大鼠牙囊細(xì)胞成骨分化過程中Notch信號表達(dá)情況*

羅 文，鄺惠芳，王 婧

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，?？?570102；2.海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，海口 571199)

來源于牙體組織的牙源性干細(xì)胞/祖細(xì)胞用于牙周疾病模型中具有良好的可行性和可預(yù)期性[1]。牙囊細(xì)胞(dental follicle cells,DFC)是牙周組織的前體細(xì)胞，其中包括牙槽骨成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和牙周成纖維細(xì)胞[2]。DFC成骨分化的不同階段和相關(guān)基因表達(dá)與眾多信號通路相關(guān)，如Notch、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和WNT通路[3]。Notch通路通過Notch受體與膜結(jié)合型配體，如Jagged-1結(jié)合介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的信息交流。位于細(xì)胞表面的受體Notch和配體(如Jagged-1)結(jié)合后被γ分泌酶分解。胞內(nèi)活化域(NICD)釋放并易位到細(xì)胞核中與RBP-JK結(jié)合，從而調(diào)控細(xì)胞增殖與分化[4]。本研究探討在大鼠DFC成骨分化時Notch信號的表達(dá)情況變化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購自海南醫(yī)學(xué)院藥物安評中心;α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司;青霉素、鏈霉素、抗壞血酸、Ⅰ型膠原酶、Triton、牛血清清蛋白(BSA)、茜素紅、二脒基苯基吲哚(DAPI)均購自美國Sigma公司;小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體購自美國 Thermo公司，小鼠抗大鼠細(xì)胞角蛋白-14(CK-14)單克隆抗體購自英國Abcam公司;山羊抗小鼠異硫氰酸熒光素(FITC)-免疫球蛋白G(IgG)購自武漢博士德公司;Trizol試劑、引物Notch 1和β-actin均購自上海生工公司;M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國Fermentas公司;定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒SYBR Green Ⅰ kit購自瑞士羅氏公司;OLYMPUS IX71O倒置相差熒光顯微鏡與OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡均購自日本HITACHI公司;LightCycler PCR 2.0系統(tǒng)購自瑞士羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠DFC原代培養(yǎng)

取出生后6～7 d的SD大鼠的乳鼠，無菌條件下將下頜骨切除放置于磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)中。體視顯微鏡下用顯微鑷分離下頜第一磨牙的牙胚，機(jī)械分離牙囊組織，放置于含1 %雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，用眼科剪徹底剪碎。37 ℃、放置在60 U/mL Ⅰ型膠原酶中消化60 min。加入4 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(α-MEM+10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+100 mg/mL抗壞血酸)，并將大鼠DFC轉(zhuǎn)移至T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中12 h讓細(xì)胞貼壁。細(xì)胞融合后用0.25%胰酶消化傳代。取第3代大鼠DFC作為實驗細(xì)胞。實驗過程中所有動物實驗操作符合海南醫(yī)學(xué)院倫理及操作要求。

1.2.2大鼠DFC來源的鑒定(Vimentin、CK-14細(xì)胞免疫熒光染色)

1.2.2.1細(xì)胞爬片的制作

取第3代對數(shù)生長期大鼠DFC消化制備成細(xì)胞懸液1×105/mL;,加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中1×105個/孔，制作成爬片。

1.2.2.2細(xì)胞固定

待爬片上的細(xì)胞長至50%～60%，用4%多聚甲醛固定10 min。用1%Triton溶液配制的3%BSA封閉液中封閉作用30 min(37 ℃濕盒中)。

1.2.2.3孵育一抗

用1% BSA溶液按抗體說明書所示比例稀釋抗體，Vimentin(1∶250)、 CK-14(1∶100)，37 ℃濕盒中孵育2 h。

1.2.2.4孵育二抗

用1%BSA溶液按1∶200比例稀釋FITC結(jié)合的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃濕盒中孵育1 h。

