基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討荔枝核“異病同治”胃癌和肝癌的作用機(jī)制▲

尹碩鑫 盧 鑫 王舒萍 李安過(guò) 邱薛竹 李升馳 黃鴻翔 張 濤 陳遠(yuǎn)能

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧市 530000；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西南寧市 530011)

胃癌的致病因素復(fù)雜，環(huán)境和遺傳因素都可能對(duì)其發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[1]。盡管在過(guò)去的幾十年里，胃癌的新發(fā)和死亡病例數(shù)均較前減少，但它仍是全球范圍內(nèi)第5大常見(jiàn)癌癥和第4大常見(jiàn)癌癥死亡原因[1]。近年來(lái)，肝癌的病死率超過(guò)胃癌，已成為全球范圍第3大癌癥死亡原因[2]。肝癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素主要有病毒性肝炎、酒精性肝病、代謝性肝病和長(zhǎng)期接觸毒素[3]。雖然我國(guó)對(duì)乙肝和丙肝的防控已經(jīng)使部分地區(qū)的肝癌發(fā)病率明顯降低，但由于人口基數(shù)大，每年新確診的肝癌患者數(shù)量仍居高不下[4]。胃癌和肝癌早期缺乏特異性癥狀，因此多數(shù)患者確診時(shí)常已處于癌癥中晚期，常規(guī)西醫(yī)治療效果欠佳。中醫(yī)藥在癌癥的防治中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其能提高西藥的療效，且藥物副作用小，可改善患者生活質(zhì)量[5-6]。此外，中醫(yī)藥還能延緩癌癥進(jìn)展的速度、緩解患者的臨床癥狀，從而提高患者5年生存率，如今在胃癌和肝癌治療中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[7]。

中醫(yī)理論認(rèn)為胃癌的形成是在素體脾胃虛寒的基礎(chǔ)上，飲食生冷，感受濕熱寒邪，日久郁積引起的氣血運(yùn)行不暢[8]，最常見(jiàn)的證型為脾氣虛證、肝胃不和證、痰濕證、熱毒證、血虛證、血瘀證等[9]。胃癌的治療原則一般以益氣健脾、活血化瘀、清熱解毒為主[10]。肝癌的病機(jī)以正氣不足、痰瘀毒等邪氣內(nèi)盛為主，治療以扶正祛邪為法[11]。荔枝核為無(wú)患子科、亞熱帶常綠喬木荔枝的干燥成熟種子，性溫，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛的作用[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荔枝核提取物的化學(xué)成分可通過(guò)影響細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫靶向，以及提高化療和放療敏感性等，從而發(fā)揮抗癌作用[13]。基于中醫(yī)理論的辨證論治，胃癌和肝癌的證型均以痰、瘀、毒為主，治療方案以活血化瘀、化痰散結(jié)、解毒等為主，而荔枝核恰可用于行氣散結(jié)。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究荔枝核異病同治胃癌和肝癌的可能性，為荔枝核的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 荔枝核有效化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“荔枝核”為關(guān)鍵詞，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug likeness,DL)≥0.18，檢索荔枝核的有效化學(xué)成分。再利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)檢索有效化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。最后在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中，將限定物種設(shè)置為人類(lèi)，將所有靶點(diǎn)名稱(chēng)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點(diǎn)獲取 以“gastric cancer”和“l(fā)iver cancer” 為關(guān)鍵詞，在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和OMIM?數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)中檢索胃癌和肝癌相關(guān)靶點(diǎn)，然后設(shè)置“Relevancescore≥15”進(jìn)行篩選；將最終篩選得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入 Excel 表格中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，包括刪除重復(fù)靶點(diǎn)等。使用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)將荔枝核有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)與胃癌和肝癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集，即為荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點(diǎn)，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將共同靶點(diǎn)名稱(chēng)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和“中藥-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的荔枝核有效化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入 CytoScape 3.7.2軟件構(gòu)建荔枝核“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。再將共同靶點(diǎn)信息導(dǎo)入CytoScape 3.7.2 軟件繪制荔枝核治療胃癌和肝癌的“中藥-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)(https://string-db.org/，version 11.0)，限定物種設(shè)置為人類(lèi)，并設(shè)置互相作用平分相關(guān)度≥0.40，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，不另外擴(kuò)充互動(dòng)靶點(diǎn)，利用CytoScape 3.7.2軟件制作蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。在CytoScape 3.7.2軟件中點(diǎn)擊CytoHubba并選擇degree(即度值)，篩選排名前20的核心靶點(diǎn)，并采用相同的方法重新構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 共同靶點(diǎn)的功能富集和通路富集分析 將共同靶點(diǎn)上傳至 Metascape平臺(tái)(http://metascape.org/)，限定物種設(shè)置為人類(lèi)，進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。設(shè)定P<0.01為篩選條件，再根據(jù)-LgP值對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行由大到小排序，選取排名前10的條目，再利用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 荔枝核的有效化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn) 共獲得荔枝核有效化學(xué)成分8個(gè)(見(jiàn)表1)，以及有效化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)179個(gè)。通過(guò)CytoScape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由188個(gè)節(jié)點(diǎn)、222條邊組成，見(jiàn)圖1。

