芍藥苷對糖尿病腎病模型大鼠腎臟的保護(hù)作用及作用機(jī)制*

趙洪霄，李 英，張金穎，陳俊玲，陶艷麗，王學(xué)武

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830000）

糖尿病腎?。―N）為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床主要表現(xiàn)為水腫、蛋白尿、高血壓、腎功能不全等腎臟病變，是導(dǎo)致患者病情向終末期腎病進(jìn)展，并引起腎臟衰竭的主要原因，但目前尚無能阻止DN進(jìn)展的有效方法［1］。腎臟炎癥與氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用［2］，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/核因子?κB（NF?κB）信號通路與炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)途徑的激活密切相關(guān)［3］，以SIRT1/Nrf2/NF?κB作為靶標(biāo)可能成為抑制DN氧化應(yīng)激及炎癥，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的潛在治療策略。芍藥苷為白芍總苷中的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、利尿等多種藥理學(xué)作用［4］，能減輕DN模型小鼠腎組織損傷程度，改善腎組織炎性反應(yīng)［5］，但尚未明確其對DN的作用機(jī)制是否與SIRT1/Nrf2/NF?κB通路相關(guān)。本研究中通過對大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）復(fù)制DN模型，探討了芍藥苷灌胃對DN模型大鼠腎功能的保護(hù)作用及作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥及動(dòng)物

儀器：ACCU?CHEK Advantage型血糖儀（德國羅氏公司）；7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；iMark型酶標(biāo)儀、EC3型聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置、電泳儀（美國Bio?Rad公司）；Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：芍藥苷（中國食品藥品檢定研究院，批號為S02001601）；卡托普利片（常州制藥有限公司，批號為991023?3，規(guī)格為每片25 mg）；STZ（美國Sigma公司，批號為2201601）；蘇木精?伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為2041S02）；腫瘤壞死因子?α（TNF?α，批號為20200211），白細(xì)胞介素1β（IL?1β，批號為20200318），白細(xì)胞介素6（IL?6，批號為20200109），超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD，批 號 為20200217），丙二醛（MDA，批號為20200108），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px，批號為20200123）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒，均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；SIRT1（批號為0104623），Nrf2（批號為0206725），NF?κB p65（批號為0203528），β?actin（批號為0106416）一抗，均購自Santa Crutz Biotechnology Inc.。

動(dòng)物：SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號為SCXK（新）2018?0002，飼養(yǎng)于溫度為20～25℃、相對濕度為50%～65%的SPF環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

建模、分組及給藥：隨機(jī)選取10只SD大鼠作為空白組，其余大鼠均一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，空白組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。注射72 h后尾靜脈取血，并收集大鼠24 h內(nèi)的尿液，檢測各組大鼠空腹血糖及24 h尿蛋白定量（24 hpro），以連續(xù)3次血糖達(dá)到并超過16.7 mmol/L，24 hpro>30 mg為建模成功［6］。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷高劑量組，各10只。芍藥苷低、高劑量組分別灌胃芍藥苷50，100 mg/kg，陽性對照組灌胃卡托普利30 mg/kg，空白組及模型組大鼠均予等體積生理鹽水（每100 g體質(zhì)量1 mL），每日1次，連續(xù)8周。

血、尿及生化指標(biāo)觀察：各組治療結(jié)束后，以代謝籠收集大鼠24 h尿液，檢測24 hpro；于大鼠腹主動(dòng)脈取血，分離血清，采用ACCU?CHEK Advantage型血糖儀測定空腹血糖，采用7600型自動(dòng)生化分析儀檢測血清中尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）水平。

腎組織病理形態(tài)觀察：大鼠腹主動(dòng)脈取血，處死，解剖后取部分腎組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片機(jī)切片5μm后進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片，采用Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡觀察腎組織的病理形態(tài)。

腎組織中TNF?α，IL?1β，IL?6，SOD，GSH?Px，MDA水平檢測（ELISA法）：取大鼠腎組織500 mg，置預(yù)冷生理鹽水中制成10%腎組織勻漿，以8 500 r/min的速率離心15 min，取上清液。采用ELISA法測定大鼠腎組織勻漿上清液中TNF?α，IL?1β，IL?6，MDA的水平及SOD，GSH?Px的活性。于酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度（OD），并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各指標(biāo)含量。

