• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激模型構(gòu)建

    2022-02-18 02:07:44王水濤何盛盛江玲麗高有領(lǐng)
    關(guān)鍵詞:傳代原代纖維細(xì)胞

    王水濤,何盛盛,江玲麗,高有領(lǐng),*

    (1.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波 315100; 2.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 寧波 315100)

    中華鱉()營養(yǎng)豐富,富含不飽和脂肪酸、必需氨基酸、維生素和微量元素,具有良好的養(yǎng)殖效益,是我國重要的特種經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物。近年來,隨著消費(fèi)市場的成熟,中華鱉養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅速,2019年我國所有種類鱉的產(chǎn)量達(dá)到32.55萬t,其中,中華鱉占了絕大部分,但頻發(fā)的病害,嚴(yán)重制約中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。危害中華鱉的病原種類繁多,其中,病毒性疾病由于缺乏有效的診斷方法和防治方法,危害性遠(yuǎn)高于其他病原引起的疾病。先前,對(duì)中華鱉病毒性疾病的研究主要集中在組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)變化和電鏡觀察等方面,這些方法雖然能分離和鑒定出一些病毒病,但關(guān)于大部分病毒病的發(fā)生和致病機(jī)理尚不明確。病毒只能在天然宿主或其他合適的活細(xì)胞內(nèi)繁殖,且病毒感染宿主時(shí)有種屬特異性;因此,建立中華鱉源細(xì)胞系對(duì)其免疫學(xué)和病原微生物學(xué)研究來說都非常重要。目前,研究人員已在中華鱉的細(xì)胞系建立和培養(yǎng)條件優(yōu)化方面取得了一些進(jìn)展:李曉莉等建立了中華鱉腎、脾細(xì)胞系;郭海杰建立了中華鱉心細(xì)胞系,并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。與畜禽類和魚類相比,國內(nèi)外關(guān)于鱉類細(xì)胞研究的廣度和深度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。而且,上述關(guān)于鱉的細(xì)胞原代培養(yǎng)方法均需從成體中采集組織塊,并基于組織塊遷移法開展。該類方法雖已被證實(shí)可行,但也存在著一些缺點(diǎn),例如:由于成體難以徹底消毒,細(xì)胞污染的概率較大;且培養(yǎng)液中存在大塊的組織塊,易造成培養(yǎng)的細(xì)胞類型不單一。本實(shí)驗(yàn)擬使用無菌的鱉胚胎,采用胰蛋白酶消化結(jié)合細(xì)胞過濾器的方法,解決上述問題。

    維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)可以識(shí)別病毒RNA,激活干擾素生成通路并生成干擾素,從而發(fā)揮抗病毒的作用。在RIG-Ⅰ識(shí)別并區(qū)別對(duì)待外源病毒RNA和自身RNA的過程中,-甲基腺苷(mA)修飾發(fā)揮重要的作用。機(jī)體自身的RNA經(jīng)過mA修飾以后,不會(huì)激活干擾素系統(tǒng),而外源的病毒RNA未經(jīng)mA修飾,可激活該系統(tǒng),進(jìn)而產(chǎn)生干擾素。在mA修飾環(huán)狀RNA的過程中,mA甲基化識(shí)別蛋白(YTHDF2)具有重要的作用。RIG-Ⅰ識(shí)別病毒RNA后,其分子構(gòu)象發(fā)生改變,與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)產(chǎn)生作用。MAVS進(jìn)入線粒體,激活干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF),再經(jīng)過一系列的生化反應(yīng),生成干擾素(IFN-α/β),并產(chǎn)生后續(xù)的抗病毒反應(yīng)。鑒于中華鱉在該方向的研究尚存在空白,因此有必要針對(duì)上述因子開展相關(guān)研究。

    綜上,本實(shí)驗(yàn)旨在建立基于中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)體系,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用RNA病毒模擬物——聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激該細(xì)胞,研究其對(duì)細(xì)胞形態(tài)和干擾素生成通路相關(guān)因子的影響,最終構(gòu)建基于中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞Poly I:C的刺激模型,為深入研究中華鱉抗病毒免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)用中華鱉胚胎由本實(shí)驗(yàn)室自行孵化得到。

