• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    香蕉鉀轉運體HAK/KUP/KT家族鑒定及其在果實發(fā)育和低鉀脅迫下的表達分析

    2022-02-15 13:38:03金龍飛張安妮滕夢鑫李新國
    江蘇農業(yè)科學 2022年2期
    關鍵詞:基因表達香蕉

    金龍飛 張安妮 滕夢鑫 李新國

    摘要:鉀是香蕉生長發(fā)育中需求量最大的營養(yǎng)元素,對果實產量、品質和貯藏性都有重要的影響。從香蕉基因組中鑒定出24個HAK/KUP/KT(MaKUP)基因,并對其理化性質、染色體定位、基因結構、保守功能域、進化關系、組織表達和低鉀脅迫下的表達特征進行分析。結果表明,MaKUP編碼的肽鏈平均有772個氨基酸,分子量為63.54~93.82 ku,等電點為5.44~9.30,蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為32.69~44.29,脂肪族指數(shù)為105.34~116.90,總平均親水性為 0.352~0.549,含有8~11個外顯子,可分為4個亞族;表達分析發(fā)現(xiàn)15個MaKUP基因家族成員在香蕉不同發(fā)育時期的果實中高表達,6個MaKUP基因家族成員在低鉀脅迫中上調表達,表明MaKUP在香蕉果實發(fā)育和鉀吸收中具有重要的作用。

    關鍵詞:香蕉;鉀;HAK/KUP/KT;基因表達;低鉀脅迫

    中圖分類號:S668.101 ??文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2022)02-0030-07

    收稿日期:2021-04-15

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31760549);海南省自然科學基金(編號:320RC485);海南省熱帶園藝作物品質調控重點實驗室科研項目[編號:HNZDSYS(YY)-01]。

    作者簡介:金龍飛(1988—),男,湖北荊門人,博士,助理研究員,主要從事熱帶作物栽培研究。E-mail:jlf_0511@163.com。

    通信作者:李新國,博士,教授,主要從事果樹種質資源與遺傳改良研究。E-mail:lixinguo13@163.com。

    鉀是植物細胞中最多的陽離子,含量占植物干質量的2%~10%。鉀參與植物跨膜轉運、維持細胞電荷平衡、酶的活化、光合作用、滲透調節(jié)和氣孔運動等眾多的生命活動過程[1]。缺鉀會嚴重影響作物的產量和品種。植物中的鉀離子轉運蛋白主要包含Shaker通道、KCO/TPK通道、HAK/KUP/KT(后簡寫為KUP)轉運體、Trk/HKT轉運體和K+/H+逆向轉運體,其中KUP轉運體是鉀轉運系統(tǒng)中最早發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多、功能最豐富的鉀轉運體[2]。KUP轉運體最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[3],因其具有鉀吸收功能,被命名為鉀吸收透性酶(K+uptake permease,簡稱KUP),該轉運體可使酵母在外界K+濃度極低的條件下仍能保持較高的細胞內K+濃度,因此也被命名為高親和性K+轉運體(high-affinity K+transporter,簡稱HAK)[4],在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)其具有鉀轉運功能,也被命名為K+轉運體(K+transporter,簡稱KT)[5]。隨著大量植物基因組序列的公布,KUP基因家族也在水稻[6]、小麥[7]、大豆[8]、棉花[9]、甘蔗[10]、大白菜[11]、茶樹[12]等作物中被鑒定出來。高鉀親和力的KUP的表達通常受低鉀脅迫的誘導,在玉米中過表達高親和性鉀轉運體基因ZmHAK5可以提高玉米在低鉀條件下對鉀的吸收能力,促進根系的生長[13]。

