敲除KDM4B通過減少上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移與侵襲

杜恒，余潔，簡輝，張紅英，吳安定

【提要】目的 構(gòu)建KDM4B敲除的人結(jié)腸癌HCT116和SW260細(xì)胞，研究KDM4B對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響并探討其機(jī)制。方法 利用免疫組化染色，檢測臨床組織樣本KDM4B的表達(dá)量；利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過慢病毒侵染HCT116與SW260細(xì)胞，構(gòu)建 KDM4B敲除細(xì)胞系；利用細(xì)胞劃痕實驗及transwell小室實驗評價KDM4B敲除細(xì)胞與野生型細(xì)胞遷移及侵襲能力的差異；利用Western blotting檢測EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化表明結(jié)腸癌組織中KDM4B顯著高表達(dá)；通過Western blotting成功驗證了KDM4B敲除結(jié)腸癌細(xì)胞系； 敲除KDM4B顯著抑制HCT116及SW260細(xì)胞的遷移與侵襲； 敲除KDM4B顯著上調(diào)HCT116及SW260細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，顯著下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。結(jié)論 KDM4B能夠通過介導(dǎo)EMT促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW260的遷移與侵襲，將其敲除可以顯著減弱這種作用。

癌癥是威脅人類健康的重要疾病之一，其發(fā)生與發(fā)展與腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因的異常表達(dá)有十分密切的關(guān)系[1]。組蛋白的甲基化與去甲基化是表觀遺傳調(diào)控的主要調(diào)節(jié)形式之一，并在基因功能的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，組蛋白甲基化狀態(tài)的失衡已被證實與癌癥存在極為密切的關(guān)聯(lián)[2-3]。組蛋白賴氨酸去甲基化酶4B(KDM4B)是調(diào)節(jié)組蛋白甲基化狀態(tài)的一種關(guān)鍵酶，已有研究證實其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并對腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用[4-7]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移與侵襲的重要環(huán)節(jié)，其與組蛋白甲基化狀態(tài)的失衡具有一定的關(guān)系[8-9]。我國是結(jié)腸癌的高發(fā)國家之一，近年來新發(fā)病例有上升趨勢[10]。因此，本文通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對結(jié)腸癌細(xì)胞中的KDM4B進(jìn)行敲除，研究其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移侵襲之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

臨床組織樣本由黃岡市中心醫(yī)院提供；人胚胎腎HEK293T、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；免疫組化DAB試劑盒購自Dako Danmark A/S 公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司；LB培養(yǎng)基購自Merck公司；T4 PNK、T4 ligase購自碧云天生物技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)購于金沙生物科技有限公司；LentiCRISPR v2、pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒購自Addgene公司；PEI、puromycin、polybrene、ampicillin購自Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司；JMJD2B、E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin、β-actin抗體購自CST公司；HRP偶聯(lián)二抗購自SouthernBiotech公司；Transwell小室購于Corning公司。

1.2 免疫組化染色

取4%多聚甲醛固定的組織樣本，經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，用石蠟進(jìn)行包埋并切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)及一抗孵育，隨后進(jìn)行HRP二抗孵育，加入DAB工作液進(jìn)行顯色，并用蘇木精復(fù)染，在100倍視野下進(jìn)行拍照，結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

1.3 引物設(shè)計與合成

通過Crispick網(wǎng)站設(shè)計人源KDM4B sgRNA引物，其正義序列為CACCGCTTTGTCTCCCCGATCTACG,反義序列為AAACCGTAGATCGGGGAGACAAAGC，由生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成。

1.4 CRISPR基因敲除

將引物磷酸化后與酶切的LentiCRISPR v2載體進(jìn)行連接，然后使用DH5α感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用含0.1% ampicillin的LB平板培養(yǎng)基篩選單克隆菌落，擴(kuò)增單克隆后抽提質(zhì)粒并測序，使用PEI將質(zhì)粒與psPAX2、pMD2.G包裝質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，次日收集病毒液。使用收集得到的病毒液侵染HCT116及SW260細(xì)胞，利用puromycin進(jìn)行篩選，4日后取存活的細(xì)胞進(jìn)行敲除驗證。

1.5 細(xì)胞劃痕實驗

將野生型及KDM4B敲除的HCT116及SW260細(xì)胞按每孔1.0×106個接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁且密度達(dá)到90%時進(jìn)行劃痕并拍照后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別與第24 h及48 h取出并在100倍視野下拍照，使用ImageJ軟件分析劃痕區(qū)域面積。

1.6 Transwell小室侵襲實驗

將matrigel基質(zhì)膠用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋8倍后鋪于transwell小室上層，待凝固后加入含1×104個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，下層加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出小室并擦除上層底部的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后使用0.5%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取5個視野在200倍視野下進(jìn)行拍照計數(shù)。

1.7 蛋白免疫印跡分析

收集細(xì)胞提取總蛋白并煮沸變性，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量，按每孔40 μg蛋白進(jìn)行上樣，使用5%濃縮膠及10%分離膠按100 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，400 mA濕轉(zhuǎn)1 h至PVDF膜， 5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1 h，TBST洗膜后加入對應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗孵育1 h，TBST洗膜后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒，于凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行曝光，使用image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 KDM4B在腫瘤組織中顯著高表達(dá)