    主要試劑包括:DMEM高糖培養(yǎng)基、D-Hanks緩沖液、胰蛋白酶、秋水仙素、二甲基亞砜(DMSO)和100×雙抗(500 U·mL青霉素和500 U·mL鏈霉素),購于北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清(FBS),購于Bovogen公司;一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、一抗RIG-Ⅰ、一抗MAVS、一抗干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)、二抗HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG、RIPA裂解液和TBST緩沖溶液,購于生工生物工程(上海)股份有限公司;Opti-MEM培養(yǎng)基、TriZol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit,購于美國Thermo Fisher公司;poly I:C,購于美國Sigma公司;Lipofectmine 3000試劑,購于美國Invitrogen公司;異丙醇,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PCR反應(yīng)試劑,購于日本Takara公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑UltraSYBR Mixture,購于江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司;臺(tái)盼藍(lán)染液、5×SDS-PAGE上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    DMEM高糖培養(yǎng)基和FBS按9∶1的比例混合后,再加入1%(體積分?jǐn)?shù))的100×雙抗配制成完全培養(yǎng)基。

    細(xì)胞凍存液由DMEM、FBS、DMSO按70%、20%、10%的比例(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))配制。

    1.2 原代培養(yǎng)

    取孵化至第23期的中華鱉胚胎,用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對(duì)殼表面進(jìn)行消毒,然后移入細(xì)胞操作間,在無菌條件下用眼科剪剪破卵殼,取出胚胎肝組織,用D-Hanks緩沖液(含1×雙抗)清洗2遍以去除血細(xì)胞。之后,將其移入裝有500 μL 0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)胰蛋白酶的1.5 mL離心管中,用眼科彎頭剪刀將組織塊剪成約1 mm的塊狀,再將其轉(zhuǎn)入15 mL離心管中,加入3.5 mL 0.25%胰蛋白酶,混合后,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃消化20 min(每隔5 min輕輕晃動(dòng)1次),再加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化。消化后用40 μm細(xì)胞過濾器過濾至新的50 mL離心管中,之后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,1 000×離心10 min,棄上清后,將所得沉淀用適量的完全培養(yǎng)基懸浮后移入到25 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T25)中,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃繼續(xù)培養(yǎng),隨后逐日在DM4000型顯微鏡(德國Leica)下觀察細(xì)胞貼壁和生長狀況,每2 d更換一次培養(yǎng)液。

    1.3 傳代培養(yǎng)

    觀察原代細(xì)胞培養(yǎng)情況,待細(xì)胞鋪滿單層時(shí),吸出舊培養(yǎng)基,用5 mL D-Hanks緩沖液清洗一次,加入1 mL 0.25%胰蛋白酶,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃消化3 min,之后拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁使細(xì)胞脫壁,加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以1∶5的比例接種至75 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T75),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)。后續(xù)細(xì)胞傳代均按1∶5的比例進(jìn)行。

    1.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

    選取形態(tài)均一、生長旺盛并處于指數(shù)生長期、細(xì)胞貼壁90%以上的1瓶細(xì)胞,利用0.25%胰蛋白酶使細(xì)胞脫落下來,隨即將細(xì)胞與培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入15 mL離心管中,1 000×離心3 min以去除培養(yǎng)基與胰蛋白酶。加入適量預(yù)先配制好的細(xì)胞凍存液,輕輕吹打,混合均勻,顯微鏡觀察計(jì)數(shù)后,調(diào)節(jié)凍存液劑量,使細(xì)胞濃度達(dá)到10mL,轉(zhuǎn)移細(xì)胞至2 mL凍存管中,然后將其放在預(yù)冷的程序降溫盒(需加入異丙醇)中進(jìn)行凍存。凍存程序如下:4 ℃存放6 h,之后轉(zhuǎn)移至-20 ℃放置24 h,再于-80 ℃放置24 h,最后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

    復(fù)蘇時(shí),從液氮中取出凍存的細(xì)胞,快速置于37 ℃水浴鍋中,輕輕晃動(dòng)凍存管使其快速解凍。完全融化的細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 ×室溫離心5 min后棄上清,加入3 mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃條件下培養(yǎng)。

    取凍存前、后的細(xì)胞懸液,將其與0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臺(tái)盼藍(lán)染液按1∶4的比例混合后,滴加至血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),在顯微鏡下觀察:死細(xì)胞被染成藍(lán)色,而活細(xì)胞則呈透明卵圓形。用活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例表示細(xì)胞存活率。

    1.5 細(xì)胞生長曲線測定

    將中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞經(jīng)消化后制成終濃度為2×10mL的細(xì)胞懸液,接種至24孔培養(yǎng)板中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃條件下培養(yǎng)。自接種結(jié)束開始計(jì)時(shí),于培養(yǎng)后8 d內(nèi)每天用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)量,每隔2 d給細(xì)胞換液1次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以每1 mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo),繪制生長曲線,并計(jì)算中華鱉細(xì)胞的倍增時(shí)間。

