蒼耳子炮制前后揮發(fā)性成分及水煎液中酚酸性成分分析

康連香，劉陸楠，柴清軍，潘國良，王華德

（1. 漯河市中醫(yī)院，河南 漯河 462000；2. 漯河市藥品檢驗所，河南 漯河 462000；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

蒼耳子是蒼耳帶總苞的果實，在我國具有豐富的物種資源，廣泛分布于我國各地?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載：“葈耳實，味甘，性溫……主風(fēng)頭寒痛，風(fēng)濕周痹……”。蒼耳子歸肺經(jīng)，主治風(fēng)寒頭痛、鼻淵流涕等癥［1］，現(xiàn)代藥理研究證明，蒼耳子具有降血糖、抗菌消炎等作用，對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及凝血功能等均有影響，是鼻通丸、鼻炎康片、鼻炎膠囊等治療鼻炎、鼻竇炎等中藥制劑的重要組成成分［2］。蒼耳子也具有一定的毒性，《本草品匯精要》《南方主要有毒植物》均有記載，其可對肝臟、肺、腦等器官造成損傷，中毒后可引起頭痛、惡心、呼吸抑制、胃腸道反應(yīng)等癥狀，因此入藥前需加工處理［3］。中藥炮制在我國歷史悠久，蒼耳子具有成熟的炮制工藝和翔實的文獻(xiàn)記載，主要有“燒法”“炒法”“蒸法”“搗法”，現(xiàn)代炮制通常以炒制為主［4］。蒼耳子主要含有揮發(fā)油、脂肪油、酚酸、蒼術(shù)苷類、雜環(huán)類、蒽類、酮類和生物堿等成分，其毒性是以蒼術(shù)苷等水溶性苷類成分為主［5］，通過炒制加熱可使其失活而降低毒性，但炮制過程中是否會對蒼耳子有效成分造成影響，且不同地區(qū)的蒼耳子化學(xué)成分也具有一定的差異［6］，炮制后其化學(xué)成分的變化情況目前尚缺乏深入的研究和報道。因此，本研究通過分析本地區(qū)采摘的蒼耳子在炮制前后揮發(fā)性成分及酚酸性成分的含量變化情況，從而探討炮制對蒼耳子有效成分的影響。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器及耗材

美國Agilent 公司7250 GC/Q-TOF 型氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)及配套試劑耗材；美國Agilent 公司1260 Infinity Ⅱ型液相色譜系統(tǒng)及配套試劑耗材；深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司JM-05D-40 型超聲波清洗儀；瑞士梅特勒-托利多XPR 微量分析天平；美國Agilent 公司PAL3 Ⅱ智能儀器及SPME Arrow PDMS/DVB（PDMS/二乙烯基苯）纖維頭。

1.2 主要試劑

綠原酸（CAS：327-97-9，Catalog #C109403）、新綠原酸（CAS：906-33-2，Catalog #N110185）、隱綠原酸（CAS：905-99-7，Catalog #C117944）、洋薊素（1，5-二咖啡?？鼘幩?，CAS：30964-13-7，Catalog#D117948）、異綠原酸A（3，5-二咖啡酰奎寧酸，CAS：2450-53-5，Catalog #I117946）和異綠原酸C（4，5-二咖啡酰奎寧酸，CAS：32451-88-0，Catalog#I111374）等分析標(biāo)準(zhǔn)品均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（CAS：67-56-1，Catalog #1.06007）、乙腈（CAS：75-05-8，Catalog#1.00030）均購于美國Sigma 公司；蒼耳子自行采摘于河南省漯河市臨潁縣，經(jīng)鑒定為菊科植物蒼耳屬植物蒼耳（Xanthium sibiricumPatr.）干燥成熟帶總苞的果實，除去梗、葉等雜質(zhì)。

2 方法

2.1 蒼耳子樣本處理

2.1.1 炮制

稱取生蒼耳子500 g，參照《中華人民共和國藥典》［7］炮制通則中清炒法，將蒼耳子置于炒制容器內(nèi)，用中火（260 ℃）炒至表面黃褐色刺焦色取出（約9 min），放涼備用。

2.1.2 水煎液制備

稱取生蒼耳子500 g 及炮制后蒼耳子，分別加入4 000 mL 純凈水煎煮90 min 后過濾，所得殘渣再加入3 000 mL 純凈水進(jìn)行第二次煎煮60 min，過濾除去殘渣。將2 次所得濾液合并濃縮至500 mL，制成1 g/mL的蒼耳子水煎液。吸取5 mL 水煎液置100 mL 棕色容量瓶中，加入50%甲醇水溶液稀釋至刻度，吸取1 mL溶液置入10 mL 棕色容量瓶內(nèi)，向容量瓶加入50%甲醛水溶液稀釋至刻度。

