天蟾膠囊外周和中樞鎮(zhèn)痛效應差異實驗研究

傅 斌，范 姝，萬 軍

天蟾膠囊外周和中樞鎮(zhèn)痛效應差異實驗研究

傅 斌，范 姝，萬 軍

江西中醫(yī)藥高等?？茖W校，江西 撫州 344000

探究天蟾膠囊的外周和中樞系統(tǒng)鎮(zhèn)痛效應差異。首先采用甩尾方法將基礎痛閾差距較小的64只C57BL/6雄性小鼠隨機分為對照組、天蟾組、天蟾納洛酮腹腔組、天蟾納洛酮脊髓組、天蟾納洛酮腦室組、天蟾β-氟硝胺（β-fluorine nitramine，β-FNA）組、天蟾納曲多爾組和天蟾諾比萘哌嗪組，除對照組外，其余各組分別ig 42.60 g/kg天蟾膠囊，連續(xù)給藥1周，給藥結束后，各組分別以不同給藥途徑給予各阻斷劑，30、60、90、120、150和180 min后觀察小鼠的痛閾變化。給予天蟾膠囊后，小鼠疼痛閾值升高，鎮(zhèn)痛起效時間為給藥后30 min（＜0.001），作用峰值為給藥后120 min（＜0.05）。天蟾納洛酮腹腔組給藥后30、60 min，小鼠痛閾值明顯高于天蟾膠囊脊髓和腦室給藥組（＜0.05），ip μ阿片受體拮抗劑的小鼠給藥30、60 min痛閾值顯著高于注射δ、κ阿片受體拮抗劑（＜0.05）。天蟾膠囊具有較好的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛效應對外周的阿片系統(tǒng)依賴程度高于中樞阿片系統(tǒng)，其作用的受體主要是外周μ阿片受體。

天蟾膠囊；鎮(zhèn)痛；μ阿片受體拮抗劑；中樞神經系統(tǒng)；外周神經系統(tǒng)

國際疼痛學會（International Association for the Study of Pain，IASP）將疼痛定義為是一種與實際或潛在的組織損傷相關的不愉快的感覺和情緒體驗，或其他相類似的經歷[1-2]。疼痛是臨床上最常見的癥狀之一，被世界衛(wèi)生組織列為人體第5大生命體征。其機制可以概括為外周機制和中樞機制。按照藥物作用機制不同，鎮(zhèn)痛藥主要分為中樞性鎮(zhèn)痛藥和解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，其中中樞性鎮(zhèn)痛藥具有較強的鎮(zhèn)痛作用，阿片類藥物還能消除疼痛引起的不愉快情緒，但容易產生依賴和成癮性，而解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥的鎮(zhèn)痛效果弱于中樞性鎮(zhèn)痛藥，不能消除疼痛引起的不良情緒且有明顯的不良反應。中樞鎮(zhèn)痛藥主要作用于阿片受體，阿片受體廣泛分布于人體，在中樞和外周神經系統(tǒng)均有廣泛分布。阿片受體存在μ、κ、δ、σ 4種亞型，納洛酮為非選擇性阿片受體阻斷劑，β-氟硝胺（β-fluorine nitramine，β-FNA）為選擇性μ阿片受體阻斷劑，納曲多爾為選擇性δ阿片受體拮抗劑，諾比萘哌嗪為選擇性κ阿片受體拮抗劑[3]。

中藥具有良好的鎮(zhèn)痛效果，對人體不良反應小。已有的藥理研究表明包括血竭、野木瓜、葛根、延胡索、羌活等中藥都具有較好鎮(zhèn)痛作用，同時針對疼痛的部位和經絡，中藥都可以辨證論治，比如頸項痛使用葛根，枕后部頭痛用羌活，前額和眉棱疼痛用葛根[4-5]。

