泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控非酒精性脂肪性肝病研究進(jìn)展

高星星，劉永剛，劉亞珠，李京濤，曾立偉，閆曙光，魏海梁，常占杰

【提要】 泛素蛋白酶體系統(tǒng)是一種重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，參與多種蛋白質(zhì)相關(guān)通路的調(diào)節(jié)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)與非酒精性脂肪性肝病有著密切的聯(lián)系，其通過(guò)參與脂質(zhì)代謝、線粒體氧化功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激障礙以及相關(guān)通路進(jìn)而在非酒精性脂肪性肝病的病理進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。本文就泛素蛋白酶體調(diào)控非酒精性脂肪性肝病進(jìn)行綜述。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是我國(guó)第一大慢性肝病，最近的meta分析顯示，中國(guó)NAFLD的發(fā)病率達(dá)到了29.2%。NAFLD是一種與胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和遺傳易感因素密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷[1]，其病理進(jìn)展包括脂肪變性、脂肪毒性和炎癥三聯(lián)反應(yīng)的過(guò)程，當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，脂肪變性、氧化應(yīng)激和TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的存在與NAFLD中CAR、PXR、PPAR-α等核因子的改變有關(guān)[2]。全球流行病學(xué)顯示，NAFLD可進(jìn)展為肝硬化(cirrhosis of liver,LC)甚至肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[3]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)與臨床證據(jù)表明，泛素蛋白酶體(ubiquitin-proteasome system，UPS)及其相關(guān)通路與NAFLD密切相關(guān)，而泛素化中間絲體包涵體和Mallory體相關(guān)蛋白可作為評(píng)估NAFLD患者的可靠生物標(biāo)志物[4]，且泛素也是非酒精性肝纖維化的標(biāo)志[5]。本文綜述了泛素化及去泛素化的過(guò)程和功能，并總結(jié)了近年來(lái)UPS調(diào)控NAFLD治療靶點(diǎn)的研究現(xiàn)狀。

1 泛素蛋白酶體

泛素蛋白酶體是一種蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，包括泛素化酶(ubiquitinating enzymes ubs)、26S蛋白酶體(26S proteasome)以及去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，dubs)[6]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)的異常直接或間接地參與了癌癥、炎癥和神經(jīng)退行性疾病等疾病的發(fā)病機(jī)制[7]。

1.1 泛素化

由泛素化酶E1泛素激活酶(ubiquitin-activatingenzyme)、E2 泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugatingenzymes)、E3 泛 素 連 接 酶(ubiquitin-ligaseenzymes)依次激活、結(jié)合并連接泛素C末端的甘氨酸(Gly)殘基共價(jià)結(jié)合到底物蛋白的過(guò)程稱為泛素化。泛素化過(guò)程需要ATP的參與，E1的半胱氨酸(Cys)殘基與泛素C端Gly殘基形成硫酯鍵，從而激活游離泛素分子；被激活的泛素與E2酶活性部位的Cys殘基形成硫酯鍵，并轉(zhuǎn)移到E2酶上；在E3酶的作用下，泛素的Gly殘基和底物蛋白的Lys殘基形成異肽鍵并轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，最終形成泛素化底物。在少數(shù)情況下，靶蛋白的N端也可被泛素化[8]。根據(jù)靶蛋白修飾的作用形式不同，泛素化可分為單泛素化、多泛素化和多聚泛素化[9]。

1.2 去泛素化

蛋白質(zhì)泛素化是動(dòng)態(tài)翻譯后修飾(protein translational modifications,PTMs)最有效的修飾之一[10]。Dubs通過(guò)從底物中去除泛素或在泛素鏈中切割泛素從而去除泛素信號(hào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)泛素化的過(guò)程稱為去泛素化[11]。因此，泛素化是一個(gè)可逆的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，dubs包括7個(gè)家族：泛素特異性蛋白酶(USPs)、JAB1/MPN/Mov34金屬酶(JAMM)、卵巢腫瘤蛋白酶(OTUs)、Josephin and JAB1/MPN+(MJP)、泛素C端水解酶(UCHs)、含miu的新型DUB(MINDY)和含鋅指的泛素肽酶1(ZUP1)[7]。

2 泛素蛋白酶體系統(tǒng)與NAFLD

泛素蛋白酶體在蛋白酶體降解、選擇性自噬以及及細(xì)胞程序性死亡等過(guò)程中均有參與[12]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究證實(shí)UPS通過(guò)參與脂質(zhì)代謝、線粒體氧化功能障礙和胰島素抵抗等方面影響NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