    香蕉是典型的喜鉀作物,植株的鉀含量高達7.16%,果實中鉀含量高達13.7 mg/g[14-15]。氮鉀肥(N ∶K2O)施用比例為1 ∶1.12~1 ∶1.20時,果實農藝性狀最佳、品質最優(yōu)、產量最高,較對照處理增產高達16.1%[16]。然而對于香蕉鉀吸收、轉運和利用相關的分子機制還少見報道。隨著香蕉AB基因組測序的完成,基于全基因組信息挖掘和鑒定香蕉鉀轉運蛋白并分析其與鉀素吸收的特性,能夠從基礎研究的層面解析香蕉鉀素吸收的分子機制,為香蕉通過遺傳改良提高養(yǎng)分利用效率奠定理論基礎。本研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù),利用生物信息學方法鑒定MaKUP基因家族成員,并從基因及蛋白結構、基因在各組織中的表達模式及基因在低鉀脅迫下寶島蕉的表達模式等3個方面進行分析,以期初步解析香蕉中MaKUP基因在果實發(fā)育和低鉀響應中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試品種為寶島蕉(Musa AAA Cavendish,cv. Baodaojiao),來自中國熱帶農業(yè)科學院組培中心,苗高約20 cm,長勢一致,5葉1心,心葉未展開,無病蟲害。將袋裝寶島蕉幼苗取出,洗凈根系轉入清水中進行適應性培養(yǎng),待新根長出后,依次換1/4、1/2和全營養(yǎng)阿夫多寧營養(yǎng)液,每5 d更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為光照強度75 μmol/(m2·s),光照時間14 h/d,晝夜溫度27 ℃,相對濕度85%~90%,每 3 h 通氣15 min。試驗時間為2020年10月至2021年2月。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 水培和低鉀處理 采用水培對供試材料進行低鉀脅迫處理,低鉀脅迫處理的鉀濃度為4 mg/L,以全營養(yǎng)液作為對照(鉀濃度為40 mg/L),3株1個處理,每個處理重復3次。低鉀處理后1、3、6、12、24 h采集2 cm的根尖,液氮速凍后,保存在 -80 ℃ 冰箱中。

    1.2.2 MaKUP基因家族的生物信息學分析 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中下載基因的編碼序列(CDS)、基因序列、蛋白序列、啟動子序列以及在香蕉各組織中的表達數(shù)據(jù)(RPKM值)。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白序列的氨基酸數(shù)量、等電點、分子量;利用CD-Search Tool(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)分析結構域,利用MEME(http://alternate.meme-suite.org/tools/meme)分析保守基序,使用TBtools軟件繪制熱圖[17];利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析基因結構;利用MEGA 6.0軟件繪制進化樹。

    1.2.3 香蕉根尖總RNA的提取、cDNA的合成和熒光定量PCR 采用植物總RNA提取試劑盒(DP432)[天根生化科技(北京)有限公司]提取香蕉根尖總RNA,具體方法參照說明書。為防止RNA降解,所用試驗耗材(槍頭、離心管)均為RNase-free,研缽與研磨棒用錫箔紙包裹后180 ℃干熱滅菌4 h,冷卻待用。利用瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度法檢測RNA的濃度、純度與完整度,保證RNA條帶28S與18S的亮度在2 ∶1,5S條帶亮度弱,D260 nm/D280 nm在1.9~2.1之間。采用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)合成cDNA,具體方法參照說明書。采用PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix(Thermo Scientific公司)進行基因表達分析,具體方法參照試劑盒說明書,在Applied Biosystems 7500上進行熒光定量PCR反應,所用引物序列見表1。每個樣品設置3個生物學重復及3個機械重復,以actin為內參基因,以未進行低鉀脅迫的樣品作為參照,根據(jù)2-ΔΔCT法進行相對表達量的計算。

    1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析,采用Duncan’s檢測法進行差異顯著性分析。

    2 結果與分析

    2.1 MaKUP基因家族成員的理化性質

    通過Blastp將擬南芥和水稻的KUP基因家族的氨基酸序列與香蕉A基因組數(shù)據(jù)進行比對,得到的候選基因進行保守結構域分析,共獲得24個MaKUP基因家族成員,根據(jù)其在染色體上排列順序,依次命名為MaKUP1~MaKUP24。香蕉MaKUP多肽鏈氨基酸數(shù)量為565~839個,平均值為772個;分子量為63.54~93.82 ku,平均值為86.09 ku;等電點為5.44~9.30,平均值為7.89;外顯子數(shù)量為8~11個,都具有鉀轉運體結構域,蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為32.69~44.29,平均值為39.24,10個為穩(wěn)定蛋白,14個為不穩(wěn)定蛋白(蛋白不穩(wěn)定指數(shù)>40);脂肪族指數(shù)為105.34~116.90,平均值為109.74;總平均親水性為0.352~0.549,平均值為0.403,都為正值,表明MaKUP蛋白均表現(xiàn)為疏水性(表2)。

