R274.9 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.007

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Chaowei Zhongtong Patch on the mRNA and protein expression of JNK/p38 MAPK signaling pathway in rabbit knee osteoarthritis （KOA） model. Methods A total of 50 3-month old New Zealand rabbits were randomly divided into blank group， model group， flurbiprofen cataplasm group and Chaowei Zhongtong Patch group， with 12 rabbits in each group; except for the blank group， the other three groups were injected with papain into knee joint cavity for modeling. After the successful modeling， the Chaowei Zhongtong Patch group was applied Chaowei Zhongtong Patch to the right knee joint， once a day， for 6 h each time， for 4 weeks. Flurbiprofen cataplasm group was given flurbiprofen gel patch on right knee joint， once a day， 6 h each time， for 4 weeks. After 4 weeks of intervention， all rabbits were killed by air embolism， then the Mankin's score of articular cartilage of each group was observed; TNF-α level in synovial fluid was detected by ELISA; relative expression levels of JNK and p38 MAPK mRNA in articular chondrocytes were tested by RT-PCR; the protein expression levels of p38 MAPK， JNK and MMP-13 in articular cartilage were detected by Western blot. Results The Mankin's score of articular cartilage and the expression level of TNF-α in synovial fluid of the Chaowei Zhongtong Patch group were significantly lower than those in the model group （P<0.05）， and the expression levels of JNK and p38 MAPK mRNA and the protein expression levels of p38 MAPK， JNK and MMP-13 of the Chaowei Zhongtong Patch group were remarkably declined compared with those in the model group （P<0.05）， there were no statistical significances between Chaowei Zhongtong Patch group and flurbiprofen cataplasm group （P>0.05）. Conclusion Chaowei Zhongtong Patch can effectively reduce the cartilage damage of rabbit KOA， regulate JNK/p38 MAPK signaling pathway， inhibit the expression levels of MMP-13 in cartilage， and decrease the expression level of TNF-α in synovial fluid， which may be part of its acting mechanisms in the treatment of knee KOA.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; Chaowei Zhongtong Patch; joint cartilages; cartilage damage

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis， KOA）是一種最常見(jiàn)的退行性關(guān)節(jié)病，我國(guó)目前有3%的人患有骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis， OA），并且有逐年增加趨勢(shì)，其中絕大部分為KOA[1]。目前，OA的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但具有相似的病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞甚至缺損，軟骨下骨囊性變，骨贅形成等特點(diǎn)[2]。中醫(yī)學(xué)在非手術(shù)治療方面有較多的成就，其中中醫(yī)外用膏劑外敷治療有簡(jiǎn)單、方便并效果顯著的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床[3]。超微腫痛貼是湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院自制中藥外用膏劑，是蔡光先教授經(jīng)驗(yàn)方“腫痛消巴布膏”（專(zhuān)利授權(quán)號(hào)：ZL200910043351.X）改革劑型，多項(xiàng)研究證實(shí)了其療效[4-9]。對(duì)此，本研究借助病理學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)手段，研究超微腫痛貼對(duì)兔KOA模型的干預(yù)作用，探討其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇3月齡普通級(jí)新西蘭兔50只，體質(zhì)量（2.0～2.5） kg，雌雄各半，由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0008。經(jīng)檢疫后在湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，單籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 ?藥物與試劑

超微腫痛貼：湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑制備室生產(chǎn)（批號(hào)：201808J），該方主要中藥材成分是：延胡索、大黃、菟絲子、熟地黃、川芎、當(dāng)歸、沒(méi)藥、乳香、紅花、蒲黃、姜黃、莪術(shù)、白芷、梔子、香附、冰片。含藥量：每100 cm2不少于7.5 g（浸膏）。規(guī)格：9 cm×7 cm。

氟比洛芬凝膠貼膏：日本三笠制藥株式會(huì)社（批號(hào)：402194）。規(guī)格：13.6 cm×10.0 cm。木瓜蛋白酶（美國(guó)Genview公司，批號(hào)：SH00104）;蘇木素、伊紅、BCA蛋白定量試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，批號(hào)：GX-6024、GG1605、UDT180009-6）;兔TNF-α ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：20175127）;MMP-13、p38 MAPK、β-actin抗體（美國(guó)Proteintech Group公司，批號(hào)：20170719、20170911、20180199）;JNK抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：20170524）;RIPA裂解液（長(zhǎng)沙維世爾生物科技有限公司，批號(hào)：JN17017）;Trizol（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170911）;DEPC、EDTA、Tris（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：2045512CP、1845112CP、1845131

CP）;DNA Marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：D181091、J180159、M171581）。