天蟾膠囊由夏天無、制川烏、蟾酥、祖師麻、白屈菜、秦白芷、川芎、白芍等10味中藥組成，有行氣活血、溫經止痛的功效，適用于各種類型疼痛，用于治療肺癌、胃癌、肝癌等引起的輕、中度癌性疼痛屬氣滯血瘀證者。現(xiàn)代醫(yī)學已證實，夏天無[6]、制川烏[7]、蟾酥[8]含有鎮(zhèn)痛活性成分，同時也有報道稱蟾酥含有的蟾蜍二烯內酯類物質具有抑制癌細胞生長的作用[9]。動物實驗研究也證實天蟾膠囊具有顯著鎮(zhèn)痛效應，能顯著提高大鼠三叉神經痛閾[10]。同時天蟾膠囊在臨床中也常常被用于治療輕、中度癌性疼痛，II期臨床研究顯示其對中度癌痛鎮(zhèn)痛總有效率83%；其他相關研究也表明其可以緩解神經性疼痛、內臟痛[11-13]。為探究天蟾膠囊外周和中樞鎮(zhèn)痛效應，本研究采用3種不同給藥途徑干預及不同阿片受體拮抗劑對小鼠熱板法和甩尾實驗痛閾值的影響，為天蟾膠囊的鎮(zhèn)痛機制研究提供一定數(shù)據(jù)基礎。

1 材料

1.1 動物與分組

SPF級雄性C57BL/6小鼠均為6～8周齡，體質量22～24 g，購自集萃藥康實驗動物公司。小鼠被飼養(yǎng)在一個溫度和濕度受控制的環(huán)境中，光照/暗循環(huán)12 h，可以獲得食物和水以及標準的實驗室飲食。所有動物實驗均按照中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》進行。所有實驗均經江西中醫(yī)藥高等?？茖W校實驗動物實驗倫理委員會批準（編號202008A022）。

1.2 藥品與儀器

天蟾膠囊購自雷允上藥業(yè)集團有限公司（批號TA27007，0.5 g/粒），鹽酸納洛酮注射液購自康哲（湖南）制藥有限公司（批號031020，1 mg/mL），β-FNA（不可逆的選擇性μ阿片受體拮抗劑，批號0926，CAS號72786-10-8），鹽酸納曲多爾（一種選擇性的δ阿片受體拮抗劑，批號4335，CAS號209808-47-9）和諾比萘哌嗪鹽酸鹽（選擇性κ拮抗劑，批號5519，CAS號7488-49-5）均購自Tocris Bioscience公司。YLS-12A型熱刺激儀購自北京眾實科技有限公司，YLS-3E型機械痛閾檢測設備購自北京眾實科技有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組

在動物分組前，首先采用甩尾和熱板的方法剔除基礎痛閾差異較大的小鼠。符合本實驗要求的小鼠隨機分為對照組、天蟾組（TC）、天蟾納洛酮腹腔組（TCNLTFQ）、天蟾納洛酮脊髓組（TCNLTJS）、天蟾納洛酮腦室組（TCNLTNS）、天蟾β-FNA組（TCBFN）、天蟾納曲多爾組（TCNQD）和天蟾諾比萘哌嗪組（TCNBN），各種不同給藥途徑均設立生理鹽水對照組，每組小鼠8只。

2.2 天蟾膠囊ig給藥

TC、TCNLTFQ、TCNLTJS、TCNLTNS、TCBFN、TCNQD和TCNBN組小鼠ig給予天蟾膠囊生藥量42.60 g/kg[9]（用超純水配制成1.065 g/mL的混懸液），每只小鼠每次ig 0.8 mL，連續(xù)給藥1周。

2.3 不同阻斷劑注射給藥

2.3.1 納洛酮注射給藥 天蟾膠囊給藥結束后，將納洛酮溶解于無菌0.9% NaCl，TCNLTFQ、TCNLTJS、TCNLTNS組小鼠分別以1 mg/kg的劑量ip 50 μL、100 ng/kg的劑量注入脊髓腔5 μL和20 ng/kg的劑量注射入腦室1 μL[12]，生理鹽水對照組與上述相似的方式注射相同體積的生理鹽水。