    1.6 細(xì)胞染色體觀察與分子鑒定

    取穩(wěn)定生長于6孔板48 h的第10代細(xì)胞,加入終濃度1 μg·mL的秋水仙素于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)6 h,用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化后回收細(xì)胞。經(jīng)低滲、預(yù)固定、固定、染色、干燥、封片后觀察。

    選取生長良好的中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞,消化后收集細(xì)胞沉淀,采用TriZol法提取細(xì)胞總RNA,使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板,參考曹代男等的方法對(duì)成纖維細(xì)胞做分子鑒定,以波形蛋白基因和肌動(dòng)蛋白α2基因2作為鑒定因子,以基因作為對(duì)照因子(引物序列詳見表1)。PCR反應(yīng)體系:5 μL 2×GC Buffer Ⅱ,1.6 μL dNTP Mixture,0.4 μL cDNA,0.4 μL上游引物(10 μmol·μL),0.4 μL下游引物(10 μmol·μL),0.2 μL TaKaRa LA酶,2 μL ddHO。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,16 ℃保溫。1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

    1.7 Poly I:C轉(zhuǎn)染細(xì)胞

    將中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞經(jīng)消化后制成終濃度為1.5×10mL的細(xì)胞懸液,接種至12孔培養(yǎng)板中(每孔1 mL),待生長至約80%時(shí)更換新鮮的完全培養(yǎng)基。采用Lipofectmine 3000試劑進(jìn)行Poly I:C轉(zhuǎn)染,每孔加入1 μg Poly I:C,同時(shí)在對(duì)照組中加入相同體積的空白Opti-MEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組各設(shè)3個(gè)重復(fù),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中31 ℃培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。收集時(shí)吸干培養(yǎng)基,加入200 μL RIPA裂解液,放置于冰上,在搖床上裂解處理30 min,轉(zhuǎn)移裂解液至EP管中,并加入80 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液,100 ℃金屬浴處理10 min后,3 000×、4 ℃離心10 min,然后吸取上清液用于Western blot檢測。

    用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的細(xì)胞采用6孔板進(jìn)行Poly I:C轉(zhuǎn)染,收集細(xì)胞時(shí)先吸干培養(yǎng)基,再加入1 mL TriZol試劑,冰上處理10 min后,按TriZol試劑說明書中的方法提取總RNA,按1.6節(jié)方法制備cDNA。

    1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測和Western blot檢測

    采用UltraSYBR Mixture試劑,以-為內(nèi)參基因,使用MyiQ2 Two Color實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)測定-Ⅰ、和2的相對(duì)表達(dá)量(引物序列詳見表1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,39個(gè)循環(huán);65 ℃ 5 s,95 ℃ 5 s。反應(yīng)體系:6.25 μL 2×UltraSYBR Mixture,1.0 μL cDNA,0.25 μL上游引物(10 μmol·μL),0.25 μL下游引物(10 μmol·μL)和4.75 μL ddHO。

    用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶,電泳結(jié)束后用濕法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,用含5%(體積分?jǐn)?shù))脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h,再加入一抗在4 ℃孵育過夜,之后用TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,再加入二抗于室溫下孵育1 h,用TBST緩沖液洗膜3次后,利用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色,最后在Amershan Imager 680系統(tǒng)(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB)上成像。

    1.9 數(shù)據(jù)處理

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用Livak等的方法計(jì)算。采用Image-Pro Plus軟件量化Western blot圖像條帶的灰度值,獲得的數(shù)據(jù)在SPSS 22.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并開展獨(dú)立樣本檢驗(yàn),顯著性水平選定為α=0.05。

    表1 引物序列

    2 結(jié)果與分析

    2.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

    原代培養(yǎng)24 h后可觀察到少量細(xì)胞貼壁,此時(shí)細(xì)胞多呈成纖維樣,細(xì)胞體積較小,細(xì)胞間隙較大(圖1)。148 h后,細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中生長較好,貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯增加,基本鋪滿單層,此時(shí)可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞形態(tài)上與原代細(xì)胞一致,但細(xì)胞突起開始拉長,體積逐漸變大。傳代細(xì)胞增殖速度較快,2~3 d即可傳代一次。隨著傳代的進(jìn)行,細(xì)胞生長逐漸趨于穩(wěn)定,至本研究成文時(shí)已成功傳至20代。