1.3 ?主要儀器

顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BA210T）;切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：YD-315）;包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司，型號(hào)：BMJ-A）;搖床、旋渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：TS-92、QL-901）;電泳儀及電泳槽（美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad公司，型號(hào)：164-5050）;臺(tái)式冷凍離心機(jī)（深圳黑馬有限公司，型號(hào)：TGL-18R）;磁力攪拌器（常州榮華儀器制造有限公司，型號(hào)：a85-1）;熒光定量RCP儀、熒光PCR板（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：PIKO REAL 96、SPL0960）。

1.4 ?造模與分組

50只實(shí)驗(yàn)兔，隨機(jī)抽取12只作為空白組，其余38只用膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶的方式進(jìn)行兔KOA模型的造模。方法：實(shí)驗(yàn)兔刮除后肢右膝關(guān)節(jié)周?chē)妹?，微屈膝，由髕韌帶內(nèi)側(cè)緣凹陷處進(jìn)針，以0.1 mL/kg用量將5%木瓜蛋白酶注射到膝關(guān)節(jié)腔。第1、3、5天各注射1次，并常規(guī)飼養(yǎng)4周后，可得到兔KOA模型[10]。然后隨機(jī)抽取2只，空氣栓塞法處死，解剖右膝發(fā)現(xiàn)軟骨面暗淡、粗糙，取軟骨標(biāo)本HE染色后光鏡下觀(guān)察，軟骨破壞、潮線(xiàn)欠流暢，提示造模成功。見(jiàn)圖1。

造模成功后將已造模的36只實(shí)驗(yàn)兔分為模型組、氟比洛芬凝膠貼膏組、超微腫痛貼組，每組12只，雌雄各半。

1.5 ?實(shí)驗(yàn)給藥方案

按動(dòng)物與人體表比換算法得出兔膝骨關(guān)節(jié)超微腫痛貼用量大小為：2.39 cm×1.86 cm。造模4周后，開(kāi)始予藥物干預(yù)。超微腫痛貼組：予超微腫痛貼貼于右膝關(guān)節(jié)（為防止撕咬及脫落，予醫(yī)用膠布及繃帶固定，固定后觀(guān)察兔的活動(dòng)，以不影響正?；顒?dòng)為標(biāo)準(zhǔn)，并每1 h巡查1次），每日1次，每次6 h，連續(xù)給藥4周。氟比洛芬凝膠貼膏組：用量大小為3.60 cm×2.65 cm，以同樣的固定方法固定藥物，每日1次，每次6 h，連續(xù)給藥4周。

1.6 ?取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 ?取材及處理 ?治療4周后行空氣栓塞法處死4組兔子。取材方法如下：（1）兔子處死后首先在右側(cè)膝關(guān)節(jié)暴露髕上囊，在髕上囊處切開(kāi)一小口，用注射器灌注滅菌生理鹽水1 mL，灌注后充分活動(dòng)膝關(guān)節(jié)，擠壓并回抽收集關(guān)節(jié)液，上述操作反復(fù)3次致收集3 mL關(guān)節(jié)液。經(jīng)離心后取上清液置于-20 ℃冰箱中保存。（2）再打開(kāi)關(guān)節(jié)囊，暴露膝關(guān)節(jié)腔，切斷交叉韌帶，清理半月板。然后離斷關(guān)節(jié)，取右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁進(jìn)行清洗，經(jīng)固定、沖洗、脫鈣、浸蠟、包埋、切片、HE染色等處理后光鏡下觀(guān)察軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)。（3）用刀片切取股骨外側(cè)髁關(guān)節(jié)面全層軟骨，并保存在液氮中，以備進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2 ?光鏡下觀(guān)察軟骨組織并進(jìn)行Mankin’s評(píng)分 ?將軟骨切片進(jìn)行HE染色后，在光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察，進(jìn)行Mankin’s評(píng)分[11]。Mankin’s評(píng)分根據(jù)軟骨結(jié)構(gòu)、基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)染色、潮線(xiàn)的完整性4個(gè)項(xiàng)目的總分，評(píng)估兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨損傷程度，評(píng)分越高表示軟骨損傷程度越嚴(yán)重。

1.6.3 ?ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中TNF-α水平 ?將備好的關(guān)節(jié)液常溫化凍，用ELISA試劑盒嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)檢測(cè)關(guān)節(jié)液中TNF-α水平。

1.6.4 ?RT-PCR法檢測(cè)軟骨中p38 MAPK及JNK mRNA相對(duì)表達(dá)量 ?取保存好的兔膝軟骨組織提取總RNA，測(cè)濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成引物。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用熒光定量PCR反應(yīng)：在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量SYBR熒光材料，測(cè)得擴(kuò)增熒光曲線(xiàn)，再用LightCycler數(shù)據(jù)分析軟件分析RT-PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虻臄U(kuò)增溶解曲線(xiàn)，獲得目的基因和GAPDH的CT值，隨后算出目的基因相對(duì)表達(dá)量，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物序列見(jiàn)表1。