圖1 NAFLD發(fā)病機(jī)制示意圖

2.1 脂質(zhì)代謝

2.1.1 從頭脂肪生成

從頭脂肪生成(de Novo lipogenesis，DNL)是肝臟調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的四種途徑之一，臨床數(shù)據(jù)表明，DNL的調(diào)節(jié)異常是NAFLD患者肝臟脂質(zhì)積累的主要特征。

在肝臟脂質(zhì)代謝中，DNL使肝臟能夠從乙酰輔酶A中合成新的脂肪酸。因此，DNL升高可引起肝脂肪變性，甚至可能導(dǎo)致脂肪性肝炎。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP1c)是協(xié)調(diào)DNL轉(zhuǎn)錄調(diào)控的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，它激活肝臟中幾乎所有與甘油三酯和脂肪酸合成相關(guān)的基因。同時(shí)，SREBP1c控制FASN、ACACA等DNL途徑中關(guān)鍵合成酶的轉(zhuǎn)錄，在NAFLD的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。Fbw7a是SREBP1c的主要E3連接酶，相關(guān)研究表明，Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(smad ubiquitination regulatory factor 1,Smurf1)具有增強(qiáng)SREBP-1c的穩(wěn)定性進(jìn)而激活脂質(zhì)合成的作用。同時(shí)，Smurf1在NAFLD中具有E3連接酶獨(dú)立催化活性的特點(diǎn)。Smurf1通過(guò)與Fbw7a競(jìng)爭(zhēng)性地相互作用于SREBP1c的同一個(gè)區(qū)域，保護(hù)SREBP1c不被泛素化和降解，維持了SREBP1c的穩(wěn)定性。此外，mTORC2還能誘導(dǎo)依賴fbw7a的SREBP-1c降解，并抑制癌細(xì)胞中的脂肪生成，減輕肝癌的進(jìn)展[14]。

泛素特異性肽酶7(ubiquitin specific peptidase 7,USP7)是一種在以前研究中被證明具有抗癌作用的去泛素化酶。最新研究發(fā)現(xiàn)，USP7在DNL中亦具有重要的作用，鋅指蛋白638(zinc finger protein 638,ZNF638)是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。TRAF的結(jié)構(gòu)域通過(guò)介導(dǎo)USP7去泛素化ZNF638中的賴氨酸48連接的多泛素鏈以及穩(wěn)定cAMP反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白(CREB)的轉(zhuǎn)錄活化來(lái)控制肝細(xì)胞中ZNF638的蛋白質(zhì)水平。USP7/ZNF638軸調(diào)節(jié)ACACA、FASN和SCD酶介導(dǎo)的肝臟DNL途徑，USP7/ZNF638軸通過(guò)AKT/mTORC1/S6K信號(hào)傳導(dǎo)選擇性地提高了裂解的SREBP1c在細(xì)胞核中的積累，并形成了USP7/ZNF638/SREBP1C核復(fù)合物來(lái)激活FASN等脂質(zhì)發(fā)生酶促進(jìn)DNL，但不影響SREBP1C全長(zhǎng)蛋白[15]。

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)是DNL途徑的重要參與者。研究發(fā)現(xiàn)，SNX8(sorting nexin 8，SNX8)是FASN介導(dǎo)的NAFLD進(jìn)展的潛在抑制因子，其顯著降低了脂肪酸合成和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。SNX8通過(guò)招募TRIM28(一種E3連接酶)進(jìn)行K48連接多聚泛素化，同時(shí)增強(qiáng)TRIM28與FASN相互作用，誘導(dǎo)FASN蛋白酶體降解[16]。AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)是肝臟代謝穩(wěn)態(tài)的重要能量傳感器，包含有多種異源三聚體復(fù)合物，在NAFLD進(jìn)展中參與調(diào)控肝臟脂肪變性與肝臟炎癥。AMPK的活化可抑制DNL途徑，并且可減少脂肪組織中游離脂肪酸的釋放，從而防止肝脂肪變性。此外，AMPK可以通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的激活防止肝臟炎癥[17]。Makorin無(wú)名指蛋白1(makorin ring finger protein 1,MKRN1)是肝臟和脂肪細(xì)胞組織中AMPK的E3泛素連接酶。最近研究表明，盡管AMPK具有慢性激活和獨(dú)立作用復(fù)雜性的特點(diǎn)，但MKRN1的抑制足以長(zhǎng)期激活肝臟和脂肪組織中的AMPK，進(jìn)而抑制肝臟脂質(zhì)積累和炎癥的發(fā)生[18]。