    2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

    將凍存1個(gè)月的細(xì)胞從液氮中取出進(jìn)行復(fù)蘇,培養(yǎng)2 d后在顯微鏡下進(jìn)行觀察,細(xì)胞生長速度和形態(tài)與凍存前無明顯差別,繼續(xù)培養(yǎng)3~4 d,細(xì)胞可鋪滿單層,且可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)冷凍前、后的細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色(圖2),經(jīng)統(tǒng)計(jì),細(xì)胞存活率分別為(90.51±0.46)%和(82.95±0.61)%。

    圖1 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of primary culture and subculture of fibroblast from embryonic liver of Chinese soft-shelled turtle

    正常細(xì)胞染色后呈白色,死亡細(xì)胞染色后呈藍(lán)色。Living cells display white color, while the dead ones display blue color.圖2 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞凍存前(a)、后(b)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果Fig.2 Trypan blue staining of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle before (a) and after (b) cryopreservation

    2.3 細(xì)胞生長曲線測定

    中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的生長曲線呈典型的“S”形(圖3),符合細(xì)胞生長的一般規(guī)律。接種后細(xì)胞先處于潛伏期,2~7 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,8 d起細(xì)胞雖有生長,但速度減慢。經(jīng)計(jì)算,6代時(shí)細(xì)胞的倍增時(shí)間為59.9 h。

    2.4 細(xì)胞染色體觀察和分子鑒定

    選取100個(gè)中期分裂相的成纖維細(xì)胞(第10代)進(jìn)行染色體觀察和數(shù)目統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目在66條的比例為72%(圖4)。PCR擴(kuò)增后,獲得基因條帶和2基因條帶(圖5,分別對(duì)應(yīng)于544 bp和628 bp處)。

    2.5 Poly I:C轉(zhuǎn)染對(duì)中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的影響

    圖3 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的生長曲線Fig.3 Growth curve of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

    圖4 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞染色體Fig.4 Chromosome of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

    M,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1,ACTA2;2,VIM;3,GAPDH;4,H2O。M, DNA marker; 1, ACTA2; 2, VIM; 3, GAPDH; 4, H2O.圖5 中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的分子鑒定Fig.5 Molecular identification of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle

    用Poly I:C轉(zhuǎn)染中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞,在31 ℃條件下培養(yǎng)24 h后,大量細(xì)胞逐漸收縮成圓形,漂浮在培養(yǎng)瓶表面,而對(duì)照組的細(xì)胞仍密集均勻分布,細(xì)胞貼壁良好(圖6)。與對(duì)照組相比,Poly I:C轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了-Ⅰ基因的表達(dá)水平,而和2基因的表達(dá)量在Poly I:C轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào)(圖7)。與對(duì)照組相比,Poly I:C轉(zhuǎn)染后,RIG-Ⅰ、MAVS蛋白表達(dá)水平顯著增加,而IRF1蛋白表達(dá)水平無顯著變化(圖8、表2)。

    3 討論

    目前,由于缺乏中華鱉來源的細(xì)胞系,中華鱉病毒學(xué)、免疫學(xué),以及功能基因組學(xué)等方面的工作難以展開或進(jìn)展緩慢。原代培養(yǎng)是細(xì)胞系建立中最為關(guān)鍵的一步,只有原代細(xì)胞分離成功,才有可能成功建立細(xì)胞系。目前,常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法有直接提取法、消化分解法和組織塊培養(yǎng)法。其中,常用于龜鱉類細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要是2類:一類是組織遷移法,一類是胰蛋白酶消化法。兩種方法均可成功獲得可傳代的細(xì)胞。胰蛋白酶消化法是一種常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法,已在多個(gè)物種的原代培養(yǎng)中得到應(yīng)用。本研究在胰蛋白酶消化法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),采用40 μm細(xì)胞過濾器從組織中分離原代細(xì)胞,成功從中華鱉胚胎中分離、培養(yǎng)出肝成纖維細(xì)胞,得到了形狀、性能一致的細(xì)胞懸液,避免了培養(yǎng)液中大塊組織塊的存在,以及由此引起的多種細(xì)胞混雜,獲得的細(xì)胞可確定為單一的成纖維細(xì)胞。而且,本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)出的細(xì)胞貼壁較快,細(xì)胞量大,生長情況良好。

    圖6 Poly I:C轉(zhuǎn)染中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞24 h后的形態(tài)Fig.6 Morphology of embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C for 24 h

    標(biāo)*或**的分別表示對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。* and ** indicate significant difference between the control group and the transfection group at P<0.05 and P<0.01, respectively.圖7 Poly I:C轉(zhuǎn)染對(duì)中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞RIG-Ⅰ、m6A和YTHDF2基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Relative gene expression of RIG-Ⅰ, m6A and YTHDF2 in embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C