2.2 萃取

分別稱取1.0 g 炮制前后的蒼耳子，搗碎后置于15 mL 頂空瓶中插入萃取頭，連接智能萃取儀器頂空萃取10 min后取出，用于氣相色譜儀進(jìn)樣。

2.3 色譜

美國Waters 公司規(guī)格為100 mm × 2.1 mm、直徑1.7 μm 的Acquity UPLC BEH C18色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，0～1 min 為3%乙腈、1～2.5 min為3%～5%乙腈、2.5～9 min為5%～15%乙腈、9～9.5 min 為15%～18%乙腈、9.5～16 min為18%乙腈、16～16.5 min 為18%～28%乙腈、16.5～19 min 為28%乙腈、19～21 min 為28%～50%乙腈、21～22 min 為50%乙腈、22～25 min 為3%乙腈；流速為1.0 mL/min，色譜柱溫度為25 ℃；檢測波長為327 nm。

2.4 質(zhì)譜

離子源設(shè)置：EI，230 ℃，70 eV；四極桿溫度設(shè)置：150 ℃；管電壓設(shè)置：1.2 kV；接口溫度設(shè)置：280 ℃；掃描范圍設(shè)置：35～550 m/z。所得質(zhì)譜圖譜與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）發(fā)布的2020 版質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對，分析其化學(xué)成分及含量。

2.5 酚酸性成分測定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱定綠原酸1.32 mg、新綠原酸2.93 mg、隱綠原酸1.26 mg、洋薊素2.33 mg、異綠原酸A 0.91 mg 和異綠原酸C 1.24 mg，分別置10 mL 棕色容量瓶內(nèi)，向容量瓶加入50%甲醛水溶液溶解并稀釋，搖勻并定容至刻度，制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，置入10 mL 棕色容量瓶內(nèi)，向容量瓶加入50%甲醛水溶液稀釋至刻度，配制為標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（溶液Ⅰ）。精密量取溶液Ⅰ2 mL，置入10 mL 棕色容量瓶內(nèi)，向容量瓶加入50%甲醛水溶液稀釋至刻度，最終制成含綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸C 濃度分別為58.6、26.4、25.2、46.6、18.2、24.8 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（溶液Ⅱ）。

2.5.2 精密度試驗

精密吸取10 μL 溶液Ⅱ，以相同色譜條件連續(xù)進(jìn)樣檢測6 次，比較標(biāo)準(zhǔn)品每次進(jìn)樣的色譜圖，計算標(biāo)準(zhǔn)品6 次進(jìn)樣的保留時間及峰面積。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸C 的RSD 分別為1.68%、1.75%、1.25%、1.81%、1.16%、1.49%。

2.5.3 重復(fù)性試驗

精密吸取6 份10 μL 溶液Ⅱ，以相同色譜條件進(jìn)樣，比較每份標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，計算6 份標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間及峰面積。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸C的RSD分別為1.08%、1.12%、1.03%、1.18%、1.06%、1.13%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取10 μL 溶液Ⅱ，以相同色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，比較每個時點標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，計算標(biāo)準(zhǔn)品6 個時點的保留時間及峰面積。綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸C 的RSD 分別為1.13%、1.09%、1.21%、1.18%、1.02%、1.25%。

2.5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取10、4、3 μL 溶液Ⅰ及10、5、2、1 μL溶液Ⅱ，加50%甲醛水溶液至10 μL，以相同色譜條件進(jìn)樣，計算各標(biāo)準(zhǔn)品樣本峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸。綠原酸的回歸方程為：Y = 2 701.359X + 8.262（r=0.999 9）；新綠原酸的回歸方程為：Y = 947.436X +3.376（r=0.999 9）；隱綠原酸的回歸方程為：Y =945.102X + 1.57（r=0.999 9）；洋薊素的回歸方程為：Y = 1 015.751X + 3.78（r=0.999 9）；異綠原酸A 的回歸方程為：Y = 3 226.042X + 7.851（r=0.999 9）；異綠原酸C 的回歸方程為：Y = 1 130.026X + 9.448（r=0.999 9）。

2.5.6 酚酸性成分定量

吸取6 份10 μL 的水煎液稀釋溶液，以相同色譜條件進(jìn)樣，計算各標(biāo)準(zhǔn)品樣本峰面積，根據(jù)“2.5.5”項下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A、異綠原酸C 的濃度，并換算為水煎液原始濃度。使用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 炮制前后蒼耳子揮發(fā)性成分分析

生品蒼耳子34 種質(zhì)譜圖經(jīng)對比分析共得到29 種化合物，炮制后蒼耳子33 種質(zhì)譜圖經(jīng)對比分析共得到26 種化合物。生品蒼耳子的揮發(fā)性成分占比為65.6%，炮制后蒼耳子揮發(fā)性成分占比為76.82%，炮制前后蒼耳子共有21 種共有成分，生品占比前三的分別為十八碳-9，12-二烯酸、2-茨醇和1-十一碳炔，炮制后蒼耳子占比前三的分別為十八碳-9，12-二烯酸、2-茨醇和石竹烯。見表1。