表1 荔枝核有效化學(xué)成分的基本信息

圖1 “中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.2 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點(diǎn) 分別得到胃癌和肝癌相關(guān)靶點(diǎn)1 177個(gè)、1 281個(gè)；將兩者與荔枝核有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)取交集，得到共同靶點(diǎn)61個(gè)，即為荔枝核治療肝癌和胃癌的共同靶點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。通過(guò) CytoScape 3.7.2 軟件繪制“中藥-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。

圖2 荔枝核有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)與胃癌和肝癌相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖

圖3 “中藥-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.3 共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)由58個(gè)節(jié)點(diǎn)、699條邊組成，節(jié)點(diǎn)平均度值為23.3，節(jié)點(diǎn)平均介數(shù)中心性為0.696，見(jiàn)圖4。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值篩選出核心靶點(diǎn)20個(gè)，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由20個(gè)節(jié)點(diǎn)、103條邊組成，核心靶點(diǎn)包括 MYC原癌基因(MYC proto-oncogene,MYC)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、細(xì)胞周期蛋白1(cyclin D1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Caspase-3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)A、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)1A、Erb-B2受體酪氨酸激酶(Erb-B2 receptor tyrosine kinase,ERBB)2、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1、Fos原癌基因(Fos proto-oncogene,FOS)、孕酮受體(progesterone receptor，PGR)、Caspase-8、過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARG)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、MAPK8、B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子核因子抑制因子(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha，NFKBIA)、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)多癥病毒癌基因同源物A(reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA)、Caspase-9，見(jiàn)圖5。

圖4 荔枝核治療胃癌和肝癌的共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 荔枝核治療胃癌和肝癌的核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能富集分析結(jié)果 61個(gè)共同靶點(diǎn)共涉及3 588個(gè)生物過(guò)程，442個(gè)分子功能，以及281個(gè)細(xì)胞組分，各選取-LgP值排名前10的條目進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)表2。涉及的生物過(guò)程主要有凋亡信號(hào)通路、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞死亡正調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖等；涉及的細(xì)胞組分主要有膜筏、囊泡腔、受體復(fù)合物等；涉及的分子功能主要有激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性等。見(jiàn)圖6。

圖6 GO功能富集分析柱狀圖

表2 GO功能富集分析結(jié)果

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果 61個(gè)共同靶點(diǎn)共富集 333 條信號(hào)通路(均P<0.01)，根據(jù)-LgP值大小篩選排名前10的主要通路，見(jiàn)表3及圖7。

表3 KEGG通路富集分析結(jié)果

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討 論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)荔枝核異病同治胃癌和肝癌的有效化學(xué)成分及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，篩選出荔枝核有效化學(xué)成分8個(gè)，包括表兒茶素、槲皮素、豆甾醇、甘露醇、β-谷甾醇、谷甾醇、油酸乙酯、油酸丁酯。其中槲皮素是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明槲皮素可通過(guò)介導(dǎo)多個(gè)信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、改變細(xì)胞周期、影響自噬等，具有抗腫瘤作用，涉及的信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、Wnt/β-catenin、MAPK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2等[14-15]。此外，其余幾種有效化學(xué)成分也被證明具有預(yù)防癌癥的作用[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，荔枝核治療胃癌、肝癌的共同靶點(diǎn)有61個(gè)，進(jìn)一步篩選獲得核心靶點(diǎn)20個(gè)，即MYC、ESR1、cyclin D1、EGFR、Caspase-3、VEGFA、HIF1A、ERBB2、IL-6、PTGS2、MAPK1、FOS、PGR、Caspase-8、PPARG、AR、MAPK8、NFKBIA、RELA、Caspase-9。研究顯示，ESR陽(yáng)性的胃癌患者，其3年生存率高于ESR陰性患者，提示ESR可能抑制胃癌的侵襲[18]。MYC可通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵細(xì)胞的基因功能，如DNA代謝動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞周期、凋亡、黏附、存活，以及蛋白質(zhì)和大分子合成，在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[19]。MYC的活化可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，上調(diào)MYC能夠促進(jìn)胃癌患者的局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[20]。EGFR屬于酪氨酸激酶受體ERBB家族成員，EGFR信號(hào)級(jí)聯(lián)是細(xì)胞增殖、分化、分裂、存活和癌癥發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因素[21]。有研究表明,EGFR通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子5、Ras-Raf-MEK信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)胃癌惡化[22]。細(xì)胞周期蛋白是同源細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶的變構(gòu)激活劑，它們的水平通常在細(xì)胞周期中呈波動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)cyclin D1過(guò)表達(dá)時(shí)細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶活性失調(diào)，導(dǎo)致在有絲分裂信號(hào)受限的條件下細(xì)胞快速生長(zhǎng)，繞過(guò)關(guān)鍵的細(xì)胞檢查點(diǎn)，最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)[23]。研究表明，沉默cyclin D1可抑制肝癌細(xì)胞的分化并且能夠改善肝癌對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性[24]。研究表明，Caspase-3的失調(diào)可介導(dǎo)胃癌和肝癌的發(fā)生和發(fā)展[25-26]。這些研究均提示ESR1、MYC、EGFR、Cyclin D1等靶點(diǎn)與胃癌和肝癌關(guān)系密切，而荔枝核可能是通過(guò)作用于這些靶點(diǎn)起到治療胃癌和肝癌的作用。