    圖8 Poly I:C轉(zhuǎn)染對(duì)中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞RIG-Ⅰ、MAVS和IRF1蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Protein expression of RIG-Ⅰ, MAVS and IRF1 in embryonic liver fibroblast of Chinese soft-shelled turtle transfected with Poly I:C

    表2 Western blot條帶量化灰度值

    在進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)操作時(shí),如果組織滅菌不徹底,容易引起細(xì)胞培養(yǎng)污染。中華鱉胚胎以蛋的形式存在,作為原材料,具有蛋內(nèi)無菌、蛋表面滅菌操作容易的特點(diǎn),操作相對(duì)簡便。此外,與成體相比,胚胎來源細(xì)胞分化能力強(qiáng),活力好,生長快,傳代代數(shù)更多。本試驗(yàn)獲得的細(xì)胞已傳20代,細(xì)胞活力正常。我們認(rèn)為,選用鱉的胚胎來進(jìn)行原代培養(yǎng),是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的一個(gè)關(guān)鍵所在。

    細(xì)胞體外培養(yǎng)會(huì)受到營養(yǎng)(糖、氨基酸、維生素等)和培養(yǎng)環(huán)境(溫度、CO濃度、滲透壓和pH等)的影響。中華鱉細(xì)胞培養(yǎng)中,常用的溫度包括25 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃和32 ℃。本實(shí)驗(yàn)參照郭海杰培養(yǎng)中華鱉心肌細(xì)胞的營養(yǎng)條件和環(huán)境,將培養(yǎng)溫度設(shè)定為31 ℃,選用DMEM高糖培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,F(xiàn)BS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。結(jié)果顯示,該條件下培養(yǎng)的中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞貼壁和增殖迅速,傳代后細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定,按1∶5比例進(jìn)行傳代時(shí),2~3 d即可傳代一次。

    本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)符合成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,初步鑒定為成纖維細(xì)胞。Wang等發(fā)現(xiàn),錦鯉腦細(xì)胞在生長初期主要以成纖維細(xì)胞為主,但傳代至第20代時(shí)上皮樣細(xì)胞逐漸成為主要形態(tài),因此僅憑形態(tài)學(xué)特征并不能準(zhǔn)確判斷其為成纖維細(xì)胞,通常還需要結(jié)合其他的特異性鑒定方法。關(guān)于成纖維細(xì)胞的鑒定,目前多采用免疫熒光的方法進(jìn)行鑒定。除此之外,也可以通過PCR法進(jìn)行鑒定。一般認(rèn)為,波形蛋白基因和肌動(dòng)蛋白基因2是成纖維細(xì)胞重要的分化標(biāo)記基因。主要負(fù)責(zé)維持細(xì)胞骨架的完整性,通常只在間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá);2是細(xì)胞骨架微絲、微管,以及肌小節(jié)的主要組成部分,存在于細(xì)胞質(zhì)中。曹代男等采用和2鑒定紅耳龜胚胎的成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)檢測到了和2的電泳條帶,證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。

    細(xì)胞核型正常是細(xì)胞研究工作的基礎(chǔ)。針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的克隆、基因編輯和轉(zhuǎn)基因等研究都需要核型正常的細(xì)胞。本研究所獲得的第10代細(xì)胞核型正常率為72%,表明培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)較好,屬于正常范疇。一般來說,隨著細(xì)胞傳代數(shù)的增加,細(xì)胞會(huì)越發(fā)衰老,核型異常的細(xì)胞比例會(huì)增大。本研究中細(xì)胞在第10代時(shí)核型正常比例仍較高,說明可用于后續(xù)研究。

    干擾素生成通路的機(jī)制在前言中已做簡要介紹,本研究涉及的因子包括RIG-Ⅰ、mA、YTHDF2、MAVS和IRF1。根據(jù)已知物種的作用機(jī)制,對(duì)干擾素生成具有正向調(diào)節(jié)作用的包括RIG-Ⅰ、MAVS和IRF1,具有反向調(diào)節(jié)作用的包括mA和YTHDF2。Poly I:C是一種模擬病毒RNA作用的雙鏈RNA模擬物,是實(shí)驗(yàn)中常用的一種免疫刺激物。本研究中,Poly I:C轉(zhuǎn)染提高了RIG-Ⅰ的基因和蛋白表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)了MAVS蛋白的表達(dá)水平,而和2基因的表達(dá)水平則顯著降低。這表明,Poly I:C轉(zhuǎn)染下,干擾素生成通路被激活,且促進(jìn)了干擾素的生成,進(jìn)而可產(chǎn)生抑制病毒的作用。由此可知,中華鱉干擾素生成通路的機(jī)制與其他物種存在一致性。Vats等證實(shí),Poly I:C刺激能夠顯著提高水牛()成纖維細(xì)胞-Ⅰ基因的表達(dá)水平。在水生動(dòng)物中,Chen等研究表明,Poly I:C刺激草魚原代腎細(xì)胞24 h后,-Ⅰ基因的表達(dá)水平提高。Kim等研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)2顯著降低了Poly I:C誘導(dǎo)的干擾素調(diào)節(jié)因子3和干擾素基因-的表達(dá)水平。