表1 炮制前后蒼耳子揮發(fā)性成分

3.2 炮制前后蒼耳子酚酸性成分分析

炮制后綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸與炮制前比較含量明顯較高（P＜0.05）；洋薊素、異綠原酸A 與炮制前比較含量明顯較低（P＜0.05）。見表2。

表2 炮制前后蒼耳子酚酸性成分含量分析（±s，mg/mL）

表2 炮制前后蒼耳子酚酸性成分含量分析（±s，mg/mL）

成分綠原酸新綠原酸隱綠原酸洋薊素異綠原酸A異綠原酸C炮制前5.148±0.334 1.562±0.236 0.049±0.021 4.635±0.203 2.434±0.306 0.239±0.036炮制后5.634±0.368 1.965±0.252 0.287±0.063 2.916±0.212 2.013±0.321 0.214±0.032 t值2.395 2.859 8.779 2.345 2.325 1.271 P值0.038 0.017＜0.001 0.041 0.042 0.232

4 討論

中藥炮制技術(shù)是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)獨特的制藥手段，對中藥具有重要的意義。中藥炮制有炒法、煅法、蒸煮法及烘法等，炮制過程均需加熱，加熱不僅能夠降低藥物毒性，使中藥的化學(xué)成分發(fā)生變化，還可改變藥物的性味、功能，影響藥物成分在腸道的吸收，引起體內(nèi)轉(zhuǎn)運、作用靶點的改變，影響中藥的療效，因此分析炮制前后中藥化學(xué)成分的變化有利于更深入地研究炮制機制及藥理機制［8-9］。生蒼耳子帶有毒性，入藥前需要對其進(jìn)行炮制以降低毒性。炒制是蒼耳子最常用的炮制方法，炒制的介質(zhì)、溫度及時間均對蒼耳子的成分有一定的影響，徐玉田［10］發(fā)現(xiàn)蒼耳子在260 ℃溫度下炒制9 min 能達(dá)到最佳的減毒增效的效果，溫度過高會使有效成分大幅降低。李蒙等［11］通過小鼠動物實驗發(fā)現(xiàn)炮制后的蒼耳子鎮(zhèn)痛、抗炎作用更顯著。

揮發(fā)油類、脂肪油類等揮發(fā)性成分是蒼耳子中種類最豐富的化學(xué)成分。HS-SPME 具有操作簡便、無需溶劑、無污染、富集效率高等優(yōu)點，特別適合于低含量揮發(fā)性成分的測定，廣泛運用于食品、藥品的揮發(fā)性成分的鑒定與分析研究［12-13］。HS-SPME 的萃取過程是一個非常復(fù)雜的傳質(zhì)過程，受到萃取頭材料、時間、溫度、時間等多種因素的影響。因此本研究為保證良好的萃取質(zhì)量，通過稱取1 g 蒼耳子、PDMS/DVB 萃取纖維頭、120 ℃的萃取溫度等條件控制，保障了質(zhì)譜峰數(shù)目、峰面積分辨良好。分析結(jié)果顯示，生品蒼耳子的揮發(fā)性成分占比為65.6%，炮制后蒼耳子揮發(fā)性成分占比為76.82%。十八碳-9，12-二烯酸（亞油酸）生品8.5%，炮制后為15.35%。亞油酸對人體正常生命活動具有重要作用，作為細(xì)胞膜的重要組成來源，可轉(zhuǎn)化為多種不飽和脂肪酸，并參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與機體炎癥、癌癥等過程有密切關(guān)聯(lián)，可對鼻炎起到一定的緩解作用［14］。2-茨醇（冰片）生品6.89%，炮制后為16.24%。冰片可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)興奮性，具有提神醒腦、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜的功效，還能調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性，能促進(jìn)其他藥物的吸收，與其他藥物聯(lián)用可發(fā)揮抗微生物、抗炎等功效［15］。炮制后含量增多的石竹烯、花柏烯等也具有抑菌活性及抗腫瘤的作用。

蒼耳子水煎液中的酚酸成分主要包含綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、洋薊素、異綠原酸A 等咖啡?？鼘幩犷?，具有良好的抗氧化、抗炎、抗微生物等作用，但其具有不穩(wěn)定，易受熱被分解、轉(zhuǎn)化的特點［16］。胡曉雪等［17］發(fā)現(xiàn)不同的溫度對于酚酸成分含量影響不同，隨著溫度的升高，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量增加，洋薊素、異綠原酸A 等含量降低，而當(dāng)溫度超過260 ℃后，咖啡?？鼘幩犷惥霈F(xiàn)明顯的降低。本研究分析炮制后綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸高于炮制前，洋薊素、異綠原酸A 低于炮制前，與姜海等［18］研究的結(jié)果相近。

綜上所述，適當(dāng)條件的炮制有利于保留蒼耳子揮發(fā)油類、脂肪油類等揮發(fā)性成分及煎煮過程中蒼耳子中咖啡?？鼘幩犷惖确铀岢煞值募宄?，既增強藥效又去除毒性。