腎組織中SIRT1，Nrf2，NF?κB p65蛋白表達(dá)水平檢測［蛋白免疫印跡（Western blot）法］：取大鼠腎組織100 mg，勻漿后加入RIPA裂解液，提取組織總蛋白，采用蛋白質(zhì)定量（BCA）法于652 nm波長下測定SIRT1，Nrf2，NF?κB p65蛋白的濃度。將各蛋白樣本稀釋到固定濃度（5 μg/mL），制備12%分離膠和5%濃縮膠；加入10μL蛋白樣品，電泳分離，冰上轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，滴加顯影液，凝膠成像并拍照，采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

腎組織中SIRT1，Nrf2，NF?κB p65 mRNA表達(dá)水平檢測（Western blot法）：取大鼠腎組織50 mg，采用Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，以β?actin為參照。反應(yīng)參數(shù)為95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。用相對定量2?ΔΔCt法分析SIRT1，Nrf2，NF?κB p65 mRNA的表達(dá)量?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)數(shù)資料以±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，組內(nèi)行單因素方差分析比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖及24 hpro，BUN，Cr水平

與空白組比較，模型組大鼠的血糖及24 hpro，血清BUN，Cr水平均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組大鼠上述指標(biāo)水平均明顯降低（P<0.05），且芍藥苷高劑量組較低劑量組改善更明顯。結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷對各組大鼠血糖及24 hpro，BUN，Cr水平的影響比較（±s，n=10）Tab.2 Effect of paeoniflorin on blood glucose and 24 hpro，BUN and Cr levels of rats in each group（±s，n=10）

表2 芍藥苷對各組大鼠血糖及24 hpro，BUN，Cr水平的影響比較（±s，n=10）Tab.2 Effect of paeoniflorin on blood glucose and 24 hpro，BUN and Cr levels of rats in each group（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2、表3至表5同。Note：Compared with those in the blank group，*P<0.05，**P<0.01（for Tab.2?5 and Fig.2）；Compared with those in the model group，#P<0.05，##P<0.01（for Tab.2?5 and Fig.2）.

組別空白組模型組陽性對照組芍藥苷低劑量組芍藥苷高劑量組血糖（mmol/L）7.46±2.49 28.17±9.62**11.68±4.60*##19.34±5.06**#15.92±6.83**##24 hpro（mg）13.42±2.88 76.41±11.32**29.59±7.45**##42.08±5.73**##35.59±9.27**##BUN（mmol/L）5.13±0.77 14.06±1.34**7.34±1.45**##10.48±1.14**##8.05±1.33**##Cr（mmol/L）22.57±3.04 45.19±8.09**26.57±5.30**##36.28±6.95**#30.36±4.75**##

2.2 腎組織病理形態(tài)

與空白組比較，模型組大鼠造模后出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦等糖尿病典型癥狀，體質(zhì)量明顯下降，反應(yīng)遲鈍，毛色失去光澤。陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組灌胃給藥后，癥狀較模型組減輕，體質(zhì)量下降減緩，精神狀態(tài)及毛色改善。HE染色顯示，空白組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見異常變化；模型組大鼠腎小球面積增大，囊腔縮小，系膜及基底膜增生，腎間質(zhì)充血，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡變性，并伴有炎性細(xì)胞浸潤；陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組大鼠腎小球面積縮小，腎小球系膜、基底膜增生，腎間質(zhì)充血及腎小管上皮水腫情況均減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，大鼠腎組織損傷明顯改善。詳見圖1。

2.3 腎組織中TNF-α，IL-1β，IL-6水平

與空白組比較，模型組大鼠腎組織中TNF?α，IL?1β，IL?6水平均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組大鼠腎組織中上述指標(biāo)均明顯降低（P<0.05），且芍藥苷高劑量組較低劑量組降低更明顯。結(jié)果見表3。

表3 芍藥苷對各組大鼠腎組織中TNF-α，IL-1β，IL-6水平的影響比較（±s，ng/mL，n=10）Tab.3 Effect of paeoniflorin on the TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in rats of each group（±s，ng/mL，n=10）

表3 芍藥苷對各組大鼠腎組織中TNF-α，IL-1β，IL-6水平的影響比較（±s，ng/mL，n=10）Tab.3 Effect of paeoniflorin on the TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in rats of each group（±s，ng/mL，n=10）

組別空白組模型組陽性對照組芍藥苷低劑量組芍藥苷高劑量組TNF?α 1.240±0.310 3.520±0.500**1.630±0.450##2.140±0.720*##1.860±0.830*##IL?1β 0.146±0.017 0.483±0.054**0.195±0.061*##0.278±0.089**##0.212±0.033**##IL?6 97.490±24.210 187.050±32.670**126.500±37.150##149.780±41.540**#135.070±30.190*##