    本研究對(duì)干擾素生成通路進(jìn)行Poly I:C刺激實(shí)驗(yàn)時(shí),檢測指標(biāo)包括基因表達(dá)(-Ⅰ、和2)和蛋白表達(dá)(RIG-Ⅰ,MAVS和IRF1),除了RIG-Ⅰ同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR和Western blot檢測外,其他因子受限于現(xiàn)有的基因序列和抗體,均只進(jìn)行一種檢測,但是基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的單一結(jié)果也能夠說明因子的變化趨勢。

    綜上,本實(shí)驗(yàn)成功建立了中華鱉胚胎肝成纖維細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)體系,培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞具有可穩(wěn)定傳代、生長快和分化程度低等特點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,采用Poly I:C轉(zhuǎn)染的方法成功激活了細(xì)胞干擾素生成通路的相關(guān)因子,為后續(xù)該通路的研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。

    猜你喜歡
    傳代原代纖維細(xì)胞
    嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌遺傳性對(duì)其益生特性及貨架期菌數(shù)的影響
    塞尼卡病毒A在BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)條件探索
    Tiger17促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移
    滇南小耳豬膽道成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定
    改良無血清法培養(yǎng)新生SD乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞
    新生大鼠右心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
    艾迪注射液對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2、CYP3A2酶活性的影響
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:32
    微生物實(shí)驗(yàn)室菌種復(fù)蘇傳代保存流程分析
    胃癌組織中成纖維細(xì)胞生長因子19和成纖維細(xì)胞生長因子受體4的表達(dá)及臨床意義
    兩種制備大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的方法比較
    日本三级黄在线观看| 91av网一区二区| 亚洲av成人av| 午夜福利在线观看吧| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产日韩欧美在线精品| 日本免费在线观看一区| 我的女老师完整版在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 韩国高清视频一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩中字成人| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲成人久久爱视频| 国产乱人偷精品视频| 国产探花极品一区二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美精品国产亚洲| 久久久色成人| 久久久久久久久久久丰满| 中国美白少妇内射xxxbb| 1000部很黄的大片| 高清av免费在线| 午夜老司机福利剧场| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品自拍成人| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av成人av| 中国国产av一级| 中国国产av一级| 久久精品久久精品一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲精品,欧美精品| 有码 亚洲区| 午夜福利视频1000在线观看| 精品久久久噜噜| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品一及| 亚洲高清免费不卡视频| 中文字幕免费在线视频6| 人妻一区二区av| 亚洲精品自拍成人| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精品日本国产第一区| 国产成人a区在线观看| .国产精品久久| 久久精品国产自在天天线| 视频中文字幕在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 夜夜爽夜夜爽视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 在线免费观看的www视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品国产av蜜桃| 内射极品少妇av片p| 国产极品天堂在线| 舔av片在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲成人av在线免费| 热99在线观看视频| 丝袜美腿在线中文| 欧美高清性xxxxhd video| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产黄频视频在线观看| 国产综合精华液| 婷婷色av中文字幕| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品久久久久久久久亚洲| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品不卡视频一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 偷拍熟女少妇极品色| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲,欧美,日韩| 22中文网久久字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 中文字幕免费在线视频6| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲av成人精品一二三区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久热久热在线精品观看| 最近中文字幕2019免费版| 久久久成人免费电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 日日啪夜夜撸| .国产精品久久| 国产一区二区三区av在线| 久久久成人免费电影| 91av网一区二区| 草草在线视频免费看| 亚洲自偷自拍三级| 国产中年淑女户外野战色| 在线播放无遮挡| av播播在线观看一区| 超碰av人人做人人爽久久| 国产毛片a区久久久久| 国产永久视频网站| 欧美一区二区亚洲| 高清毛片免费看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 好男人视频免费观看在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产成人免费观看mmmm| 在线免费十八禁| 亚洲三级黄色毛片| 男女边摸边吃奶| 日韩强制内射视频| 国产精品久久久久久久久免| 久久鲁丝午夜福利片| 成人国产麻豆网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲人成网站高清观看| 免费高清在线观看视频在线观看| or卡值多少钱| 直男gayav资源| 欧美区成人在线视频| 精品午夜福利在线看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 青春草视频在线免费观看| 免费观看av网站的网址| 国内揄拍国产精品人妻在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日日撸夜夜添| 久久99热6这里只有精品| 亚洲最大成人中文| 国产精品人妻久久久影院| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲性久久影院| 日韩伦理黄色片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成人一区二区视频在线观看| av免费观看日本| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| a级一级毛片免费在线观看| 精品人妻视频免费看| 天天躁日日操中文字幕| 日韩欧美一区视频在线观看 | 九九爱精品视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美精品国产亚洲| 中文字幕免费在线视频6| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 