2.3.2 β-FNA、鹽酸納曲多爾和諾比萘哌嗪鹽酸鹽注射給藥 同樣天蟾膠囊結束給藥后，TCBFN、TCNQD和TCNBN組小鼠分別ip β-FNA（40 mg/kg）、鹽酸納曲多爾（0.5 mg/kg）和諾比萘哌嗪鹽酸（10 mg/kg）50 μL，生理鹽水對照組注射相同體積的生理鹽水。

2.4 鎮(zhèn)痛行為學檢測

2.4.1 甩尾試驗 使用熱刺激儀對1只輕度束縛小鼠的尾巴施加有害輻射熱。從保溫溫度到截止溫度，熱量呈線性增加。將熱刺激儀產生的熱刺激強度設為30 W，并記錄尾回縮的潛伏期。為避免組織損傷，若10 s內沒有出現(xiàn)甩尾反應，實驗將自動終止。

給藥前記錄小鼠痛閾基線，分別在給予阻斷劑后30、60、90、120、150和180 min檢測小鼠給藥后痛閾，計算最大可能效能（maximal possible effect，MPE）。

MPE＝(給藥后痛閾－痛閾基線)/(10－痛閾基線)

2.4.2 機械痛閾檢測 機械性觸誘發(fā)痛測試時，小鼠放置在金屬網格架上方的塑料盒中適應30 min后開始檢測[11-12]。用系列Von-Frey細絲（0.02～2.56 g）刺激小鼠足底，垂直刺激5次，每次2～3 s。如果有3次以上的抬爪或舔爪反應，即為陽性反射。每隔30 min檢測1次，檢測6次。最終用機械縮足閾值表示，其數(shù)值根據(jù)序貫法的up-down計算方法得出，機械縮足閾值越低說明機械性觸誘發(fā)疼痛越嚴重。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用GraphPad Prism v.7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以表示。動物行為數(shù)據(jù)采用單因素或雙因素方差分析，隨后采用Bonferroni事后校正、Newman-Keuls多重比較檢驗或雙尾、配對或非配對的Student檢驗。

3 結果

3.1 天蟾膠囊的鎮(zhèn)痛作用

天蟾膠囊給藥1周后，間隔30 min檢測6次熱激光輻射誘發(fā)的痛閾，與對照組小鼠相比，天蟾膠囊均能明顯升高MPE，具有顯著性差異（＜0.05、0.01、0.001），結果如圖1所示。

3.2 ip阿片受體阻斷劑納洛酮對天蟾膠囊鎮(zhèn)痛作用的影響

天蟾膠囊給藥1周后，ip給予納洛酮，間隔30 min檢測6次熱激光輻射誘發(fā)的痛閾，與生理鹽水對照組小鼠相比，MPE均明顯降低，幾乎與圖1的對照組接近，表明外周的阿片受體在天蟾膠囊鎮(zhèn)痛中發(fā)揮了較為重要的作用（＜0.05、0.01），如圖2所示。

BL-基線（下圖同）；與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

與生理鹽水對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.3 脊髓腔注射阿片受體阻斷劑納洛酮對天蟾膠囊鎮(zhèn)痛作用的影響

天蟾膠囊給藥1周后，脊髓腔注射給予納洛酮后，間隔30 min檢測6次熱激光輻射誘發(fā)的痛閾，與脊髓注射生理鹽水對照組小鼠相比，30、60、90 min MPE明顯降低，差異具有統(tǒng)計學差異（＜0.05）；120、150、180 min MPE有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義，如圖3所示。