    2.2 MaKUP基因家族成員在染色體上的定位

    對MaKUP基因家族成員在染色體上的位置進行分析,發(fā)現(xiàn)24個MaKUP基因家族成員分布在10條染色體上。MaKUP1在chr01上,MaKUP2在chr02上,MaKUP3和MaKUP4在chr03上,MaKUP5在chr04上,MaKUP6、MaKUP7和MaKUP8在chr05上,MaKUP9~MaKUP12在chr07上,MaKUP13~MaKUP17在chr08上,MaKUP18和MaKUP19在chr09上,MaKUP20和MaKUP21在chr10上,MaKUP22~MaKUP24在chr11上。MaKUP4和MaKUP14,MaKUP6和MaKUP22,MaKUP15和MaKUP23,MaKUP16和MaKUP18存在基因共線性現(xiàn)象(圖1)。

    2.3 MaKUP基因家族成員的進化關系和保守基序

    進化分析將MaKUP基因家族成員分為4個大類,MaKUP1、 MaKUP3、 MaKUP10、MaKUP12、MaKUP13、MaKUP18、和MaKUP24聚為一類,MaKUP4、MaKUP7、MaKUP8、MaKUP14、MaKUP15、MaKUP20和MaKUP23聚為一類,MaKUP2、MaKUP5、MaKUP6、MaKUP11、MaKUP16、MaKUP17、MaKUP19、MaKUP21和MaKUP22聚為一類,MaKUP9單獨為一類(圖2)。利用MEME在線工具對香蕉MaKUP蛋白的保守基序進行分析,得到10個保守基序,除了MaKUP2以外,都含有10個保守基序(圖2)。

    2.4 MaKUP基因家族成員在不同組織和果實發(fā)育不同時期的表達特征

    MaKUP基因家族成員在香蕉不同組織和果實不同發(fā)育時期表達量差異較大,其中MaKUP3、MaKUP6和MaKUP7在葉中的表達量較高,MaKUP8、MaKUP15和MaKUP23在根中的表達量較高,MaKUP2、MaKUP4、MaKUP10、MaKUP13、MaKUP14、MaKUP24在花后0 d表達量較高,MaKUP2、MaKUP9、MaKUP13、MaKUP14、MaKUP16、MaKUP17、MaKUP18、MaKUP21在花后20 d表達量較高,MaKUP1和MaKUP19在采后8 d的果中表達量較高,MaKUP5、MaKUP11、MaKUP12、MaKUP20和MaKUP22在采后14 d的果中表達量較高(圖3)。

    2.5 MaKUP基因家族成員在低鉀脅迫下的表達特征

    采用熒光定量PCR對低鉀脅迫處理0、1、3、6、12、24 h后24個MaKUP基因家族成員在香蕉根尖中的表達特征進行分析,發(fā)現(xiàn)6個MaKUP基因家族成員受到低鉀脅迫的誘導,其表達量逐漸升高,達到峰值后逐漸降低。其中MaKUP1、MaKUP3、MaKUP14、MaKUP20和MaKUP22在低鉀脅迫處理3 h后相對表達量達到峰值,分別是對照的10、12、5、16、4倍;MaKUP21的相對表達量在低鉀脅迫處理12 h后達到峰值,是對照的5倍,在低鉀脅迫處理24 h又迅速降低(圖4)。

    3 討論與結論

    香蕉是重要的熱帶果樹,其產量和品質與鉀元素含量密切相關,KUP是編碼植物鉀吸收的重要轉運體基因,已在水稻[6]、小麥[7]、棉花[9]等多個作物中被鑒定出來,而在香蕉中尚未見報道。本研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù)篩選得到24個MaKUP基因家族成員,經過基因結構、保守結構域和保守基序分析,發(fā)現(xiàn)都含有典型的鉀轉運結構域,鑒定都是鉀轉運體。染色體定位發(fā)現(xiàn)24個MaKUP基因家族成員均