你懂的网址亚洲精品在线观看| 五月开心婷婷网| 九九爱精品视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 看非洲黑人一级黄片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 曰老女人黄片| 欧美成人午夜免费资源| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产欧美亚洲国产| 电影成人av| 天堂8中文在线网| 亚洲精品第二区| 伦精品一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 在线观看美女被高潮喷水网站| 婷婷成人精品国产| 国产在线免费精品| 日本午夜av视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久久久免费高清国产稀缺| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 黄色一级大片看看| www.av在线官网国产| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲熟女精品中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月| a级毛片黄视频| 久久这里有精品视频免费| 久久久国产精品麻豆| 国产淫语在线视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 五月开心婷婷网| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美精品av麻豆av| 亚洲精品一区蜜桃| 黄频高清免费视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 婷婷成人精品国产| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 婷婷色综合大香蕉| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲第一青青草原| 国产男人的电影天堂91| 我要看黄色一级片免费的| 国产不卡av网站在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看免费高清a一片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日韩人妻精品一区2区三区| 一级片'在线观看视频| av国产精品久久久久影院| 999精品在线视频| 黄片小视频在线播放| 性少妇av在线| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 美女国产视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品福利久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 大话2 男鬼变身卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产xxxxx性猛交| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲美女黄色视频免费看| 99香蕉大伊视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线观看免费高清a一片| 一区福利在线观看| 18在线观看网站| 日韩免费高清中文字幕av| 国产淫语在线视频| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产欧美网| 热99久久久久精品小说推荐| 久久精品国产自在天天线| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人一区二区在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久视频综合| 国产乱人偷精品视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 最新的欧美精品一区二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 飞空精品影院首页| 伊人亚洲综合成人网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 免费日韩欧美在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人欧美| 久久99一区二区三区| 最新中文字幕久久久久| 免费日韩欧美在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 激情五月婷婷亚洲| 精品亚洲成a人片在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 99香蕉大伊视频| 午夜91福利影院| 伦精品一区二区三区| 久久这里只有精品19| 亚洲精品在线美女| 香蕉丝袜av| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品在线美女| 久久久欧美国产精品| 亚洲天堂av无毛| 最近的中文字幕免费完整| 成年人免费黄色播放视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产高清国产精品国产三级| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日本免费在线观看一区| 久久97久久精品| 美女午夜性视频免费| 久久99蜜桃精品久久| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品日本国产第一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 街头女战士在线观看网站| 99久久综合免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一级毛片 在线播放| 国产亚洲一区二区精品| 国产成人精品久久久久久| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产看品久久| 午夜av观看不卡| 久久人人爽人人片av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 午夜久久久在线观看| 激情视频va一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 色视频在线一区二区三区| kizo精华| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日日啪夜夜爽| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 香蕉丝袜av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲综合色惰| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲美女黄色视频免费看| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av电影在线进入| xxxhd国产人妻xxx| 一级爰片在线观看| 亚洲av福利一区| 高清在线视频一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 激情视频va一区二区三区| 香蕉丝袜av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产不卡av网站在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品久久久久久久性| 18在线观看网站| 国产成人av激情在线播放| 日韩一区二区视频免费看| 七月丁香在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲天堂av无毛| a级毛片黄视频| 国产成人精品久久久久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲,欧美,日韩| av免费在线看不卡| 91成人精品电影| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 两性夫妻黄色片| 久久人人爽人人片av| 1024视频免费在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 秋霞在线观看毛片| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品国产自在天天线| 久久久久久久大尺度免费视频| 香蕉国产在线看| 啦啦啦啦在线视频资源| 美女主播在线视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日韩一级在线毛片| 999久久久国产精品视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 午夜免费观看性视频| 日韩av免费高清视频| 国产免费又黄又爽又色| 一级片'在线观看视频| 午夜影院在线不卡| 国产激情久久老熟女| 精品一区二区三卡| 有码 亚洲区| 国产淫语在线视频| 