本研究GO功能富集分析結(jié)果顯示，荔枝核治療胃癌和肝癌涉及的生物過(guò)程主要有凋亡信號(hào)通路、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞死亡正調(diào)控、上皮細(xì)胞增殖等；涉及的細(xì)胞組分主要有膜筏、囊泡腔、受體復(fù)合物等；涉及的分子功能主要有激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性等。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序，受到基因的精細(xì)調(diào)控[27]。細(xì)胞凋亡異常被認(rèn)為是癌癥的特征之一[28]。細(xì)胞凋亡異常不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，而且與腫瘤的耐藥性有關(guān)[29]。膜筏是細(xì)胞膜的分子結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞膜屏障功能和流動(dòng)性方面起著重要作用。膜筏可通過(guò)控制癌細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，調(diào)控多種生物過(guò)程，如生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲或轉(zhuǎn)移[30]。細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細(xì)胞主動(dòng)釋放的納米囊泡，其在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮介導(dǎo)細(xì)胞間信息交流的作用[31]。研究顯示，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞富集大量EVs，EVs有助于研究腫瘤發(fā)生的潛在機(jī)制和生物分子基礎(chǔ)[32]。本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，荔枝核治療胃癌和肝癌主要涉及的通路有癌癥相關(guān)通路、癌癥中的蛋白聚糖、VEGF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。這些通路可能在荔枝核異病同治胃癌和肝癌中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)失調(diào)可以為腫瘤細(xì)胞提供有利的生存條件，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而蛋白聚糖是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要大分子，也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分，在維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要的生理作用。蛋白聚糖通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞表面受體、黏附分子、酶和糖蛋白直接或間接相互作用，影響細(xì)胞行為和基質(zhì)特性，從而在腫瘤的血管生成、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[33-34]。已有研究表明，蛋白聚糖在胃癌和肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[35-36]。VEGF在病理?xiàng)l件下通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成促進(jìn)腫瘤的生成[37]。研究表明，通過(guò)抑制VEGF通路可起到抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用[38]。另一項(xiàng)研究表明，miR-26b通過(guò)PI3K/AKT和核因子κB/MMP-9/VEGF途徑抑制人肝癌細(xì)胞增殖[39]。此外，還有多項(xiàng)研究證實(shí)了VEGF的失調(diào)在胃癌和肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[40-42]。結(jié)合本研究富集分析結(jié)果，我們推測(cè)荔枝核可能通過(guò)干預(yù)癌癥相關(guān)通路、VEGF信號(hào)通路等途徑發(fā)揮治療胃癌和肝癌的作用。

綜上所述，荔枝核主要通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)通路等生物過(guò)程，作用于膜筏、囊泡腔等細(xì)胞組分，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，以及調(diào)控癌癥相關(guān)通路、VEGF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，最終起到防治胃癌和肝癌的作用。本文以中醫(yī)藥理論為依據(jù)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析荔枝核異病同治胃癌和肝癌的可能機(jī)制，推斷可能成為靶向治療的潛在靶點(diǎn)，這為胃癌和肝癌的臨床診斷和個(gè)體化用藥提供指導(dǎo)，為后期進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)荔枝核配伍治療提供了新思路。