黃精發(fā)酵體系中植物乳桿菌的分離鑒定和MTT法活菌快速檢測(cè)研究

金劍 勞嘉 鐘燦 肖文廣 曾宏亮 胡國(guó)安 賀煒 張水寒

〔摘要〕 目的 從黃精發(fā)酵體系中分離鑒定益生菌，并建立其快速檢測(cè)方法。方法 通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、16S rRNA基因序列測(cè)定和同源性分析對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定，采用MTT法建立快速檢測(cè)方法。結(jié)果 從鮮黃精發(fā)酵體系中分離獲得一株乳酸菌，鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）;建立了植物乳桿菌檢測(cè)的MTT法，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)最佳波長(zhǎng)為545 nm，適宜染色時(shí)間為2 h，最低檢測(cè)度為活菌濃度為107 CFU/mL，在活菌濃度為7×107～3×108 CFU/mL范圍內(nèi)，植物乳桿菌樣品活菌濃度與545 nm處OD呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。結(jié)論 從黃精發(fā)酵體系中分離純化了一株植物乳桿菌，可以通過(guò)MTT法快速檢測(cè)其活菌總數(shù)，為益生菌活菌快速檢測(cè)提供了參考。

〔關(guān)鍵詞〕 黃精;益生菌;植物乳桿菌;MTT法;快速檢測(cè)

〔中圖分類號(hào)〕R283? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.013

Isolation and identification of lactic acid bacteria from fermented broth of

polygonatum and fast detection of live bacteria by MTT method

JIN Jian1， LAO Jia2， ZHONG Can1， XIAO Wenguang3， ZENG Hongliang1， HU Guoan2， HE Wei2*， ZHANG Shuihan1

（1. Institute of Chinese Materia Medica， Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China;

2. Resgreen Group International Inc.， Changsha， Hunan 410329， China;

3. Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou， Hunan 412008， China）

〔Abstract〕 Objective To isolate and identify probiotics from the fermented broth of polygonatum， and to establish a rapid detection method. Methods The isolated strains were identified by morphological observation， Gram staining， 16S rRNA gene sequence determination and homology analysis， and the rapid detection method was established by MTT method. Results A strain of lactic acid bacteria was isolated from the fresh polygonatum fermentation broth and was identified as Lactobacillus plantarum. MTT method for the detection of Lactobacillus plantarum was established. The study found that the best wavelength was 545 nm， the suitable staining time was 2 h， and the minimum detection of the concentration of live bacteria was 107 CFU/mL. In the range of the concentration of live bacteria from 7×107 CFU/mL to 3×108 CFU/mL， live bacteria concentration of the Lactobacillus plantarum and the OD at 545 nm showed a good linear relationship. Conclusion A strain of Lactobacillus plantarum was isolated and purified from the fermented broth of polygonatum. The total number of live bacteria can be quickly detected by the MTT method， which provides a reference for the rapid detection of probiotics.

〔Keywords〕 polygonatum; probiotics; Lactobacillus plantarum; MTT method; rapid detection

黃精是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥食兩用資源，其具有抗氧化、降血糖、抗疲勞、提高免疫等多種藥理作用[1]。作為藥食兩用資源，雖然近年來(lái)有黃精酸奶[2]、黃精山楂酸奶[3]等產(chǎn)品報(bào)道，但總體而言黃精的產(chǎn)品形式較為單一，傳統(tǒng)黃精的主要產(chǎn)品形式是蒸制之后的黃精飲片[4-5]。酵素作為新型的產(chǎn)品形式越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，而黃精通過(guò)發(fā)酵技術(shù)不僅可以改善口感，還可拓寬中藥資源黃精的產(chǎn)品范圍[6]。通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)食用酵素成為藥食同源產(chǎn)業(yè)研究的一個(gè)新熱點(diǎn)[7]。例如人參酵素[8]、鐵皮石斛酵素[9]和歸芪參草功能酵素[10]等，都已開展了相關(guān)研究。楊婧娟等[6]進(jìn)行了黃精發(fā)酵工藝的初步研究。陳安徽等[11]分析了黃精酵素口服液中鈣、鐵和鋅的形態(tài)。胡佳麗等[12]關(guān)注了黃精發(fā)酵過(guò)程中洛伐他汀、皂苷等含量與色澤的相關(guān)性。鐘燦等[13]對(duì)黃精發(fā)酵體系酶活力變化進(jìn)行了報(bào)道，分析了黃精發(fā)酵過(guò)程中甜度、pH值、抗氧化活性、蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性的動(dòng)態(tài)變化，為黃精酵素的工藝優(yōu)化和產(chǎn)品研發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐，促進(jìn)了黃精發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