2.4 腎組織中SOD，GSH-Px活性及MDA含量

與空白組比較，模型組大鼠腎組織中SOD和GSH?Px的活性均明顯下降，MDA含量明顯增多（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組大鼠腎組織中SOD和GSH?Px的活性均明顯升高，MDA含量明顯減少（P<0.01），且芍藥苷高劑量組較低劑量組改善更明顯。結(jié)果見表4。

表4 芍藥苷對各組大鼠腎組織中SOD，GSH-Px活性及MDA含量的影響比較（±s，n=10）Tab.4 Effect of paeoniflorin on SOD，GSH-Px activity and MDA content in renal tissue of rats in each group（±s，n=10）

表4 芍藥苷對各組大鼠腎組織中SOD，GSH-Px活性及MDA含量的影響比較（±s，n=10）Tab.4 Effect of paeoniflorin on SOD，GSH-Px activity and MDA content in renal tissue of rats in each group（±s，n=10）

組別空白組模型組陽性對照組芍藥苷低劑量組芍藥苷高劑量組SOD（U/L）457.62±35.03 226.59±29.70**378.51±26.48**##318.79±31.24**##342.90±34.37**##GSH?Px（U/L）57.42±6.74 31.03±4.98**49.52±6.35**##38.25±5.44**##43.18±7.59**##MDA（nmol/L）2.56±0.35 4.87±0.23**2.90±0.26*##3.49±0.28**##3.11±0.42**##

2.5 腎組織中SIRT1，Nrf2，NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

與空白組比較，模型組大鼠腎組織中SIRT1和Nrf2的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，NF?κB p65的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組大鼠腎組織中SIRT1和Nrf2的蛋白表達(dá)水平均明顯升高，NF?κB p65的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。詳見圖2。

A.空白組B.模型組C.陽性對照組D.芍藥苷低劑量組E.芍藥苷高劑量組圖1各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)（HE染色，×200）A.Blank group B.Model group C.Positive control group D.Paeoniflorin low?dose group E.Paeoniflorin high?dose groupFig.1 Patholmorphology of renal tissue of rats in each group（HE staining，×200）

2.6 腎組織中SIRT1，Nrf2，NF-κBp65mRNA表達(dá)水平

與空白組比較，模型組大鼠腎組織中SIRT1和Nrf2的mRNA表達(dá)水平均明顯降低，NF?κB p65的mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組及芍藥苷低、高劑量組大鼠腎組織中SIRT1和Nrf2的mRNA表達(dá)水平均明顯升高，NF?κB p65的表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見表5。

表5 芍藥苷對各組大鼠腎組織中SIRT1，Nrf2，NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的影響比較（±s，n=10）Tab.5 Effect of paeoniflorin on SIRT1，Nrf2 and NF-κB p65 mRNA expression levels in renal tissue of rats in each group（±s，n=10）

表5 芍藥苷對各組大鼠腎組織中SIRT1，Nrf2，NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的影響比較（±s，n=10）Tab.5 Effect of paeoniflorin on SIRT1，Nrf2 and NF-κB p65 mRNA expression levels in renal tissue of rats in each group（±s，n=10）

組別空白組模型組陽性對照組芍藥苷低劑量組芍藥苷高劑量組SIRT1 0.59±0.03 0.25±0.04**0.48±0.06**##0.36±0.04**##0.42±0.05**##Nrf2 0.73±0.05 0.30±0.02**0.58±0.04**##0.47±0.05**##0.55±0.04**##NF?κB p65 0.15±0.04 0.68±0.03**0.32±0.04**##0.52±0.06**##0.41±0.05**##

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制與腎臟炎癥及氧化應(yīng)激引起的腎功能損傷密切相關(guān)［2］，其導(dǎo)致的持續(xù)高糖狀態(tài)能引起機(jī)體的蛋白、脂類、DNA等發(fā)生改變，使機(jī)體抗氧化能力減弱，活性氧生成過量，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，還可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種炎性因子表達(dá)，進(jìn)一步加重腎功能損傷［7?8］。