    勻分布在10個染色體上,其中8個基因存在基因共線性,這可能是由于基因復制產生的?;驈椭剖录軌驅е轮参锘蚪M中形成大量的重復基因,而重復基因的存在能夠促進基因新功能的進化,增強植物對環(huán)境變化的適應性[18],8個共線性的基因可能是香蕉適應高鉀需求的一種進化機制。進化樹和保守基序分析發(fā)現(xiàn)MaKUP基因家族成員可分為4個亞類,除了MaKUP2以外,都含有10個保守基序,這表明MaKUP在進化中功能比較保守。

    植物的KUP基因廣泛分布在各個組織和器官中,在鉀吸收和轉運中起著重要的作用。在水稻中5個KUP基因(OsHAK2、OsHAK10、OsHAK15、OsHAK23和OsHAK25)在3個品種的所有組織中都有表達[19],在茶樹中CsHAK3在8個組織中持續(xù)高表達[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)MaKUP基因家族成員在香蕉的根、葉、不同發(fā)育時期和不同采后時期的果實中都有表達,不同成員在不同組織中表達差異較大,其中8個MaKUP基因家族成員在香蕉果實發(fā)育前期高表達,7個MaKUP基因家族成員在采后的香蕉果實中高表達,這表明MaKUP基因在果實發(fā)育成熟過程中和鉀元素的轉運中起重要作用,這可能也是香蕉果實鉀含量高的主要原因。

    在低鉀脅迫下植物一方面通過增加根系面積提高與土壤的接觸面積,另一方面通過激活高親和鉀吸收系統(tǒng),增加對鉀的獲取能力[20]。KUP/HAK/KT轉運體家族成員按照對鉀的親和性可分為高親和性鉀轉運體、低親和性鉀轉運體和雙親和性鉀轉運體3類,在植物鉀吸收和長距離運輸中起著重要的作用[2]。AtHAK5是典型的高親和性鉀轉運子,主要定位在擬南芥根部的上皮細胞和中柱中,其表達受到低鉀脅迫的誘導,對根系鉀吸收起著重要的作用[21]。在茶樹中的研究發(fā)現(xiàn)鑒定的21個KUP基因家族成員,其中CsHAK5、CsHAK7、CsHAK8、CsHAK11、CsHAK12、CsHAK18、CsHAK19、CsHAK20和CsHAK21的表達受到低鉀脅迫的誘導[12]。在本研究中6個MaKUP基因(MaKUP1、MaKUP3、MaKUP14、MaKUP20、MaKUP21和MaKUP22)受到低鉀脅迫的誘導,表明這6個MaKUP基因可能是高親和鉀轉運體,在低鉀脅迫下可以通過上調MaKUP基因的表達,提高香蕉對鉀的吸收能力。KUP不僅在植物根吸收鉀中起著重要的作用,還參與葉片對鉀吸收的轉運,在桃葉面噴施鉀肥后PPeKUP1、PPeKUP2和PPeKUP7的表達量顯著上調[22],在本研究中MaKUP3和MaKUP6在葉片中的表達量明顯高于其他組織,表明這2個基因可能參與香蕉葉片對鉀的吸收。

    本研究采用生物信息學方法從香蕉基因組中鑒定出24個MaKUP基因家族成員,表達分析發(fā)現(xiàn)MaKUP基因家族成員在香蕉的根、葉和果中均有表達,其中15個MaKUP基因家族成員在果實發(fā)育中高表達,6個MaKUP基因家族成員受到低鉀脅迫的誘導,表明MaKUP基因在香蕉果實發(fā)育和鉀吸收中具有重要的作用。

    參考文獻:

    [1]Wang M,Zheng Q S,Shen Q R,et al. The critical role of potassium in plant stress response[J]. International Journal of Molecular Sciences,2013,14(4):7370-7390.

    [2]Li W H,Xu G H,Alli A,et al. Plant HAK/KUP/KT K+transporters:Function and regulation[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology,2018,74:133-141.

    [3]Epstein W,Kim B S. Potassium transport loci in Escherichia coli K-12[J]. Journal of Bacteriology,1971,108(2):639-644.