發(fā)酵體系中一個(gè)關(guān)鍵的因素是微生物，以益生菌為主。研究藥食同源發(fā)酵，離不開對(duì)益生菌的分離、鑒定和活力檢測(cè)。隨著細(xì)胞生物學(xué)的不斷發(fā)展，微生物計(jì)數(shù)在科研和生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用。目前，通過(guò)平板稀釋計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌總數(shù)應(yīng)用廣泛，但操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確度偏低且易受環(huán)境雜菌污染，有必要建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確并可反映細(xì)菌活性的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，噻唑藍(lán)[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3， 5-di-phenytetrazoliumromide， MTT]法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)，已開始應(yīng)用于益生菌活菌數(shù)快速檢測(cè)研究[14-15]。MTT法能夠快速測(cè)定益生菌活菌數(shù)目，但其精確度與細(xì)菌種類、生長(zhǎng)狀態(tài)及其代謝產(chǎn)物有關(guān)[16]。目前，在黃精發(fā)酵體系中暫未有相關(guān)研究報(bào)道。本研究在黃精發(fā)酵體系中，通過(guò)分離純化和鑒定篩選出了一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），建立了MTT快速檢測(cè)方法，對(duì)益生菌發(fā)酵體系的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料

MTT（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y11M11k109515）;鮮黃精購(gòu)自新化縣頤樸源黃精科技有限公司，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院劉浩副研究員鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），系《中華人民共和國(guó)藥典》一部[17]所收載的品種。

1.2? 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司，型號(hào)：UV755B）;振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號(hào)：Vortex-5）;立式高壓蒸鍋（上海申安醫(yī)療器械廠，型號(hào)：LDZX-75KRBS）;潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1FD）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：Multifuge X1R）;顯微鏡（日本東京Olympus公司，型號(hào)：Olympus CX31）;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀（德國(guó)漢堡Eppendorf公司，型號(hào)：Eppendorf AG）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1? 改良的MRS培養(yǎng)基? 蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，三水乙酸鈉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4 0.2 g/L，吐溫80 0.5 g/L，CaCO3 20 g/L，瓊脂15 g/L。調(diào)節(jié)pH至6.2，分裝后121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3.2? PBS溶液配制[15]? 用于溶解MTT的PBS-1溶液：取NaCl 4.0 g、K2HPO4 0.575 g、KH2PO4 0.1 g，ddH2O定容至500 mL，超聲5 min使其溶解完全，調(diào)節(jié)pH為7.2，121 ℃滅菌15 min，室溫保存。用于稀釋菌液樣品的PBS-2溶液：取NaCl 4.25 g、KCl 0.1 g、Na2HPO4 1.425 g、KH2PO4 0.135 g，ddH2O定容至500 mL，超聲溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃滅菌15 min，室溫保存。

1.3.3? 乳酸菌的分離和形態(tài)觀察? 黃精發(fā)酵方法參照前期報(bào)道[18]，取不同發(fā)酵時(shí)期的發(fā)酵液采用10倍稀釋法，分別取0.1 mL稀釋液涂布于培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng) 2～3 d，觀察菌落形態(tài)。挑選具有明顯菌落形態(tài)、溶鈣圈較大的單菌落，在MRS平板上重復(fù)劃線分離菌株，以純化單菌落。對(duì)純化的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察[19]。

1.3.4? 菌種鑒定? 采用16S rRNA法對(duì)分離的單菌落進(jìn)行鑒定，利用DNA快速提取試劑盒提取DNA，選擇通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，將PCR產(chǎn)物送長(zhǎng)沙擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載同源性較高的序列，采用MEGA軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析[20]。

1.3.5? 微生物平板計(jì)數(shù)? 發(fā)酵體系中的益生菌活菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)參照平板計(jì)數(shù)法[15]進(jìn)行，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌總數(shù)。通過(guò)平板計(jì)數(shù)，確定不同樣品中的活菌總數(shù)。

1.3.6? MTT法檢測(cè)? MTT采用PBS-1溶液溶解配制，具體染色檢測(cè)操作參考文獻(xiàn)方法[15]。取稀釋好的菌液4.5 mL于10 mL離心管，并在10 000 r/min條件下離心10 min（離心半徑160 mm）后去其上清液，在超凈工作臺(tái)里加入4.5 mL PBS-2溶液、0.4 mL MTT染色劑后，混勻，37 ℃染色反應(yīng)后，10 000 r/min離心5 min（離心半徑160 mm），分離出離心沉淀甲臜后，加入4 mL DMSO，10 000 r/min離心5 min（離心半徑160 mm），在紫外可見分光光度計(jì)下測(cè)定其吸光值（optical density， OD）。