国产视频首页在线观看| 亚洲国产精品999| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美精品av麻豆av| 2022亚洲国产成人精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产黄频视频在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 免费观看av网站的网址| 欧美日韩av久久| 美女高潮到喷水免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产乱来视频区| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品国产乱码久久久久久男人| 777米奇影视久久| 国产高清国产精品国产三级| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 青春草视频在线免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品第二区| 国产黄频视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 街头女战士在线观看网站| 不卡av一区二区三区| 香蕉丝袜av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美日本中文国产一区发布| 99九九在线精品视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 我的亚洲天堂| 亚洲,欧美精品.| 人人澡人人妻人| 欧美在线黄色| 亚洲av男天堂| 在线观看一区二区三区激情| 久久这里只有精品19| 久久久国产欧美日韩av| 少妇人妻久久综合中文| 少妇精品久久久久久久| 色吧在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 色吧在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 一区在线观看完整版| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 如何舔出高潮| 亚洲伊人久久精品综合| 三上悠亚av全集在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 久久人人爽人人片av| 只有这里有精品99| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 超碰成人久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧美清纯卡通| 国产免费现黄频在线看| www日本在线高清视频| videosex国产| 不卡av一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 丰满少妇做爰视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 捣出白浆h1v1| 亚洲欧美一区二区三区久久| 永久免费av网站大全| 人妻人人澡人人爽人人| a级毛片在线看网站| videossex国产| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美精品一区二区大全| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中文欧美无线码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 中文欧美无线码| av线在线观看网站| 中文字幕色久视频| 91成人精品电影| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 97精品久久久久久久久久精品| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲av综合色区一区| 男女下面插进去视频免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日本av免费视频播放| 久久精品久久久久久久性| 久久这里只有精品19| 亚洲国产成人一精品久久久| 777米奇影视久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 伦理电影免费视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久国产精品大桥未久av| 大片免费播放器 马上看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 老司机亚洲免费影院| 国产黄频视频在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产精品一国产av| 亚洲精品日本国产第一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 免费观看在线日韩| 日韩一区二区三区影片| 中文欧美无线码| videos熟女内射| 中国三级夫妇交换| 久久av网站| 七月丁香在线播放| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲人成网站在线观看播放| 99久久综合免费| 久久免费观看电影| 人妻系列 视频| 少妇人妻 视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产亚洲最大av| 90打野战视频偷拍视频| 欧美日韩av久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲精品第二区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 中国三级夫妇交换| 国产精品不卡视频一区二区| av网站在线播放免费| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 天堂中文最新版在线下载| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产黄频视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产在视频线精品| 99国产综合亚洲精品| 人妻系列 视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品一区在线观看国产| 两个人免费观看高清视频| 亚洲成人手机| 色94色欧美一区二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 一区二区三区精品91| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美中文综合在线视频| 大香蕉久久网| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩人妻精品一区2区三区| 老司机影院成人| 亚洲天堂av无毛| 精品视频人人做人人爽| 中文字幕av电影在线播放| 成人免费观看视频高清| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲伊人色综图| 成人漫画全彩无遮挡| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品国产av成人精品| 日本av免费视频播放| 欧美97在线视频| 久久久久视频综合| 99香蕉大伊视频| 高清在线视频一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 精品亚洲成国产av| 日本爱情动作片www.在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美日韩精品网址| 2022亚洲国产成人精品| 午夜影院在线不卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 少妇熟女欧美另类| 观看av在线不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 制服丝袜香蕉在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲欧洲日产国产| 熟女av电影| 老司机亚洲免费影院| 成人国产麻豆网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 男女边吃奶边做爰视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲伊人色综图| 久久影院123| 午夜福利在线免费观看网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品人妻久久久影院| 久久久欧美国产精品| 亚洲四区av| 亚洲欧洲国产日韩| 免费黄网站久久成人精品| 久久影院123| 国产福利在线免费观看视频| 我要看黄色一级片免费的| 波多野结衣一区麻豆| av视频免费观看在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 人人妻人人澡人人看| 999精品在线视频| 亚洲精品乱久久久久久| 少妇的逼水好多| 久久久久视频综合| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美日韩视频精品一区|