3.4 腦室注射阿片受體阻斷劑納洛酮對天蟾膠囊鎮(zhèn)痛作用的影響

天蟾膠囊給藥1周后，腦室注射給予納洛酮，間隔30 min檢測6次熱激光輻射誘發(fā)的痛閾，與腦室注射生理鹽水對照組小鼠相比，30、60、180 min MPE明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.05），90、120、150 min MPE有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義，如圖4所示。

與生理鹽水對照組比較：*P＜0.05

與生理鹽水對照組比較：*P＜0.05

3.5 ip不同類型阿片受體阻斷劑對天蟾膠囊致小鼠熱刺激甩尾痛閾的影響

天蟾膠囊給藥1周后，分別ip μ阿片受體拮抗劑β-FNA（TCBFN）、δ阿片受體拮抗劑鹽酸納曲多爾（TCNQD）和κ阿片受體拮抗劑諾比萘哌嗪鹽酸鹽（TCNBN），間隔30 min檢測6次熱激光輻射誘發(fā)的痛閾與生理鹽水對照組小鼠相比，注射β-FNA的小鼠30、60 min的痛閾被阻斷最為顯著，注射鹽酸納曲多爾和諾比萘哌嗪鹽酸鹽的小鼠也有顯著差異，且各時間點均有統(tǒng)計學差異（＜0.05、0.01）；與TCNBN相比，注射β-FNA 30、60 min痛閾有統(tǒng)計學差異（＜0.05），如圖5所示。

3.6 ip不同類型阿片受體阻斷劑對天蟾膠囊致小鼠機械痛閾的影響

天蟾膠囊給藥1周后，也分別檢測了上述阻斷劑對小鼠機械痛閾的影響。結果顯示TCBFN組小鼠的機械痛閾均被阻斷劑β-FNA嚴重干擾（＜0.05），其他各阻斷劑對小鼠機械痛閾也具有一定干擾作用，但并無統(tǒng)計學差異，如圖6所示。

與生理鹽水對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與TCNBN組比較：*P＜0.05

圖6 ip不同類型阿片受體阻斷劑對天蟾膠囊致小鼠機械痛閾的影響(n＝8)

4 討論

疼痛是臨床常見癥狀，臨床中急慢性疼痛按照發(fā)病原因可分為急性炎癥引起的疼痛、慢性炎癥引起的疼痛、神經病理性疼痛和癌痛等。同時，疼痛按照發(fā)病部位可分為內臟痛、肌肉痛和肢體關節(jié)痛。各類疼痛發(fā)病率高，復發(fā)性強，臨床有藥物療法和非藥物療法等治療措施。藥物治療中分為非甾體類藥物、水楊酸類藥物、苯胺類藥物等，該類藥物對輕重度疼痛有效，且長期應用會有胃腸道反應和其他毒副作用；臨床中應用最廣的為阿片類鎮(zhèn)痛藥物，如嗎啡、哌替啶、芬太尼、阿芬太尼、美沙酮、噴他左辛、羥氫可待酮等，該類藥物鎮(zhèn)痛作用較強，但長期應用可引起藥物成癮、耐受、呼吸抑制、皮膚搔癢和便秘等并發(fā)癥。因此，疼痛雖然為臨床最常見的癥狀，臨床治療中卻尚無可長期應用的藥物。