1.3.7? MTT法條件優(yōu)化? （1）最佳吸收波長(zhǎng)確定：采用MTT法得到的反應(yīng)液進(jìn)行400～700 nm掃描，取間隔范圍為5 nm，觀察最大吸收峰。（2）MTT染色時(shí)間確定：通過(guò)觀察MTT與菌液反應(yīng)顏色的變化，分別設(shè)定4個(gè)反應(yīng)時(shí)間，即0、30、60、120、240 min，在最大吸收波長(zhǎng)545 nm處測(cè)定吸光度。（3）MTT可測(cè)量范圍確定：將菌液按照10倍稀釋法稀釋至不同濃度，MTT染色反應(yīng)2 h后，在波長(zhǎng)545 nm處測(cè)定OD。（4）MTT法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將菌液稀釋至109 CFU/mL后再細(xì)化稀釋到不同濃度，MTT染色反應(yīng)2 h后，在波長(zhǎng)545 nm處測(cè)定OD，同時(shí)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算樣品中的活菌數(shù)，以活菌數(shù)為橫坐標(biāo)、OD為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1? 乳酸菌的分離鑒定

從鮮黃精發(fā)酵體系中，用MRS培養(yǎng)基分離純化微生物。其菌落表觀性狀基本一致，直徑約3～5 mm，凸起，呈圓形，表面光滑，細(xì)密，色白（圖1A），在MRS培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生溶鈣圈（圖1B）。進(jìn)一步在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該微生物為圓端直桿菌，長(zhǎng)度為1～4 μm，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀，缺乏鞭毛，但能運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色呈現(xiàn)藍(lán)紫色，可以判斷分離菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌（圖1C）。

2.2? 植物乳桿菌鑒定

通過(guò)16S rRNA序列擴(kuò)增，測(cè)序，序列長(zhǎng)度為1439 bp，基因測(cè)序結(jié)果已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并收錄，收錄信息為SUB5941108 Lactobacillus MN165453。在NCBI進(jìn)行Blast基因序列比對(duì)，與多條植物乳桿菌的序列匹配達(dá)到100%。進(jìn)一步下載相關(guān)植物乳桿菌菌株序列和其他菌序列，包括干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)合顯微觀察和形態(tài)學(xué)分析，從圖2可以進(jìn)一步確定分離獲得的微生物為植物乳桿菌，將該菌株命名為HACM-LP001。

2.3? MTT法檢測(cè)波長(zhǎng)和染色時(shí)間分析

分別在30、60、240 min，對(duì)加入MMT后的植物乳桿菌溶液進(jìn)行400～750 nm全波長(zhǎng)掃描，測(cè)量結(jié)果如圖3A所示。不同時(shí)間段，波長(zhǎng)掃描圖呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，從400 nm開始，吸光度逐漸上升，在500～580 nm呈現(xiàn)最大吸收曲線，最大吸收波長(zhǎng)為545 nm。從而，選取545 nm作為MTT與植物乳桿菌顯色反應(yīng)后的最大吸收波長(zhǎng)，設(shè)置0、30、60、120、240 min，開展不同反應(yīng)時(shí)間的顯色程度實(shí)驗(yàn)。從圖3B可見，不同反應(yīng)時(shí)間OD也不同，且隨著時(shí)間的推移OD逐漸增大，在120 min曲線開始趨于平穩(wěn)，表明反應(yīng)120 min后，活菌與MTT染色液已充分反應(yīng)。