    [4]Bauelos M A,Klein R D,Bowman S J A,et al. A potassium transporter of the yeast Schwanniomyces occidentalis homologous to the Kup system of Escherichia coli has a high concentrative capacity[J]. The EMBO Journal,1995,14(13):3021-3027.

    [5]Quintero F J,Blatt M R. A new family of K+transporters from Arabidopsis that are conserved across phyla[J]. FEBS Letters,1997,415(2):206-211.

    [6]Amrutha R N,Sekhar P N,Varshney R K,et al. Genome-wide analysis and identification of genes related to potassium transporter families in rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Science,2007,172(4):708-721.

    [7]Cheng X Y ,Liu X D,Mao W W,et al. Genome-wide identification and analysis of HAK/KUP/KT potassium transporters gene in wheat (Triticum aestivum L.)[J]. International Journal of Molecular Sciences,2018,19(12):3969.

    [8]晁毛妮,溫青玉,張晉玉,等. 大豆KUP/HAK/KT鉀轉運體基因家族的鑒定與表達分析[J]. 西北植物學報,2017,37(2):239-249.

    [9]Fan K,Mao Z J,Zheng J X,et al. Molecular evolution and expansion of the KUP family in the allopolyploid cotton species Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Frontiers in Plant Science,2020,11:545042.

    [10]Feng X M,Wang Y J,Zhang N N,et al. Genome-wide systematic characterization of the HAK/KUP/KT gene family and its expression profile during plant growth and in response to low-K+stress in Saccharum[J]. BMC Plant Biology,2020,20(1):20.

    [11]Shen C W,Yuan J P. Genome-wide investigation and expression analysis of K+-transport-related gene families in chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis)[J]. Biochemical Genetics,2020,59(4):1-27.

    [12]Yang T Y,Lu X,Wang Y,et al. HAK/KUP/KT family potassium transporter genes are involved in potassium deficiency and stress responses in tea plants (Camellia sinensis L.):expression and functional analysis[J]. BMC Genomics,2020,21(1):556.

    [13]Qin Y J,Wu W H,Wang Y. ZmHAK5 and ZmHAK1 function in K+uptake and distribution in maize under low K+conditions.[J]. Journal of Integrative Plant Biology,2019,61(6):691-705.

    [14]饒寶蓉. 香蕉不同基因型間鉀素營養(yǎng)效率差異性研究[D]. 海口:海南大學,2010:20-22.

    [15]陳海強,楊公明,梅為云,等. 不同品種香蕉果實成熟期主要營養(yǎng)與功能成分含量變化[J]. 廣東農業(yè)科學,2014,41(22):24-28.

    [16]楊苞梅,黃漢森,黃 強,等. 鉀氮營養(yǎng)對香蕉抽蕾和產量的影響[J]. 中國土壤與肥料,2011(6):39-42.

    [17]Chen C J,Chen H,Zhang Y,et al. TBtools:an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant,2020,13(8):1194-1202.

    [18]Panchy N,Lehti-Shiu M,Shiu S. Evolution of gene duplication in plants[J]. Plant Physiology,2016,171(4):2294-2316.

    [19]Gupta M,Qiu X H,Wang L,et al. KT/HAK/KUP potassium transporters gene family and their whole-life cycle expression profile in rice (Oryza sativa)[J]. Molecular Genetics and Genomics,2008,280(5):437-452.

    [20]陳 光,高振宇,徐國華. 植物響應缺鉀脅迫的機制及提高鉀利用效率的策略[J]. 植物學報,2017,52(1):89-101.

    [21]Gierth M,Mser P,Schroeder J I. The potassium transporter AtHAK5 functions in K+deprivation-induced high-affinity K+uptake and AKT1 K+channel contribution to K+uptake kinetics in Arabidopsis roots[J]. Plant Physiology,2005,137(3):1105-1114.

    [22]宋志忠,許建蘭,張斌斌,等. 葉面噴施鉀肥對霞脆桃果實品質及KUP基因表達的影響[J]. 江蘇農業(yè)學報,2018,34(5):1107-1112.