1.6.5 ?Western blot檢測(cè)軟骨中p38 MAPK、JNK及MMP-13蛋白表達(dá) ?取備用的兔膝關(guān)節(jié)軟骨，軟骨組織研磨后，并提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，隨后進(jìn)行Western blot電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移到NC膜上;用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，將按照一定比例（MMP-13為1∶750，p38 MAPK為1∶750，JNK為1∶2000，β-actin為1∶5000）稀釋的一抗溶液與膜一起孵育，保存在4 ℃冰箱中過(guò)夜;TBST洗3次后進(jìn)行二抗孵育90 min;隨后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色并曝光，最后將曝光后底片進(jìn)行掃描，用quantity one專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，若滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，若方差不齊者用Tamhane’s T2法，若不滿(mǎn)足正態(tài)性采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?光鏡下各組軟骨組織的病理改變

空白組HE染色光鏡下見(jiàn)軟骨表面平坦，軟骨層無(wú)裂紋，細(xì)胞數(shù)量及分布正常，大小正常，潮線(xiàn)無(wú)破壞。模型組顯示軟骨層較空白組薄，軟骨出現(xiàn)較深裂隙，軟骨表面不平坦，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，或增多呈簇狀分布，潮線(xiàn)不平滑、中斷。與模型組相比，氟比洛芬凝膠貼膏組的軟骨細(xì)胞增多，偶有呈簇狀分布，軟骨表面較模型組平坦，存在較多小裂隙，潮線(xiàn)欠流暢，偶有中斷。超微腫痛貼組軟骨細(xì)胞常規(guī)分布，軟骨表面相對(duì)平坦，存在小裂隙，潮線(xiàn)欠流暢。Mankin’s評(píng)分結(jié)果：與空白組相比，模型組、氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組評(píng)分明顯升高（P<0.05）;與模型組相比，氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組評(píng)分明顯降低（P<0.05）;與氟比洛芬凝膠貼膏組相比，超微腫痛貼組的評(píng)分稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

2.2 ?各組膝關(guān)節(jié)液TNF-α水平的比較

與空白組相比，模型組、氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組TNF-α水平明顯上調(diào)（P<0.05）;與模型組相比，氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組的TNF-α水平明顯下調(diào)（P<0.05）;與氟比洛芬凝膠貼膏組相比，超微腫痛貼組的TNF-α水平稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.3 ?各組膝關(guān)節(jié)軟骨p38 MAPK及JNK mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果

與正常組相比，模型組、氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組的p38 MAPK及JNK mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）;與模型組相比，氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組的p38 MAPK及JNK mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）;與氟比洛芬凝膠貼膏組相比，超微腫痛貼組的p38 MAPK及JNK mRNA表達(dá)稍有下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

2.4 ?各組膝關(guān)節(jié)軟骨p38 MAPK、JNK及MMP-13蛋白表達(dá)結(jié)果

與正常組相比，模型組、氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組的p38 MAPK、JNK、MMP-13蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）;與模型組相比，氟比洛芬凝膠貼膏組及超微腫痛貼組的p38 MAPK、JNK、MMP-13的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）;與氟比洛芬凝膠貼膏組相比，超微腫痛貼組的p38 MAPK、JNK、MMP-13的蛋白表達(dá)稍有下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5、圖3。

3 討論

目前，KOA的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明相關(guān)炎性因子、細(xì)胞合成及代謝因子、激素等與KOA發(fā)病關(guān)系密切[12]。軟骨退變、降解是發(fā)病的根本，也是啟動(dòng)骨性關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)程的首要因素。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）家族是公認(rèn)的與OA發(fā)病發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，包括p38 MAPK、JNK、ERK及ERK5，其中p38 MAPK及JNK信號(hào)通路較為突出[13]。p38