SIRT1是一類組蛋白去乙?；?，能調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生理病理活動(dòng)［9］，Nrf2等多種轉(zhuǎn)錄因子脫乙?；瑥亩绊懠?xì)胞內(nèi)炎癥與氧化應(yīng)激相關(guān)途徑的激活［10］。Nrf2是調(diào)控內(nèi)源性抗氧化途徑的一種核心轉(zhuǎn)錄因子，靜止?fàn)顟B(tài)下與kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中，活化的SIRT1能改變Keap1的構(gòu)象，使Nrf2與其解離，易位進(jìn)入細(xì)胞核而被激活，激活的Nrf2能調(diào)節(jié)抗氧化途徑，提高組織和細(xì)胞的抗氧化能力，從而減輕腎臟氧化應(yīng)激程度［11?12］。此外，Nrf2的活化還可通過調(diào)控NF?κB，抑制腎組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［13］。NF?κB是一種常見的促炎轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤及炎性細(xì)胞因子分泌，在多種炎性疾病中發(fā)揮作用［14］。SIRT1可通過使NF?κB p65亞基去乙?；种芅F?κB活化，抑制其下游炎性因子的過度表達(dá)，阻止炎性進(jìn)程［15］。SIRT1的活化可促進(jìn)NRf2表達(dá)，并抑制NF?κB的轉(zhuǎn)錄活性，以SIRT1/Nrf2/NF?κB信號通路作為靶標(biāo)，可能成為抑制DN氧化應(yīng)激及炎癥，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的潛在治療策略。

白芍總苷是從毛茛科植物芍藥的干燥根中提取的一種糖苷類物質(zhì)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等功效，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫反應(yīng)疾病的治療中發(fā)揮重要作用［16］。芍藥苷是白芍總苷中的主要生物活性成分，能減輕DN模型小鼠腎組織損傷狀態(tài)，改善腎組織炎性反應(yīng)，但其對DN的潛在作用機(jī)制還未完全闡明。

本研究結(jié)果顯示，芍藥苷干預(yù)后DN模型大鼠一般癥狀較模型組明顯改善，24 hpro及空腹血糖水平均明顯降低。BUN和Cr是反映腎功能的重要指標(biāo)［17］，芍藥苷灌胃給藥后，DN模型大鼠血清中BUN及Cr的水平均較模型組明顯降低，提示芍藥苷能減輕DN模型大鼠癥狀，改善腎功能損傷，對DN具有明顯的治療作用。DN腎組織病理學(xué)特征主要為腎小球增大，系膜及基底膜增厚，腎小管上皮水腫，炎性細(xì)胞浸潤等［18］。由圖1可知，芍藥苷能有效改善DN模型大鼠腎小球及腎小管組織學(xué)損傷狀態(tài)，說明其能修復(fù)受損腎組織，在病理學(xué)層面證實(shí)其對DN腎功能的保護(hù)作用。腎臟炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)能刺激細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，與DN的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)［19］。由表3可知，經(jīng)芍藥苷干預(yù)后，DN模型大鼠腎組織勻漿中的TNF?α，IL?1β，IL?6促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平均較模型組明顯降低。SOD是體內(nèi)氧自由基的天然清除劑，對于維持機(jī)體抗氧化能力具有重要作用；GSH?Px能清除體內(nèi)有毒過氧化物，阻斷自由基損傷，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)［20］；MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的多少可反映機(jī)體氧化損傷程度［21］。由表4可知，經(jīng)芍藥苷干預(yù)后，DN模型大鼠腎組織勻漿中MDA含量較模型組明顯減少，SOD及GSH?Px活性均較模型組明顯升高，提示芍藥苷可抑制DN模型大鼠腎臟炎性反應(yīng)，改善體內(nèi)過氧化狀態(tài)，從而減輕腎組織損傷程度，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。由圖2和表5可知，芍藥苷明顯上調(diào)了DN模型大鼠腎組織中SIRT1和Nrf2的蛋白及mRNA的表達(dá)，下調(diào)了NF?κB p65的表達(dá)，提示其對DN模型大鼠的腎臟保護(hù)作用可能與調(diào)控SIRT1/Nrf2/NF?κB途徑相關(guān)。

a.空白組b.模型組c.陽性對照組d.芍藥苷低劑量組e.芍藥苷高劑量組A.電泳圖B1?B3.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（分別為SIRT1，Nrf2，NF?κB p65）圖2各組大鼠腎組織中SIRT1，Nrf2，NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平a.Blank group b.Model group c.Positive control group d.Paeoniflorin low?dose group e.Paeoniflorin high?dose groupA.Electrophoretogram B1?B3.Data statistics（SIRT1，Nrf2，NF?κB p65，respectively）Fig.2 The expression levels of SIRT1，Nrf2 and NF-κB p65 protein in renal tissue of rats in each group

綜上所述，芍藥苷能明顯改善DN模型大鼠的腎臟損傷狀態(tài)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控SIRT1/Nrf2/NF?κB信號通路，減輕腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性反應(yīng)有關(guān)。