    猜你喜歡
    基因表達香蕉
    香蕉是果實,為什么沒有籽
    好吃的香蕉
    快樂語文(2020年30期)2021-01-14 01:05:38
    快手香蕉餅
    摘香蕉
    娃娃畫報(2018年4期)2018-08-15 12:38:26
    瓶里有香蕉
    香蕉
    低溫處理對斑馬魚CNSS系統(tǒng)應激相關基因的影響
    抗菌肽對細菌作用機制的研究
    基因芯片在胃癌及腫瘤球細胞差異表達基因篩選中的應用
    美洲大蠊提取液對大鼠難愈合創(chuàng)面VEGF表達影響的研究
    国产精品人妻久久久久久| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲天堂国产精品一区在线| 内地一区二区视频在线| 看十八女毛片水多多多| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 极品教师在线免费播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久九九精品影院| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人鲁丝片一二三区免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 一区二区三区高清视频在线| 免费高清视频大片| 国产美女午夜福利| 99久久精品一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品久久久久久av不卡| 精品久久久久久久久久久久久| 黄色配什么色好看| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲av成人av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产淫片久久久久久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 少妇丰满av| 一区二区三区四区激情视频 | 最近在线观看免费完整版| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99久久九九国产精品国产免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99九九线精品视频在线观看视频| 91精品国产九色| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 在线观看一区二区三区| 一区二区三区免费毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 在线天堂最新版资源| 一进一出好大好爽视频| 日本欧美国产在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人特级av手机在线观看| 国产美女午夜福利| 内射极品少妇av片p| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美成人性av电影在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一a级毛片在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国语自产精品视频在线第100页| 18禁黄网站禁片免费观看直播| or卡值多少钱| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99热这里只有是精品50| 韩国av一区二区三区四区| 成年版毛片免费区| 日韩精品青青久久久久久| 国产不卡一卡二| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲七黄色美女视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产高潮美女av| 精品久久国产蜜桃| 国产单亲对白刺激| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成人国产综合亚洲| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 最近最新免费中文字幕在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色哟哟哟哟哟哟| 97超视频在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 欧美性感艳星| 最近在线观看免费完整版| 在线免费十八禁| 色av中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲真实伦在线观看| 99热只有精品国产| 久久6这里有精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 观看免费一级毛片| 免费看光身美女| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久久久久久久大av| 乱人视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产熟女欧美一区二区| 午夜福利欧美成人| 深爱激情五月婷婷| 久久久久久久久久久丰满 | a级毛片免费高清观看在线播放| 久久久久性生活片| 内射极品少妇av片p| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧美清纯卡通| a级一级毛片免费在线观看| 午夜免费成人在线视频| 一区二区三区免费毛片| 中文字幕av在线有码专区| 男人舔奶头视频| 变态另类丝袜制服| 日本一二三区视频观看| x7x7x7水蜜桃| 日本一本二区三区精品| 99久久九九国产精品国产免费| av天堂在线播放| 天堂√8在线中文| 国模一区二区三区四区视频| 一级av片app| 午夜日韩欧美国产| 成人特级黄色片久久久久久久| av中文乱码字幕在线| 88av欧美| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 嫩草影院入口| 99热精品在线国产| 无遮挡黄片免费观看| 久久亚洲真实| a级一级毛片免费在线观看| 国产久久久一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 少妇的逼好多水| 99热这里只有是精品在线观看| 黄色一级大片看看| 亚洲精品色激情综合| 国内精品宾馆在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产成年人精品一区二区| 一进一出抽搐动态| 伦理电影大哥的女人| 97超视频在线观看视频| 性欧美人与动物交配| 波野结衣二区三区在线| 久久久久久大精品| 亚洲图色成人| 97碰自拍视频| 亚洲国产精品成人综合色| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精华国产精华精| 99热精品在线国产| 黄片wwwwww| 日韩高清综合在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美bdsm另类| 男人和女人高潮做爰伦理| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久这里只有精品中国| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品98久久久久久宅男小说| 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩中字成人| 春色校园在线视频观看| 在线国产一区二区在线| 国产精品一及| 又爽又黄无遮挡网站| 熟女电影av网| 天美传媒精品一区二区| 99热精品在线国产| 草草在线视频免费看| 国产精品一区www在线观看 | 嫁个100分男人电影在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 麻豆成人午夜福利视频| 免费无遮挡裸体视频| 波多野结衣高清作品| 99热这里只有是精品在线观看| av天堂中文字幕网| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲图色成人| 午夜福利在线在线| 在现免费观看毛片| 国产乱人伦免费视频| 国产精品三级大全| 精品久久久久久久久久久久久| 