MAPK信號(hào)通路及JNK信號(hào)通路在OA病理過(guò)程中可被炎癥因子等多種細(xì)胞外應(yīng)激原導(dǎo)致激活[14]。p38 MAPK的激活不僅可以誘導(dǎo)MMP-13的表達(dá)，導(dǎo)致進(jìn)行性降解軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨的損傷[15-16]，還可以介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[17]。JNK在OA發(fā)病、發(fā)展中也參與很多軟骨損傷途徑，但JNK主要影響的是MMPs的合成，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解方面，研究中發(fā)現(xiàn)激活的JNK可引起MMP-1、MMP-3、MMP-13水平升高[18]。TNF-α是OA發(fā)生與發(fā)展最為重要的致病因子之一，可介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)過(guò)程，關(guān)節(jié)內(nèi)的TNF-α濃度的升高，多種核細(xì)胞會(huì)被激活，促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌PGE-2，導(dǎo)致血管通透性增加，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可加重炎性水腫、疼痛，因此TNF-α水平可以客觀(guān)的表明OA的病情程度[19]。同時(shí)，TNF-α可以與p38 MAPK信號(hào)通路形成正反饋循環(huán)，TNF-α可誘導(dǎo)p38 MAPK的磷酸化，可再促進(jìn)TNF-α的表達(dá)[20]。因而，假如能通過(guò)抑制JNK與p38 MAPK通路的激活，控制炎癥因子的表達(dá)，從而達(dá)到延緩軟骨退變，可能具有延緩OA病變過(guò)程的重要意義，為臨床治療退行性關(guān)節(jié)疾患提供新的治療思路。

中醫(yī)學(xué)古籍中無(wú)KOA病名，中醫(yī)學(xué)根據(jù)其發(fā)病的部位也命名為“膝痹”。本病的發(fā)生與多種因素有關(guān)，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA發(fā)病與肝腎虧虛，風(fēng)、寒、濕及瘀血客于局部有關(guān)，最終導(dǎo)致局部氣滯血瘀，經(jīng)脈痹阻不通而發(fā)病。其主要病機(jī)是“虛、瘀、毒”[21]，虛主要是肝腎虛，筋骨失養(yǎng);瘀主要是氣滯血瘀，寒凝瘀滯;毒主要是外來(lái)之風(fēng)、寒、濕等邪氣，本病主要以肝腎虛為本，外感邪氣及氣滯血瘀為標(biāo)。在治療痹證上，根據(jù)辨證運(yùn)用活血化瘀、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎等藥物[22]。超微腫痛貼方中延胡索能行血中氣滯，故專(zhuān)治一身上下諸痛，味辛則氣血能潤(rùn)能散，主要為活血行氣止痛的功效;方中大黃主取活血逐瘀之功，延胡索與大黃配伍活血祛瘀、行氣止痛，共為君藥。熟地黃與菟絲子配伍以補(bǔ)益肝腎，當(dāng)歸起活血止痛之效，兼養(yǎng)血調(diào)經(jīng);川芎行氣、又能活血，可行一身之氣，為“血中之氣藥”，并具有祛風(fēng)止痛之效，共為臣藥。香附理氣止痛，紅花、姜黃、蒲黃行血祛瘀，乳香與沒(méi)藥兩者配伍加強(qiáng)方中活血行瘀、消腫止痛之功，莪術(shù)破血行氣，白芷散寒止痛，梔子清熱利濕，共為佐藥，可助君藥活血祛瘀、行氣止痛之功。冰片辛香，通諸竅經(jīng)絡(luò)，引諸藥行于經(jīng)脈，為使藥。方中各藥合用，共奏活血化瘀、行氣消腫止痛、兼補(bǔ)益肝腎之功效，可標(biāo)本兼治。現(xiàn)代藥理研究中發(fā)現(xiàn)，延胡索及大黃主要成分有良好的抑制炎性因子表達(dá)、鎮(zhèn)痛等效果[23-25]。本課題組在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)超微腫痛貼在治療膝骨關(guān)節(jié)病中可有效地改善臨床癥狀，降低P物質(zhì)、骨橋蛋白、1L-1β水平可能為其作用機(jī)制之一[4-8]。傳統(tǒng)散劑制作的外用膏劑的藥材粒徑大，因此溶出速率、溶出度及吸收率相對(duì)低，而超微腫痛貼運(yùn)用的超微飲片將藥材粒徑縮小了幾十至近百倍，一般微粉粒徑控制在1～75 μm，在保持傳統(tǒng)中藥固有的藥理化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，提取、濃縮等處理后增加了載藥量、提高了透皮效果，并且增加了藥物有效接觸面積。

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，超微腫痛貼組較模型組的軟骨組織KOA樣病變程度減輕，Mankin’s評(píng)分降低（P<0.05）;并發(fā)現(xiàn)超微腫痛貼可減少兔KOA模型的關(guān)節(jié)液中TNF-α水平、下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13蛋白表達(dá)、下調(diào)JNK及p38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)（P<0.05）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷超微腫痛貼可能是通過(guò)減少TNF-α釋放，抑制MMP-13表達(dá)，下調(diào)JNK及p38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，這可能為其治療KOA的作用機(jī)制之一，為超微腫痛貼防治KOA提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但超微腫痛貼組方藥物較多，其有效成分及具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)探索證實(shí)。

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