使用免疫組化法對3例結(jié)腸癌患者的正常組織及腫瘤組織切片進(jìn)行染色，結(jié)果顯示腫瘤組織的KDM4B表達(dá)量顯著高于正常腸道組織，表明KDM4B在腫瘤組織中顯著高表達(dá)。

2.2 KDM4B基因敲除結(jié)果的驗證

使用Western blotting法從蛋白水平檢測KDM4B基因的翻譯情況，結(jié)果顯示使用CRISPR/Cas9基因敲除后的細(xì)胞不表達(dá)JMJD2B(即KDM4B)蛋白，而野生型及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞JMJD2B蛋白高表達(dá)，提示KDM4B基因被成功敲除。

2.3 敲除KDM4B抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260的遷移

細(xì)胞劃痕實驗顯示，野生型HCT116及SW260細(xì)胞在24 h后，劃痕發(fā)生明顯愈合，48 h后劃痕基本消失，而KDM4B基因敲除的細(xì)胞劃痕愈合緩慢，48 h后仍然存在明顯的劃痕，24 h及48 h的劃痕面積與野生型細(xì)胞存在顯著性差異。說明敲除KDM4B基因后能夠顯著抑制人結(jié)腸癌HCT116及SW260細(xì)胞的遷移。抑制人結(jié)腸癌HCT116及SW260細(xì)胞的遷移。

2.4 敲除KDM4B抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260的侵襲

通過transwell小室侵襲實驗，觀察到敲除KDM4B后，HCT116及SW260細(xì)胞的侵襲數(shù)量顯著低于野生型細(xì)胞，證明了KDM4B基因的敲除能夠顯著抑制人結(jié)腸癌HCT116及SW260細(xì)胞的侵襲。

2.5 敲除KDM4B調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)

利用Western blotting實驗檢測了野生型HCT116及SW260及KDM4B敲除細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與野生型細(xì)胞相比，KDM4B敲除的細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著增高，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)量則顯著降低。

3 討論

組蛋白的甲基化與去甲基化是細(xì)胞表觀基因組學(xué)調(diào)控的一類重要生物過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[11-14]。組蛋白的甲基化長期以來被認(rèn)為是不可逆的，直至組蛋白賴氨酸殘基去甲基化酶家族(KDMs)被發(fā)現(xiàn)，才揭開了新的研究序幕[15]。近年來，KDMs家族成員KDM4B被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中存在高表達(dá)，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與發(fā)展，其作用機(jī)制包括調(diào)控Wnt、Hippo、NF-κB等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝等[16-19]。

圖1 KDM4B在結(jié)腸癌組織中顯著高表達(dá)(100×, *P<0.05)

圖2 KDM4B基因敲除結(jié)果的驗證

圖3 敲除KDM4B抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260的遷移(100×, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

KDM4B高表達(dá)被證實能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲[20]，但是在結(jié)腸癌細(xì)胞中是否具有類似的作用仍不清楚。KDM4B被證實在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)[21]，因此猜測是否結(jié)腸癌的遷移與侵襲是否與KDM4B有關(guān)，敲除KDM4B是否能夠抑制遷移與侵襲。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一項新興技術(shù)，具有強(qiáng)大的基因編輯功能，本文通過使用該技術(shù)成功地在人結(jié)腸癌HCT116及SW260細(xì)胞中敲除了KDM4B基因。通過細(xì)胞劃痕和transwell小室侵襲實驗，我們發(fā)現(xiàn)野生型的結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出了較強(qiáng)的遷移侵襲能力，而將KDM4B敲除后，這種遷移與侵襲能力得到了明顯的抑制，說明結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與侵襲與KDM4B的表達(dá)正相關(guān)。

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)通常發(fā)生在特定的病理條件下，上皮細(xì)胞朝向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化[22-23]。鈣粘蛋白(cadherin)和Vimentin是上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的兩類標(biāo)志物，正常組織中的E-cadherin存在廣泛表達(dá)，而N-cadherin的表達(dá)在除心肌、平滑肌、睪丸等組織中很難檢測到，但在腫瘤細(xì)胞中，E-cadherin的表達(dá)通常降低，而N-cadherin表現(xiàn)為增高，這種現(xiàn)象被稱為“鈣粘蛋白開關(guān)”[24-25]。這種現(xiàn)象在兩種野生型結(jié)腸癌細(xì)胞中得到證實，即E-cadherin低表達(dá)，N-cadherin高表達(dá)。而在KMD4B敲除的兩種結(jié)腸癌細(xì)胞中，這種現(xiàn)象得到了逆轉(zhuǎn)，趨向于正常組織中的表達(dá)形式。說明了KDM4B在介導(dǎo)EMT中存在重要的作用，并且敲除KDM4B可以減少EMT。

圖4 敲除KDM4B抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260的侵襲(200×, *P<0.05，**P<0.01)

圖5 敲除KDM4B調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116及SW260中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

綜上，KDM4B能夠通過介導(dǎo)EMT促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW260的遷移與侵襲，將KDM4B敲除可以顯著減弱這種作用，KDM4B或許可以作為結(jié)腸癌治療的一個新靶點(diǎn)。