嫩草影视91久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲自拍偷在线| 免费观看的影片在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 精品一区二区免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜福利在线观看吧| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久午夜亚洲精品久久| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| avwww免费| 国产麻豆成人av免费视频| 少妇高潮的动态图| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产大屁股一区二区在线视频| 嫩草影视91久久| 中国美女看黄片| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 99久国产av精品| 欧美日韩黄片免| 天美传媒精品一区二区| 色综合婷婷激情| 他把我摸到了高潮在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 日本-黄色视频高清免费观看| 我要搜黄色片| 麻豆一二三区av精品| 丰满的人妻完整版| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜福利高清视频| 俺也久久电影网| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产黄a三级三级三级人| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久热精品热| 国产亚洲精品久久久com| 不卡视频在线观看欧美| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲不卡免费看| 午夜免费成人在线视频| 国产美女午夜福利| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品三级大全| 成人美女网站在线观看视频| 午夜福利欧美成人| 久久精品国产亚洲网站| 在线观看av片永久免费下载| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 床上黄色一级片| 欧美高清性xxxxhd video| av天堂在线播放| 一本一本综合久久| 国产老妇女一区| 午夜亚洲福利在线播放| 联通29元200g的流量卡| 亚洲美女视频黄频| 成人亚洲精品av一区二区| 此物有八面人人有两片| 99精品久久久久人妻精品| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美激情久久久久久爽电影| 深爱激情五月婷婷| 亚洲午夜理论影院| 十八禁网站免费在线| 国产视频内射| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品福利在线免费观看| 能在线免费观看的黄片| 我的老师免费观看完整版| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美日本视频| 欧美性猛交黑人性爽| 99热这里只有是精品50| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲avbb在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 很黄的视频免费| 三级国产精品欧美在线观看| 在线观看午夜福利视频| 网址你懂的国产日韩在线| 免费观看人在逋| 成人精品一区二区免费| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产高清三级在线| 精品乱码久久久久久99久播| 99久久成人亚洲精品观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 在线观看一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 亚洲图色成人| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品午夜福利在线看| av黄色大香蕉| 久久久久久伊人网av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 999久久久精品免费观看国产| 性插视频无遮挡在线免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 99热精品在线国产| 床上黄色一级片| 国产高清三级在线| 亚洲精品色激情综合| 99久久成人亚洲精品观看| 最新中文字幕久久久久| 内地一区二区视频在线| 热99在线观看视频| 欧美高清性xxxxhd video| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国内精品宾馆在线| 在线天堂最新版资源| 国产精品久久视频播放| 欧美日韩综合久久久久久 | 尾随美女入室| 国产精品精品国产色婷婷| 国产在线男女| 欧美性猛交黑人性爽| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成人福利小说| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久久久午夜电影| 真人做人爱边吃奶动态| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 哪里可以看免费的av片| 99久久精品一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 99热精品在线国产| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品一区二区免费欧美| 十八禁网站免费在线| 日本一本二区三区精品| 国产亚洲91精品色在线| 日日夜夜操网爽| 天堂√8在线中文| 黄色欧美视频在线观看| 变态另类丝袜制服| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲最大成人av| 午夜视频国产福利| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 免费观看人在逋| 亚洲,欧美,日韩| 超碰av人人做人人爽久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 欧美不卡视频在线免费观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 欧美成人一区二区免费高清观看| 一个人看的www免费观看视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 婷婷亚洲欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产高清在线一区二区三| 嫁个100分男人电影在线观看| 熟女电影av网| 欧美色视频一区免费| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜精品在线福利| 国产精品综合久久久久久久免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产乱人视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 久久99热6这里只有精品| 精品人妻1区二区| 国产亚洲欧美98| 国产三级在线视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 老女人水多毛片| 日韩欧美三级三区| av专区在线播放| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| a级一级毛片免费在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av熟女| 内射极品少妇av片p| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 小说图片视频综合网站| 久久九九热精品免费| 两个人的视频大全免费| 在线看三级毛片| 无遮挡黄片免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 