2.1.2 脂肪酸氧化

脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)亦是肝臟調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的四種途徑之一，其過(guò)程中產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)、氧化應(yīng)激和有毒的二羧酸可能會(huì)促進(jìn)炎癥和疾病進(jìn)展[13]。Nrf2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)解毒和抗氧化酶的表達(dá)。Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是調(diào)節(jié)Nrf2活性的E3泛素連接酶[19]。Nrf2的活性受Keap1的嚴(yán)格調(diào)控，在生理?xiàng)l件下，Nrf2通過(guò)與Keap1的相互作用被蛋白酶體降解形成復(fù)合體。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2從復(fù)合體中解離并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，從而啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)。KEAP1-NRF2-ARE軸是一種重要的毒性途徑，如果其受到干擾，會(huì)產(chǎn)生不良的健康問(wèn)題。[20]嘌呤霉素敏感性氨肽酶 (puromycin-sensitive aminopeptidase, PSA)是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，負(fù)責(zé)催化多肽n端附近氨基酸的裂解，同時(shí)參與脂肪生成和脂肪酸b氧化。有研究發(fā)現(xiàn)，PSA通過(guò)抑制Nrf2的泛素化，進(jìn)而激活Nrf2和下游的抗氧化酶來(lái)減輕氧化應(yīng)激并減輕脂肪變性[21]。

2.2 炎癥反應(yīng)

肝臟中的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了NASH的發(fā)展以及隨后肝纖維化、肝硬化、肝癌的進(jìn)展。在NAFLD中，炎癥的觸發(fā)可能來(lái)自肝臟外(如腸道)或者器官內(nèi)(如細(xì)胞死亡途徑)。隨著炎癥活動(dòng)的持續(xù)，導(dǎo)致肝臟中發(fā)生慢性炎癥變化，使處于亞致死脂肪毒性損傷狀態(tài)的肝細(xì)胞進(jìn)一步損傷，從而加劇肝臟組織損傷，并可能出現(xiàn)異常的傷口愈合反應(yīng)，促進(jìn)NASH和肝纖維化的發(fā)展[22]。

JNK和NF-κB是參與NAFLD慢性炎癥發(fā)展的主要炎癥通路。JNK是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員之一，與細(xì)胞凋亡的激活和NASH的發(fā)展有關(guān)。NF-κB是炎癥激活的主要調(diào)節(jié)因子，其中的IKK2亞基是其在急性炎癥反應(yīng)中激活所需的主要成分[23]。TNF-α誘導(dǎo)蛋白3(TNF alpha induced protein 3,TNFAIP3)是一種泛素編輯酶，其通過(guò)干擾NF-κB信號(hào)蛋白的泛素化以及去泛素化來(lái)抑制NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24]。TNFAIP3相互作用蛋白3(TNFAIP3 interacting protein 3,TNIP3)在NASH進(jìn)展中是TAK1激活的新抑制因子。研究表明，TNIP3通過(guò)其AHD1結(jié)構(gòu)域與TAK1結(jié)合，阻止其被E3連接酶TRIM8泛素化，進(jìn)而抑制了TAK1的激活及其下游的IKKb-NF-ΚB和MKK7-JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，從而減輕NASH的肝損害。同時(shí)，TNIP3的去泛素化完全獨(dú)立于與TNFAIP3相關(guān)的去泛素化。同時(shí)，在NASH環(huán)境下，TNIP3的AHD1結(jié)構(gòu)域決定其與TAK1的相互作用以及其下游的MKK7-JNK和NF-ΚB信號(hào)的激活。因此，TNIP3的AHD1結(jié)構(gòu)域可能是消除代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥和代謝失調(diào)的精確靶點(diǎn)，且不會(huì)損害肝細(xì)胞抵抗宿主內(nèi)入侵病原體的能力[25]。此外，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TNF receptor associated factor 6,TRAF6)在因TGF-β激活TAK1介導(dǎo)的IKK、JNK和p38通路中至關(guān)重要，TAK1上的K158可被TRAF6泛素化[26]，TAK1-K158是受TNIP3表達(dá)影響的特異性泛素化位點(diǎn)。該研究認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)豐富了TNIP3作為炎癥反應(yīng)和代謝失調(diào)反應(yīng)中TAK1激活抑制劑的功能，這在未來(lái)可能作為一種新的替代治療策略來(lái)調(diào)節(jié)NASH過(guò)程中的TAK1過(guò)度激活[25]。