1.2.2.5細(xì)胞核染色

每張爬片滴加200 μL的DAPI(1 μg/mL)溶液浸染2 min，雙蒸水洗2次，每次3 min。中性樹膠封片。

1.2.3成骨分化誘導(dǎo)

對照組繼續(xù)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)組加入地塞米松為基礎(chǔ)的成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)21 d，3 d換1次誘導(dǎo)液，鏡下觀察出現(xiàn)不規(guī)則結(jié)節(jié)即可。棄成骨誘導(dǎo)液，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色15 min對分化細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下采圖。

1.2.4qRT-PCR

使用Trizol試劑分別分離對照組和成骨誘導(dǎo)組總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA的量和純度。使用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行cDNA合成。qRT-PCR用SYBR Green Ⅰ kit和LightCycler PCR 2.0系統(tǒng)及LightCycler4.05軟件計算域值循環(huán)數(shù)。引物的設(shè)計和合成由上海生工公司完成，序列見表1。以β-actin為內(nèi)參照，qRT-PCR檢測Notch1基因表達(dá)。反應(yīng)結(jié)束后由軟件分析擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線，按相對定量法自動計算目的基因mRNA拷貝數(shù)。

表1 Notch 1與β-actin引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠DFC的分離、鑒定及成骨分化潛能

大鼠DFC的原代培養(yǎng)3 d左右細(xì)胞從組織塊周圍爬出，見圖1A。DFC大部分呈紡錘狀、長梭形，少部分為多角形，其來源于外胚層間充質(zhì)，具有典型的間充質(zhì)成纖維細(xì)胞形態(tài)，見圖1B。CK-14染色為陰性，見圖1C。Vimentin幾乎表達(dá)于所有大鼠DFC，染色陽性，見圖1D。表明獲取的DFC是間充質(zhì)干細(xì)胞，而無上皮細(xì)胞?；祀s在大鼠DFC原代中的上皮細(xì)胞傳至第3代時大鼠DFC已基本被純化。用含有地塞米松的成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)大鼠DFC 28 d后用茜素紅染色液染色可見許多紅色礦化小結(jié)節(jié)生成，見圖1E。

A：組織塊原代培養(yǎng)DFC；B：第3代DFC；C：CK-14抗體免疫熒光檢測；D：Vimentin抗體免疫熒光檢測；E：第3代DFC成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色。圖1 大鼠DFC的分離、鑒定及成骨分化潛能

2.2 經(jīng)成骨誘導(dǎo)后DFC的Notch 1 信號表達(dá)情況

與對照組比較，成骨誘導(dǎo)28 d后DFC的Notch 1基因表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與對照組比較。圖2 經(jīng)成骨誘導(dǎo)后DFC的Notch 1 信號表達(dá)情況

3 討 論

DFC作為骨組織工程的種子細(xì)胞之一，具有取材方便、多向分化能力強(qiáng)等優(yōu)點，在骨修復(fù)研究中具有良好的應(yīng)用前景[5]。牙囊是包繞于牙齒發(fā)育期成釉器和牙乳頭周圍的疏松結(jié)締組織，來源于外胚層間充質(zhì)，在牙齒萌出和牙周組織形成中具有重要作用。DFC是成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，DFC中有堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白、骨涎蛋白等成骨細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，有牙骨質(zhì)附著蛋白等成牙骨質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)分化可形成牙槽骨和牙骨質(zhì)[6]。DFC與上皮根鞘細(xì)胞和牙髓細(xì)胞混合，可以誘導(dǎo)DFC成骨及成牙骨質(zhì)方向分化，形成骨樣組織和成牙骨質(zhì)組織[7]。本研究成功分離、培養(yǎng)、鑒定了DFC。DFC的鑒定包括細(xì)胞形態(tài)鑒定和細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物檢測。DFC大多為呈梭形的成纖維細(xì)胞樣,呈紡錘狀結(jié)構(gòu)，漩渦狀排列，貼壁生長。DFC來源于外胚間充質(zhì)，可檢測到間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物——Vimentin染色陽性，同時上皮細(xì)胞表面標(biāo)志物——CK-14染色陰性。利用茜素紅染色液對經(jīng)成骨誘導(dǎo)的DFC進(jìn)行染色可見若干紅色礦化小結(jié)節(jié)生成，表明DFC在合適的成骨誘導(dǎo)條件下可以向成骨分化，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]。

