朝鮮淫羊藿中專屬特征性成分朝藿苷A 的含量測(cè)定

牛 野，張 躍，原明月，袁子民

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600）

朝鮮淫羊藿為淫羊藿多基原藥材來源之一，其是小檗科植物朝鮮淫羊藿的干燥葉。由于不同基原淫羊藿所含成分的含量有所不同，2020 年版《中國藥典》中，巫山淫羊藿由于所含朝藿定C 含量較高，已單獨(dú)從淫羊藿藥材基原中單獨(dú)列出，只測(cè)定朝藿定C 含量；淫羊藿藥材其他基原的朝鮮淫羊藿、淫羊藿（心葉）、柔毛淫羊藿與箭葉淫羊藿，均以總黃酮、總黃酮醇苷（朝藿定A、B、C 和淫羊藿苷）為含量測(cè)定指標(biāo)，由于朝鮮淫羊藿中總黃酮醇苷含量低于其他基原品種，故2020 年版《中國藥典》中對(duì)朝鮮淫羊藿總黃酮醇苷含量單獨(dú)制訂了限度標(biāo)準(zhǔn)[1-4]，但由于淫羊藿多基原藥材均含有朝藿定A、B、C 和淫羊藿苷，因此，僅從多成分含量測(cè)定尚不能完全實(shí)現(xiàn)朝鮮淫羊藿的溯源及與其他基原淫羊藿的鑒別區(qū)分。課題組前期在對(duì)不同基原淫羊藿特征圖譜的研究中發(fā)現(xiàn)，朝藿苷A 可作為朝鮮淫羊藿專屬特征性成分，淫羊藿藥材其他基原品種（巫山淫羊藿、淫羊藿、柔毛淫羊藿與箭葉淫羊藿）中均不含有該特征峰。因此，本文對(duì)遼寧省不同產(chǎn)區(qū)的朝鮮淫羊藿中朝藿苷A 的含量進(jìn)行測(cè)定，為其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的專屬性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent-110 0 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DFT-50 型高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；UV-301 0 型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；SG-330 0 HDT 超聲波清洗機(jī)（上海冠特超聲儀器有限公司）；FAA100 4 型精密電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.2 試藥 朝藿苷A 對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定含量＞98%）；遼寧省不同產(chǎn)區(qū)朝鮮淫羊藿藥材于2020 年6 月采收，其他不同基原的淫羊藿為市售，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室尹海波鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔 毛 淫 羊 藿Epimedium pubescensMaxim.、朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai、巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.S.Ying的干燥葉；磷酸、甲醇為色譜純，水為市售純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.1%磷酸溶液-甲醇（45:55）為流動(dòng)相；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；測(cè)定波長為270 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2 供試品的溶液 將不同基原淫羊藿藥材粉碎后過三號(hào)篩，各精密稱取0.2 g，分別置具塞三角瓶中，分別精密加入25 mL 的70%乙醇，稱重，超聲30 min，放冷，稱重補(bǔ)足失重，搖勻，高速離心，取續(xù)濾液[5]，即得不同基原淫羊藿供試品。

2.3 對(duì)照品的溶液 取適量的朝藿苷A 對(duì)照品，溶于甲醇，搖勻，制成濃度為61.7 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2.5、5、10、15、20 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：Y=1 210.8X-24.58，朝藿苷A 在0.061 7～1.234 μg 范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 6）。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別稱取其他基原淫羊藿（淫羊藿、巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿）藥材粉末，按2.3 項(xiàng)下的供試品溶液制備方法，同法制成其他不同基原淫羊藿供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，結(jié)果在朝藿苷相同保留時(shí)間處無相應(yīng)色譜峰，表明朝藿苷A 可作為朝鮮淫羊藿的專屬特征性成分。色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品及各基原淫羊藿供試品HPLC 色譜圖