2.4? MTT法靈敏度與活菌線性關(guān)系分析

將植物乳桿菌采用10倍稀釋法稀釋至不同濃度，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法確定樣品中活菌的菌落數(shù)，同時(shí)采用MTT法對(duì)含有不同活菌數(shù)的樣品染色反應(yīng)120 min，在545 nm處檢測(cè)該方法的靈敏性。由圖4A可知，當(dāng)樣品中平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)的活菌濃度在109 CFU/mL時(shí)，MTT法檢測(cè)顯示的OD最大，隨著稀釋倍數(shù)的增大，OD呈遞減狀態(tài)，當(dāng)平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)的活菌濃度在小于107 CFU/mL時(shí)，MTT法檢測(cè)顯示的OD趨于0。植物乳桿菌樣品中濃度在108 CFU/mL時(shí)，OD在0.2～0.8之間，是較為合適的測(cè)量范圍。進(jìn)一步將植物乳桿菌樣品中活菌濃度在108 CFU/mL區(qū)間段進(jìn)行細(xì)分，檢測(cè)MTT法顯色與平板計(jì)數(shù)法活菌總數(shù)的線性關(guān)系，結(jié)果如圖4B所示。在平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)的活菌濃度為7×107～3.1×108 CFU/mL范圍內(nèi)，OD（545 nm）和植物乳桿菌樣品活菌濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.992，從而可以通過(guò)MTT法快速檢測(cè)植物乳桿菌樣品活菌菌落總數(shù)。

3 討論

藥食同源藥材發(fā)酵技術(shù)的研究是中藥領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。從藥食同源發(fā)酵體系中分離鑒定益生菌，并對(duì)發(fā)酵體系中益生菌活菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)至關(guān)重要。但傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不能及時(shí)反應(yīng)菌體生長(zhǎng)情況[16]。因此，有必要在發(fā)酵體系中建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)方法。

雖然已有一些黃精發(fā)酵的研究，但從黃精發(fā)酵體系中分離鑒定益生菌鮮有報(bào)道。本研究從黃精發(fā)酵體系中分離獲得了一株乳桿菌，通過(guò)革蘭氏染色、基因序列測(cè)定及同源性分析，確定為植物乳桿菌（HACM-LP001）。植物乳桿菌是一種益生菌，具有多種保健作用，如調(diào)節(jié)免疫、維持腸道內(nèi)菌群平衡、抑制致病菌，降低血清膽固醇含量和預(yù)防心血管疾病等[21]?；贛TT法發(fā)現(xiàn)，HACM-LP001植物乳桿菌在545 nm處有最大吸收峰，染色2 h，菌體濃度在108 CFU/mL左右時(shí)，具有良好的線性關(guān)系，表明該方法可以用于植物乳桿菌活菌數(shù)量的快速檢測(cè)。

MTT法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)，近年來(lái)逐漸用于生物細(xì)胞的活性檢測(cè)。其原理是水溶性的MTT染色劑可以與活細(xì)胞中的脫氫酶反應(yīng)，還原成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中。由于死細(xì)胞不具備這一反應(yīng)，因此用DMSO溶解所生成的甲瓚，通過(guò)檢測(cè)光密度值變化，可間接反映細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖活性[14]。MTT法在益生菌快速檢測(cè)中已開展相關(guān)研究，楊培潔等[14]采用MTT法開展了瑞士乳桿菌的檢測(cè)條件優(yōu)化。李娜等[16]研究了保加利亞乳桿菌、濕熱乳酸鏈球菌的MTT法快速檢測(cè)。黃利坤等[15]基于MTT法對(duì)保加利亞乳桿菌和濕熱鏈球菌進(jìn)行了測(cè)定。MTT法能夠快速測(cè)定益生菌活菌數(shù)目，然而已有研究發(fā)現(xiàn)，其精確度與細(xì)菌種類、生長(zhǎng)狀態(tài)及其代謝產(chǎn)物有關(guān)[16]。不同益生菌的MTT法略存在差異，例如：瑞士乳桿菌的最佳波長(zhǎng)是510 nm[14]，染色1 h即可檢測(cè)[15];保加利亞乳桿菌和濕熱鏈球菌的最大吸收波長(zhǎng)是570 nm，其染色時(shí)間分別為1.5 h和2 h[15];而本研究通過(guò)全波長(zhǎng)掃描植物乳桿菌MTT染色后樣品，發(fā)現(xiàn)在500～580 nm之間都呈現(xiàn)較大吸收特征，在545 nm處有最大吸收峰，染色時(shí)間為2 h。隨著染色時(shí)間延長(zhǎng)，MTT反應(yīng)更加充分，植物乳桿菌在染色2 h后效果穩(wěn)定。考慮到方法的靈敏度，待測(cè)菌液的濃度需要調(diào)整到適宜的范圍，從而減小系統(tǒng)誤差。

綜上所述，本研究是首次從黃精發(fā)酵體系中分離純化發(fā)酵乳酸菌，經(jīng)顯微和分子鑒定為植物乳桿菌，基于MTT染色建立了植物乳桿菌的快速檢測(cè)方法，為益生菌活菌快速檢測(cè)提供了參考。

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