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進(jìn)化上高度保守，通過相鄰細(xì)胞之間的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育[9]。相鄰細(xì)胞可以通過Notch受體與配體的結(jié)合傳遞Notch信號。Notch信號是相鄰細(xì)胞之間通訊進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育分化的重要通路[10-11]。Notch 1作為Notch信號通路的主要受體，與其配體——Jagged 1及下游靶基因——Hes 1均為調(diào)控細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號通路因子。在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型中，CIA組大鼠關(guān)節(jié)Notch 1呈強(qiáng)陽性表達(dá)，同時Jagged 1、Hes 1表達(dá)也顯著上升，高于對照組和中藥(傅山風(fēng)濕外治方)控制組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Notch 1/Jagged 1信號通路在誘發(fā)CIA的過程中得到激活，參與了CIA的發(fā)生、發(fā)展。通過藥物控制能顯著降低Notch 1、Jagged 1、Hes 1的表達(dá)，抑制CIA大鼠中Notch 1/Jagged 1信號通路的活化[12]。表明Notch 1與配體Jagged 1結(jié)合后能影響其下游靶基因Hes 1的轉(zhuǎn)錄，Notch 1的表達(dá)水平能影響Notch 1/Jagged 1信號通路的激活或抑制，從而調(diào)控多種炎癥因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素-6、γ干擾素等，發(fā)揮炎癥調(diào)控作用[13]。

Notch 1 是DFC維持未分化狀態(tài)的標(biāo)記物之一，成骨分化過程中Notch信號在DFC中被激活[14]。Notch信號通路被激活不僅影響DFC成骨分化，而且影響B(tài)MP/DLX3信號通路(成骨分化相關(guān)通路)的激活，Notch信號通路可能通過負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)DFC的成骨分化[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch信號通路后可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63成骨分化，聯(lián)合調(diào)控Notch信號通路與分化抑制因子1靶基因的表達(dá)可遏制骨肉瘤異常成骨分化，誘導(dǎo)其向正常成骨分化，促使異常中斷的成骨分化重新發(fā)生[16]，說明Notch信號在骨肉瘤細(xì)胞MG63成骨分化中具有重要作用。有研究將人牙周膜干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后發(fā)現(xiàn)，整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)過表達(dá)組礦化結(jié)節(jié)形成量、成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、OCN mRNA表達(dá)水平及Notch信號通路相關(guān)基因——Notch1、NICD、Hes mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明過表達(dá)ADAM10可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞增殖并抑制其成骨分化，其機(jī)制可能與Notch信號通路的激活有關(guān)[17]。在骨質(zhì)疏松癥大鼠動物模型中，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后骨質(zhì)疏松癥脂肪干細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、Runx2、Notch1表達(dá)水平均比正常脂肪干細(xì)胞低，說明骨質(zhì)疏松癥脂肪干細(xì)胞成骨能力比正常脂肪干細(xì)胞弱，且Notch信號通路受到抑制[18]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，DFC經(jīng)28 d成骨誘導(dǎo)后Notch 1基因表達(dá)下降，表明在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下Notch信號通過下調(diào)影響DFC向成骨方向分化，與相關(guān)研究結(jié)果一致。然而Notch信號通路的各級信號因子如何相互作用精確調(diào)控DFC的成骨分化仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，DFC表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物和Notch信號，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。在成骨分化過程中Notch信號表達(dá)量下調(diào)，通過負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)DFC的成骨分化。