欧美潮喷喷水| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美+日韩+精品| 亚洲av熟女| 欧美最新免费一区二区三区| 性色avwww在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 国产三级中文精品| 99久国产av精品| 热99在线观看视频| 国产成人a区在线观看| 亚洲av成人av| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本-黄色视频高清免费观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲无线观看免费| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国内精品一区二区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 一区二区三区高清视频在线| 最新在线观看一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 九色国产91popny在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费观看的影片在线观看| 两个人的视频大全免费| 久久99热6这里只有精品| 午夜福利欧美成人| 国产精品一区二区免费欧美| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 男插女下体视频免费在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 1000部很黄的大片| 男人和女人高潮做爰伦理| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品人妻久久久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 久久人妻av系列| 99久久精品热视频| 老司机福利观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99热6这里只有精品| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲av免费高清在线观看| 久久香蕉精品热| 久久午夜福利片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕高清在线视频| 色哟哟·www| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| www日本黄色视频网| 久久久国产成人精品二区| 亚洲自拍偷在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产av在哪里看| 免费在线观看成人毛片| 在线观看av片永久免费下载| 麻豆成人午夜福利视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久国内精品自在自线图片| 在线天堂最新版资源| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲最大成人中文| 日韩欧美免费精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品国产成人久久av| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品午夜福利在线看| 日本一本二区三区精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中文字幕免费在线视频6| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜福利在线观看吧| 国产精品98久久久久久宅男小说| 嫩草影院入口| 在线观看66精品国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品国产高清国产av| 国内精品宾馆在线| 日韩欧美精品v在线| 中文在线观看免费www的网站| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美+日韩+精品| 俺也久久电影网| 午夜福利在线在线| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 婷婷亚洲欧美| 简卡轻食公司| www日本黄色视频网| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩欧美免费精品| av.在线天堂| 久久久久性生活片| 香蕉av资源在线| 国产精品人妻久久久久久| 日本 欧美在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 欧美+日韩+精品| 午夜福利视频1000在线观看| 日本五十路高清| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费高清视频大片| 亚洲国产精品合色在线| 麻豆成人午夜福利视频| 一a级毛片在线观看| 免费人成在线观看视频色| 一个人免费在线观看电影| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 性欧美人与动物交配| 亚洲精品色激情综合| 特级一级黄色大片| 国产精华一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产色爽女视频免费观看| 欧美一区二区亚洲| 永久网站在线| 国产单亲对白刺激| 欧美精品国产亚洲| 日韩精品中文字幕看吧| 乱系列少妇在线播放| 日本 av在线| 日韩一区二区视频免费看| 久久亚洲真实| 日日啪夜夜撸| 真实男女啪啪啪动态图| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产极品精品免费视频能看的| 久久草成人影院| 国产av不卡久久| 国产毛片a区久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 婷婷六月久久综合丁香| netflix在线观看网站| 久久久久九九精品影院| 精品人妻视频免费看| 亚洲三级黄色毛片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 级片在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 成年女人看的毛片在线观看| 极品教师在线视频| 亚洲熟妇熟女久久| 白带黄色成豆腐渣| 国产成人av教育| 色综合亚洲欧美另类图片| 尾随美女入室| 日韩亚洲欧美综合| 日本 av在线| 国产精品不卡视频一区二区| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲精品成人久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 在线观看美女被高潮喷水网站| av在线蜜桃| 亚洲国产精品久久男人天堂| av在线天堂中文字幕| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久国产成人精品二区| 九色成人免费人妻av| av天堂中文字幕网| 又爽又黄无遮挡网站| 有码 亚洲区| 国产老妇女一区| 免费看日本二区| 久久久久久国产a免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久国产成人精品二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲色图av天堂| 桃色一区二区三区在线观看| 久久精品影院6| av福利片在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品三级大全| 久久香蕉精品热| 婷婷丁香在线五月| 淫秽高清视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 校园春色视频在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 日本黄大片高清| 直男gayav资源| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲 国产 在线| 亚洲人成网站高清观看|