中醫(yī)藥對疼痛的干預是源遠流長，也是中醫(yī)藥的一大治療優(yōu)勢和特色。本研究旨在明確天蟾膠囊的鎮(zhèn)痛作用以及可能的作用靶標。天蟾膠囊由夏天無、制川烏、蟾酥、祖師麻、白屈菜、秦艽、白芷、川芎、白芍、甘草組成，具有行氣活血和通絡止痛的功效。已有研究表明夏天無[14]、川烏[15]、白屈菜[16]、白芷[17]具有阿片藥物樣作用，本研究進一步觀察其可能的作用靶標。因為本研究重點是明確天蟾膠囊的中樞鎮(zhèn)痛效應，因此未建立急慢性炎癥、神經病理性疼痛和癌痛等模型，直接觀察了生理狀態(tài)下其鎮(zhèn)痛效應對阿片系統(tǒng)的依賴作用。首先觀察了給予天蟾膠囊后對小鼠痛閾的影響，結果顯示天蟾膠囊對小鼠生理狀態(tài)下的痛閾具有明顯提升作用，在此基礎上，本研究采用阿片受體阻斷劑通過ip、脊髓腔注射、腦室注射3種給藥途徑干預其鎮(zhèn)痛效應，結果顯示天蟾膠囊的鎮(zhèn)痛效應對阿片系統(tǒng)的依賴主要體現(xiàn)在外周系統(tǒng)，而對中樞阿片系統(tǒng)，如脊髓和腦部也具有依賴性，但對外周的阿片系統(tǒng)依賴程度最強。

為了進一步闡明阿片系統(tǒng)中μ阿片受體、κ阿片受體和δ阿片受體在天蟾膠囊外周鎮(zhèn)痛效應中的作用，又分別使用其特異性阻斷劑干預天蟾膠囊的鎮(zhèn)痛，結果發(fā)現(xiàn)其對μ阿片受體的依賴程度最高，這一結果與目前臨床常用的中樞類鎮(zhèn)痛藥物作用類似。

綜上，天蟾膠囊主要體現(xiàn)在外周鎮(zhèn)痛，且對μ阿片受體依賴性高。該研究雖然闡明了阿片類受體在天蟾膠囊鎮(zhèn)痛中的作用，但先前根據(jù)其藥物組成及臨床研究，在臨床應用中，天蟾膠囊更適用于癌痛的治療，其可能在發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應的同時，具有一定程度腫瘤抑制作用，但是對哪一種類型的腫瘤具有這樣的效應需要進一步深入研究，具體相關的分子機制也需要進一步后續(xù)研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Experimental study on difference between peripheral and central analgesic effects of Tianchan Capsule

FU Bin, FAN Shu, WAN Jun

Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 344000, China

To investigate the difference of analgesic effect between peripheral and central system of Tianchan Capsule (天蟾膠囊).First, 64 male C57BL/6 mice without significant basal pain threshold difference by tail flapping method were randomly divided into control group, Tianchan group, Tianchan naloxone intraperitoneal group, Tianchan naloxone spinal cord group, Tianchan naloxone ventricle group, Tianchan β-fluorine nitramine (β-FNA) group, Tianchan nattrel group and Tianchan norbinazine group. Except the control group, the other groups were administered Tianchan Capsule dose of 42.60 g/kg by gavage for one week. After the one week administration of Tianchan Capsule, each group was given blockers by different administration routes, and the changes of pain threshold were observed 30, 60, 90, 120, 150 and 180 min later.After administration of Tianchan Capsule, the pain threshold of mice was increased. The onset time of analgesia was 30 minutes after administration (< 0.001) and the peak time was 120 min after administration (< 0.05). At 30 and 60 min after intraperitoneal administration, the pain threshold of mice in Tianchan naloxone intraperitoneal group was significantly higher than that in Tianchan naloxone spinal cord group and Tianchan naloxone ventricle group (< 0.05). The pain threshold of mice treated with μ opioid receptor antagonist at 30 and 60 min was significantly higher than that of mice injected with δ and κ opioid receptor antagonist (< 0.05).The analgesic effect of Tianchan Capsule in peripheral opioid system is better than that of central opioid system. It mainly targets μ opioid receptor.

Tianchan Capsules; analgesia effects; μ opioid receptor antagonist; central nervous system; peripheral nervous system

R285

A

0253 - 2670(2022)03 - 0783 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.018

2021-09-10

傅 斌（1983—），男，碩士研究生，中西醫(yī)結合主治醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結合內科臨床與理論研究。Tel: 18079455150 E-mail: fancy3395@126.com

[責任編輯 潘明佳]