ASK1通路在NAFLD和纖維化的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。ASK1被ROS、TNF-α、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激源激活，進(jìn)而誘導(dǎo)下游p38MAPK和JNK信號(hào)通路的激活，參與調(diào)節(jié)脂滴自噬、細(xì)胞凋亡及炎癥[27]。泛素醛結(jié)合蛋白1(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 1, OTUB1)是細(xì)胞中最豐富的dub之一，它能結(jié)合E2酶并且通過(guò)調(diào)節(jié)E2泛素結(jié)合物使其作為抑制劑參與各種泛素化過(guò)程[10]。OTUB1在機(jī)體內(nèi)調(diào)控多種代謝相關(guān)信號(hào)分子，如MAPK、mTORC1、FOXM1和p53、和AKT等。實(shí)驗(yàn)研究表明，ASK1是OTUB1的關(guān)鍵候選靶點(diǎn)，其既可以直接切割靶蛋白中泛的素鏈，又可以通過(guò)阻斷特定泛素偶聯(lián)酶的功能來(lái)間接抑制泛素化。肝細(xì)胞中的TRAF6通過(guò)促進(jìn)ASK1的賴氨酸6連接的多聚泛素化，加重肝纖維化和炎癥。在NASH的進(jìn)展中，OTUB1通過(guò)直接與TRAF6結(jié)合，抑制其賴氨酸63連接的多聚泛素化，從而抑制ASK1及其下游ASK1- JNK/p38通路的磷酸化，進(jìn)一步抑制下游TRAF6-ASK1信號(hào)級(jí)聯(lián)[28]。

表1 泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控NAFLD機(jī)制

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激障礙

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分泌蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝的主要細(xì)胞器，其對(duì)游離脂肪酸的損傷很敏感，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的積累，從而激活了未折疊蛋白的反應(yīng)，如果未折疊蛋白反應(yīng)失敗，應(yīng)激傳感蛋白如肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)會(huì)觸發(fā)自噬通路，IRE1剪接并激活轉(zhuǎn)錄因子X(jué)BP1，XBP1通過(guò)激活JNK、NF-ΚB信號(hào)通路和產(chǎn)生ROS參與各種炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，UPR主要通過(guò)激活泛素化相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因來(lái)調(diào)控UPS和自噬[29]。

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，UPS在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，一些E3連接酶通過(guò)泛素化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白進(jìn)而間接調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程[8]。HMG-CoA還原酶降解蛋白1(the HMG-CoA reductase degradation protein 1, Hrd1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中的一種E3連接酶，通過(guò)調(diào)節(jié)酵母中限速酶HMGCR的周轉(zhuǎn)來(lái)控制膽固醇的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的一個(gè)重要修飾是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)，Hrd1在ERAD中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡。此前研究表明，Hrd1還被證明催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器IRE1α的泛素偶聯(lián)，以抑制細(xì)胞凋亡和控制腸道干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。Hrd1的調(diào)控功能是通過(guò)泛素化介導(dǎo)的蛋白降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的，Hrd1可通過(guò)多種分子機(jī)制發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用，其介導(dǎo)的ENTPD5泛素化降解可能是肝臟代謝調(diào)控的關(guān)鍵途徑。該研究認(rèn)為，由于Hrd1的組織和器官特異性功能在很大程度上還未得到研究。因此， Hrd1的抑制劑治療NAFLD的可行性尚需進(jìn)一步研究[30]。最新關(guān)于Hrd1的實(shí)驗(yàn)研究表明，Hrd1作為肝臟中檸檬酸裂解酶 (ATP citrate lyase，Acly)和脂質(zhì)合成的新型負(fù)調(diào)控因子，對(duì)NAFLD的改善具有重要的作用。Acly是脂肪再生的關(guān)鍵酶，在依賴葡萄糖的從頭脂肪生成過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其裂解檸檬酸生成乙酰輔酶a，該過(guò)程是線粒體外脂質(zhì)合成的基礎(chǔ)。Hrd1作用于Acly的泛素化并降解Acly，從而降低其蛋白水平，致使乙酰輔酶a水平的降低和肝細(xì)胞脂質(zhì)合成受到抑制，減輕脂肪變性。此外，在胰島素抵抗環(huán)境中，Hrd1通過(guò)介導(dǎo)Acly降解來(lái)抑制脂質(zhì)代謝中新生脂質(zhì)合成和甘油三酯積累，同時(shí)改善胰島素抵抗與脂質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[31]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

泛素蛋白酶體途徑作為細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)水解途徑之一，參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的不同途徑及過(guò)程。不同的泛素化和去泛素化酶作用于不同的靶點(diǎn)及通路，起著不同的調(diào)控作用。NAFLD涉及脂質(zhì)代謝、自噬、氧化應(yīng)激等多個(gè)方面，盡管泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)靶點(diǎn)逐漸被關(guān)注，但由于泛素蛋白酶體系統(tǒng)的多樣性、復(fù)雜性以及NAFLD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)靶點(diǎn)待進(jìn)一步研究，為未來(lái)的NAFLD特效藥物的開(kāi)發(fā)提供思路。