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 平行稱定6 份0.1 g 已知含量為0.348%的藥材粉末，分別精密加入朝藿苷A 對(duì)照品溶液（濃度為61.7 μg/mL）6.0 mL 和70% 乙醇19.0 mL，按2.3 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果回收率在97.2%～99.8%，RSD為1.0%，符合測(cè)定要求。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取朝鮮淫羊藿粉末，平行配制6 份供試品溶液，測(cè)定朝藿苷A 的含量。結(jié)果平均含量為0.346%，RSD為1.29%，表明重復(fù)性良好。

2.8 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.1 中的色譜條件，分別進(jìn)樣6 次，每次10 μL，測(cè)定朝藿苷A峰面積，計(jì)算該峰面積的RSD為1.15%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別在不同時(shí)間（0，2，4，6，8，10 h）進(jìn)樣10 μL，依法測(cè)定，記錄朝藿苷A 峰面積，RSD為1.93%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.10 樣品含量測(cè)定 取遼寧不同產(chǎn)區(qū)的朝鮮淫羊藿的藥材粉末，按2.2 項(xiàng)下方法制備4 份供試品溶液，依法測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算朝藿苷A 的含量，結(jié)果見表1。

表1 朝藿苷A 含量測(cè)定結(jié)果（n =3） %

3 討論

3.1 特征性成分的確定 朝鮮淫羊藿主要分布于東北三省，吉林和遼寧產(chǎn)量較多，多為野生資源，且不同產(chǎn)地朝鮮淫羊藿藥材參差不齊[6-8]，現(xiàn)有研究對(duì)朝鮮淫羊藿的含量測(cè)定無法滿足其專屬性和特征性的要求。課題前期研究發(fā)現(xiàn)朝鮮淫羊藿含有兩個(gè)專屬特征性成分，能明顯區(qū)分于其他基原淫羊藿（巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、淫羊藿、柔毛淫羊藿），經(jīng)對(duì)其專屬特征性成分分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定與現(xiàn)有文獻(xiàn)比對(duì)確定為朝藿苷A 和朝藿苷B[9-10]，目前對(duì)二者的含量測(cè)定研究尚未見報(bào)道。由于朝藿苷B 含量較低，為了使得該實(shí)驗(yàn)有顯著性的意義，故本文只對(duì)含量較高的朝藿苷A進(jìn)行了含量測(cè)定。

3.2 檢測(cè)波長的確定 在對(duì)朝藿苷A 檢測(cè)波長的篩選中，通過參考文獻(xiàn)后[11]，在200～400 nm 將朝藿苷A的對(duì)照品溶液掃描測(cè)定，結(jié)果其分別在205、270、314、350 nm 波長處均有吸收，但270 nm 波長處有較強(qiáng)吸收，且色譜圖中未其他雜質(zhì)峰的干擾，故選擇270 nm 為檢測(cè)波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本研究中在對(duì)流動(dòng)相篩選曾參考文獻(xiàn)報(bào)道中朝鮮淫羊藿中朝藿甙甲與朝藿甙乙的制備分離時(shí)采用的流動(dòng)相甲醇-水（64:36）的等度洗脫條件[12]，但由于朝藿苷A 和朝藿苷B 為同分異構(gòu)體，極性相近，該流動(dòng)相無法將二者分離，為了使色譜峰達(dá)到較好的分離，本研究經(jīng)過對(duì)流動(dòng)相的篩選，最終采用甲醇-0.1%磷酸溶液（55:45）作為流動(dòng)相。

3.4 含量比較 本文通過HPLC 法測(cè)定朝鮮淫羊藿中朝藿苷A 的含量初步得出結(jié)論，不同產(chǎn)地朝藿苷A 含量有所差異，本溪桓仁含量最高，丹東寬甸的含量最低，為了使得結(jié)果更加具有代表性，對(duì)其含量的測(cè)定研究將在后續(xù)工作中繼續(xù)進(jìn)行。